專利名稱：：一種番茄醬主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法一種番茄醬主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的說，本發(fā)明涉及一種番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法領(lǐng)域。技術(shù)背景當(dāng)前進(jìn)出口番茄醬中微生物檢測的項目主要是霉菌，其檢驗(yàn)方法是采用標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.15-2003,對其它微生物項目的檢測很少涉及。隨著國際貿(mào)易的日益發(fā)展，對商品檢測技術(shù)的要求越來越高，很多國家和地區(qū)要求增加番茄醬中主要腐敗微生物的檢測，而目前相關(guān)的研究工作在中國仍是一片空白。番茄醬屬酸性罐頭食品(pH4.5以下)，在其中存活的微生物多為耐酸、抗熱性極強(qiáng)的桿菌、球菌等，它們的存在常常會導(dǎo)致罐頭食品的腐敗。國外有文獻(xiàn)報道，尼日利亞乳酸菌是番茄醬中的優(yōu)勢微生物，但是近年報道，世界各地番茄醬中的優(yōu)勢微生物并不是尼日利亞乳酸菌，其缺乏相應(yīng)科學(xué)數(shù)據(jù)支持。而經(jīng)過大量試驗(yàn)研究表明，經(jīng)新疆進(jìn)出口的番茄醬其微生物的種群構(gòu)成與國外報道不相同。番茄醬中的微生物種類很豐富，近6年對新疆進(jìn)出口番茄醬中微生物研究中分離出的芽孢桿菌占50%,葡萄球菌占25%,其它桿菌占15%,酵母菌占3%,乳酸菌占2%及霉菌占1%,大腸菌群、厭氧菌等占4%。數(shù)據(jù)表明芽孢桿菌為優(yōu)勢菌群，其次為葡萄球菌?？梢姰?dāng)前番茄醬中主要腐敗微生物為芽孢桿菌及葡萄球菌，而當(dāng)前國內(nèi)外還沒有報道建立一套完整的檢測番茄醬中主要腐敗微生物中芽孢桿菌和葡萄球菌的方法。國內(nèi)外沒有公開報道番茄醬中微生物指標(biāo)的具體檢測方法標(biāo)準(zhǔn)體系。我國有關(guān)番茄醬中孩吏生物4全驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)有GB4789.15-94、GB4789.26-94,這兩個標(biāo)準(zhǔn)只描述了番茄醬罐頭直接鏡檢霉菌數(shù)和商業(yè)無菌的檢測方法。因此，探索和研究引起番茄醬中腐敗微生物的種類，建立番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法體系，對促進(jìn)番茄醬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，維護(hù)國際市場中番茄醬貿(mào)易的優(yōu)勢地位，均具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容針對目前進(jìn)出口番茄醬中微生物檢測的項目主要是霉菌，關(guān)于番茄醬中霉菌的檢測方法，國外已有文獻(xiàn)報道；對其它微生物項目的^r測^艮少涉及，隨著國際貿(mào)易的日益發(fā)展，對商品檢測技術(shù)的要求越來越高，很多國家和地區(qū)要求增加番茄醬中主要腐敗微生物的檢測，關(guān)于番茄醬中芽孢桿菌及葡萄球菌檢測方法，未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，而目前相關(guān)的研究工作在中國仍是一片空白。而本領(lǐng)域熟知，番茄醬罐頭雖經(jīng)高溫處理，但仍有很多微生物如芽孢菌等難以滅活。本發(fā)明研究表明，將分離出的枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌分別接入番茄醬中，37。C培養(yǎng)24h后，均能引起番茄醬總酸量增加，還原糖量減少，從而導(dǎo)致番茄醬發(fā)生酸敗現(xiàn)象。這兩種菌均屬于能主體引起番茄醬腐敗的微生物。實(shí)驗(yàn)證明，部分葡萄球菌也能導(dǎo)致番茄醬腐敗變質(zhì)。本發(fā)明提供了一種番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法。本發(fā)明具體提供了番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法，建立了番茄醬中芽孢桿菌、葡萄球菌主要腐敗菌的檢驗(yàn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案通過對進(jìn)出口的番茄醬開展了各類微生物的分離培養(yǎng)研究。研究中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)出口番茄醬中主要存在芽孢菌、葡萄球菌以及極少量的酵母菌。將分離培養(yǎng)出的微生物進(jìn)行鑒定后，對其特性進(jìn)行了相關(guān)資料的查詢，均為能引起番茄醬腐敗的微生物種類。為此，本發(fā)明建立了番茄醬中芽孢菌和葡萄球菌的分離培養(yǎng)方法。本領(lǐng)域所熟知，腐敗^f鼓生物(Corrw;fmfcraorgm'sms)主要作為判定番茄醬中被污染程度的標(biāo)志，本發(fā)明通過將袋裝或罐裝番茄醬，經(jīng)過一定條件的培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等)，所培養(yǎng)分離出的主要芽孢桿菌、葡萄球菌。本發(fā)明具體提供了一種番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)步驟如下一、增菌培養(yǎng)1.