專利名稱：：鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗凝保護(hù)劑，尤其是涉及一種鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：鮑是我國重要的海水養(yǎng)殖種類，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高；但其生長緩慢，要求非常清潔的養(yǎng)殖水體。近年來鮑病害問題越來越嚴(yán)重，尋找有效的方法促進(jìn)鮑健康養(yǎng)殖已成為當(dāng)務(wù)之急。鮑與其他貝類相似，對入侵病原的防御主要通過血細(xì)胞對外來微生物的吞噬作用實現(xiàn)，因此對鮑血細(xì)胞的研究是探索其免疫系統(tǒng)的重要一環(huán)。鮑等貝類血細(xì)胞有一個非常顯著的特點，在不加抗凝劑的情況下，血細(xì)胞一旦離體，幾分鐘內(nèi)即大量凝集。而懸浮在曾報道過的甲殼類和貝類抗凝劑中的鮑血細(xì)胞在l小時內(nèi)大量死亡，這個特點嚴(yán)重阻礙了對其功能的探索。因此開發(fā)可以在相當(dāng)時間內(nèi)防止凝集并保持細(xì)胞活性的鮑血抗凝劑是進(jìn)一步研究鮑直至貝類免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)。目前經(jīng)常應(yīng)用于鮑血細(xì)胞體外操作的抗凝劑為滅菌海水(Sterilizedseawater，SS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(張峰，李光友.幾種重金屬對皺紋盤鮑血細(xì)活性氧產(chǎn)生的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2005，24(1):32-34)。多篇文獻(xiàn)表明SS禾P"PBS并不適合離體鮑血細(xì)胞的懸浮和保持活性，多次試驗也表明在lh之內(nèi)，一半以上的離體鮑血細(xì)胞在SS和PBS中發(fā)生凝集。不少貝類血細(xì)胞的研究者均試圖在哺乳動物血細(xì)胞保存液(Alserver，ssolution)中添加各種成分獲得改良的哺乳動物血細(xì)胞保存液(modifiedAlserver，ssolution,MAS)(Lebel,J.M.,Giard，W.,Favrel,P.andBoucaud-Camou,E.:Effectsofdifferentvertebrategrowthfactorsonprimaryculturesofhemocytesfromthegastropodmollusc,i/a/Zotofw6e/rwtoa.BiolCell86(1996)67-72)。雖然MAS抗凝劑可以短暫保存疣鮑(H^^cw/flto)離體血細(xì)胞(lh)，并應(yīng)用于歐洲牡蠣血細(xì)胞的離體保存(Xue,Q.G.,Renault,T.andChilmonczyk,S.:Flowcytometricassessmentofhaemocytesub-populationsintheEuropeanflatoyster,Qs/reo!edwfc,haemolymph.FishShellfishImmunol11(2001)557-567)，但其對疣鮑和牡蠣血細(xì)胞的抗凝效果沒有明確報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有貝類血細(xì)胞抗凝集和保存技術(shù)上的不足，提供一種在較長時間內(nèi)保持離體鮑血細(xì)胞活性的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是采用一般維持細(xì)胞滲透壓的檸檬酸鹽緩沖液、葡萄糖和氯化鈉溶液基礎(chǔ)上添加羥乙基哌嗪乙硫磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]ethanesulfonicacid，HEPES)這種具有高效緩沖作用的成分(該成分首次應(yīng)用于貝類血細(xì)胞的培養(yǎng))。本發(fā)明所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的原料組成及其按質(zhì)量比的含量為葡萄糖1.952.08，檸檬酸鈉(2H20)0.780.8，檸檬酸0.0630.107，氯化鈉0.370.57，羥乙基哌嗪乙硫磺酸0.210.24,雙蒸水IOO，pH6.06.4。本發(fā)明所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的原料組成及其按質(zhì)量比的含量最好為葡萄糖2.05，檸檬酸鈉(2H20)0.8，檸檬酸0.08，氯化鈉0.42，羥乙基哌嗪乙硫磺酸0.23，雙蒸水100，pH6.1。本發(fā)明所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的制備方法包括以下步驟將葡萄糖、檸檬酸鈉(2H20)、氯化鈉和羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶于雙蒸水中，攪拌溶解，用檸檬酸調(diào)pH至6.06.4，高溫滅菌，得鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑。攪拌的溫度最好為45°C，檸檬酸的濃度最好按質(zhì)量百分比為10%，高溫滅菌的溫度最好為112.6'C，高溫滅菌的時間最好為30min。所制得的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑可在4'C保存，可使用2周。鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑可保證鮑血細(xì)胞在12h內(nèi)維持較高的存活率，若需要鮑血細(xì)胞更長時間的維持活性，可將鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑與細(xì)胞通用培養(yǎng)液RPMI1640以1:8的比例混合，所得的抗凝劑(記為RH)可保證鮑血細(xì)胞存活2d以上。具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下給出本發(fā)明所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑(記為HA)與不同成分的其他海洋無脊椎動物血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑效果比較。表1所示的幾種不同的血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑滅菌海水(Sterilizedseawater，SS)、PBS磷酸鹽緩沖液、血紅胞培養(yǎng)液RPMI1640、DA抗凝劑(DA抗凝劑為中國對蝦的抗凝劑，見參考文獻(xiàn)戰(zhàn)文斌，張利峰，張志棟等，中國對蝦血細(xì)胞單克隆抗體研制及對蝦血細(xì)胞類型的鑒別[J]。高技術(shù)通訊，2001，25(6):19-22)與所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的成分完全不同。DA和MAS成分中均加入乙二胺四乙酸(EDTA)，但未加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸，其它成分相同而含量及pH差異較大。具體配方為氯化鈉0.82g，葡萄糖1.98g，檸檬酸鈉0.88g，檸檬酸0.55g，乙二胺四乙酸0.37g，溶于100ml雙蒸水中，pH5.6。MAS為牡蠣的抗凝齊lj(Xue,Q.G.,Renault,T.andChilmonczyk,S.:Flowcytometricassessmentofhaemocytesub-populationsintheEuropeanflatoyster,0欲eae^fc,haemolymph.FishShellfishImmunol(2001)557-567)，具體配方為20.80g/1葡萄糖，8.00g/l檸檬酸鈉，3.36g/1乙二胺四乙酸，22.50g/l氯化鈉，10X的檸檬酸調(diào)pH到7.5。結(jié)果表明1.鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑(HA)具有強抗凝集活性表l展示了離體雜色鮑血細(xì)胞1:1體積比懸浮于各種抗凝劑中，室溫保持1.5h后，血細(xì)胞凝集情況。顯微鏡下觀察，鮑血細(xì)胞在HA和RH中呈現(xiàn)均勻分布，在隨機觀察的20個視野中血細(xì)胞團(tuán)數(shù)均少于5個，每個細(xì)胞團(tuán)的血細(xì)胞數(shù)少于10個，抗凝集效果最好。其次是MAS，而在SS、PBS、DA和RPMI-1640中血細(xì)胞的凝集現(xiàn)象普遍。HA在抗凝活性上明顯優(yōu)于其它抗凝劑(表l)。表1雜色鮑血細(xì)胞在各種抗凝劑中1.5h的凝集情況<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注凝集團(tuán)數(shù)是指隨機觀察20個視野中的平均每個視野細(xì)胞團(tuán)數(shù)。2.鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑(HA)保存細(xì)胞的高存活率表2展示了離體雜色鮑血細(xì)胞1:1體積比懸浮于各種抗凝劑中的死亡率。SS、PBS和MAS中的血細(xì)胞均表現(xiàn)出非常高的死亡率，其它4種抗凝劑均有良好的存活率。結(jié)合考慮表2的抗凝效果，本發(fā)明的HA和RH具備抗凝和保存鮑血細(xì)胞的綜合作用。表2各種抗凝劑中雜色鮑血細(xì)胞的死亡率(％)血細(xì)胞在各種抗凝劑中的死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑(HA)的配方成分含量改變對鮑血細(xì)胞的抗凝保護(hù)效果鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑(HA)的關(guān)鍵點在于加入HEPES并控制含量、嚴(yán)格控制pH值以及限制加入鈉鹽，以下就上述3個方面逐一舉例說明。1)HEPES如表3和4所示，100mlHA中HEPES含量為0.230.24g時溶液的抗凝集和保護(hù)效果最好，含量為0.21g的效果尚可，當(dāng)HEPES含量小于0.19g時，HA的抗凝集效果有所下降，超過2.5g鮑血細(xì)胞懸浮在HA中12h后死亡率顯著增加，凝集現(xiàn)象嚴(yán)重。表3不同HEPES含量的HA中雜色鮑血細(xì)胞1.5hr的凝集情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4不同HEPES含量的HA中雜色鮑血細(xì)胞的死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2)pH值如表5和6所示，pH值為6.1時HA的抗凝保護(hù)效果最好，pH值為6.06.4時效果尚好，pH低于6.0時鮑血細(xì)胞的死亡率大大提高了，pH高于6.6細(xì)胞的凝集嚴(yán)重。表5雜色鮑血細(xì)胞在不同pH的HA中1.5h的凝集情況_工血細(xì)胞在不同pH的HA中的凝集情況測定項目_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6不同pH的HA中雜色鮑血細(xì)胞的死亡率(y。)血細(xì)胞在不同pH的HA中的死亡率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)NaCl含量如表7和8所示，NaCl含量低則鮑血細(xì)胞容易凝集，高則血細(xì)胞的死亡率大大增加。以100ml含3.7g-5.7g的NaCl為宜。表7雜色鮑血細(xì)胞在不同NaCl含量的HA中1.5h的凝集情況血細(xì)胞在不同NaCl含量的HA中的<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表8不同NaCl含量的HA中雜色鮑血細(xì)胞的死亡率(％)時間血細(xì)胞在不同NaCl含量的HA中的死亡率(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.HA對其它貝類以及鋸緣青蟹的抗凝保護(hù)效果如表9和IO所示，HA和RH對于東風(fēng)螺和文蛤等貝類以及青蟹的血細(xì)胞也有很好的抗凝集和保存效果。本發(fā)明的HA和RH具有良好的^C凝集、高存活和通用性，有望成為貝類血細(xì)胞通用的抗凝劑。表9不同海洋無脊椎動物血細(xì)胞在HA中懸浮1.5h后的凝集情況測定項目不同海洋無脊椎動物血細(xì)胞在的HA中的凝集情況方斑東風(fēng)螺文蛤鋸緣青蟹雜色鮑凝集團(tuán)數(shù)'5453每個凝集團(tuán)中細(xì)胞數(shù)(個)3553表10不同海洋無脊椎動物血細(xì)胞在HA中的死亡率(％)時間不同海洋無脊椎動物血細(xì)胞在的HA中的的死亡率(％)(h)方斑東風(fēng)螺文蛤鋸緣青蟹雜色鮑65.84.67.35.5121113.314.810.2權(quán)利要求1.鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑，其特征在于其原料組成及其按質(zhì)量比的含量為葡萄糖1.95～2.08，檸檬酸鈉(2H2O)0.78～0.8，檸檬酸0.063～0.107，氯化鈉0.37～0.57，羥乙基哌嗪乙硫磺酸0.21～0.24，雙蒸水100，pH6.0～6.4。2.如權(quán)利要求1所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑，其特征在于其原料組成及其按質(zhì)量比的含量為葡萄糖2.05，檸檬酸鈉(2H20)0.8，檸檬酸0.08，氯化鈉0.42，羥乙基哌嗪乙硫磺酸0.23,雙蒸水IOO，pH6.1。3.如權(quán)利要求1所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟將葡萄糖、檸檬酸鈉(2H20)、氯化鈉和羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶于雙蒸水中，攪拌溶解，用檸檬酸調(diào)pH至6.06.4，高溫滅菌，得鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑。4.如權(quán)利要求3所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的制備方法，其特征在于攪拌的溫度為45。C。5.如權(quán)利要求3所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的制備方法，其特征在于檸檬酸的濃度按質(zhì)量百分比為10%。6.如權(quán)利要求3所述的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑的制備方法，其特征在于高溫滅菌的溫度為U2.6'C，高溫滅菌的時間為30min。全文摘要鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑及其制備方法，涉及一種抗凝保護(hù)劑。提供一種在較長時間內(nèi)保持離體鮑血細(xì)胞活性的鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑及其制備方法。其原料組成及其按質(zhì)量比的含量為葡萄糖1.95～2.08，檸檬酸鈉(2H<sub>2</sub>O)0.78～0.8，檸檬酸0.063～0.107，氯化鈉0.37～0.57，羥乙基哌嗪乙硫磺酸0.21～0.24，雙蒸水100，pH6.0～6.4。將葡萄糖、檸檬酸鈉(2H<sub>2</sub>O)、氯化鈉和羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶于雙蒸水中，攪拌溶解，用檸檬酸調(diào)pH至6.0～6.4，高溫滅菌，得鮑血細(xì)胞抗凝保護(hù)劑。文檔編號C12N5/06GK101451120SQ200810072539公開日2009年6月10日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者張朝霞,柯才煥,蘇永全,軍陳申請人:廈門大學(xué)