檢樣處理以本領(lǐng)域所熟知的無菌操作，按重量體積百分比(g/100mL)計，取番茄醬8%~12%,加入200mL~250mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液。2.增菌培養(yǎng)按重量體積百分比(g/100mL)計，將8%~12%混懸培養(yǎng)液將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，即吸取20mL30mL上述混懸液，接種于平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液中，在35°C~37°C中培養(yǎng)24-48h。二、分離培養(yǎng)和鑒定1.本領(lǐng)域熟知，在其他食品中分離目標(biāo)菌，一般前增菌培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基有所差異，導(dǎo)致生產(chǎn)步驟復(fù)雜，生產(chǎn)成本加大，本發(fā)明前增菌和分離培養(yǎng)基均相同，都采用平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液。2.本發(fā)明中培養(yǎng)基的篩選是基于根據(jù)番茄醬屬酸性罐頭的特征，從廣譜性芽孢桿菌和葡萄球菌的分離培養(yǎng)基角度，在眾多培養(yǎng)基中確定了分離效果最好的四種培養(yǎng)基平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液。而在檢測其它食品中芽孢桿菌和葡萄球菌的分離方法不完全適合番茄醬中兩種菌的分離。3.將上述培養(yǎng)物，劃線轉(zhuǎn)種于平酸菌增菌培養(yǎng)基平板或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基平板和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)基或改良BCP培養(yǎng)基中，35°C~37°C中分別培養(yǎng)24-48h,觀察菌體形態(tài)。4.生化特性經(jīng)過單糖發(fā)酵試驗(yàn)、Kgas-/Vo^"wer(V-P)試驗(yàn)、曱基紅試驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)、石蕊牛奶的反應(yīng)和革蘭氏染色方法，這些方法都是熟知的常用技術(shù)手段，通過上述系列實(shí)驗(yàn)得知芽孢桿菌可利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖及檸檬酸鹽，接觸酶陽性，石蕊牛奶呈還原胨化反應(yīng)。葡萄球菌不能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖；曱基紅陽性；V-P為弱陽性。三、結(jié)果報告結(jié)合上述特征及相應(yīng)數(shù)據(jù)，結(jié)合相應(yīng)菌體的菌落特點(diǎn)，可以清楚的判斷，從番茄醬中檢出或未檢出芽孢桿菌、葡萄球菌。本發(fā)明上述生產(chǎn)方法中選用的菌種，為已公開報道的。本發(fā)明中所涉及到的°/。均以體積重量百分比計。本發(fā)明引用了GB/T4789.28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑。通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。1.通過本發(fā)明提供的檢測檢驗(yàn)方法，經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，能夠準(zhǔn)確的判定袋裝或罐裝番茄醬中有腐敗微生物存在，以及科學(xué)判定作為流通的番茄醬商品被污染的程度。2.本發(fā)明建立了增菌培養(yǎng)體系，有效的將番茄醬中的主要腐敗菌檢驗(yàn)出來。3.在食品等商品中分離目標(biāo)菌，一般前增菌培養(yǎng)基與分離培養(yǎng)基有所差異，導(dǎo)致其工藝步驟復(fù)雜，其生產(chǎn)成本加大，本發(fā)明前增菌和分離培養(yǎng)基均相同。圖1所示為芽孢桿菌對番茄醬液還原糖量的影響，選取四種代表性的芽孢桿菌在番茄醬液中37。C培養(yǎng)24h,對番茄醬液還原糖量的影響，其中枯草芽孢桿菌-,矮小芽孢桿菌-■，地衣芽孢桿菌-A，淀粉液化芽孢桿菌-x。圖2所示為芽孢桿菌對番茄醬液總酸量的影響，選取四種代表性的芽孢桿菌在番茄醬液中37。C培養(yǎng)24h，對番茄醬液還原糖量的影響，其中枯草芽孢桿菌-令，矮小芽孢桿菌-園，地衣芽孢桿菌-A,淀粉液化芽孢桿菌-x。圖3所示為葡萄球菌對番茄醬總酸量的變化情況，選取兩種代表性的葡萄球菌接種菌液后番茄醬總酸量的變化情況，其中腐生葡萄球菌-沃氏葡萄球菌-B-。圖4所示為葡萄球菌對番茄醬還原糖量的變化情況，選取兩種代表性的葡萄球菌接種菌液后番茄醬還原糖量的變化情況，其中腐生葡萄球菌--，沃氏葡萄球菌-B-菌液后番茄醬。圖5所示為番茄醬中芽孢桿菌4企驗(yàn)流程圖。圖6所示為番茄醬中葡萄球菌4t險流程圖。具體實(shí)施方式下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則按100Kg飲料重量為基準(zhǔn)，％皆指重量百分比。本發(fā)明中設(shè)備和材料有36°C±rC的恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸氣滅菌鍋、0°C~4。C冰箱、10x~100x顯微鏡、最大稱重達(dá)2000g,感量0.1g的天平、lml(具0.01ml刻度)和10ml(具0.1ml刻度)的滅菌吸管、16mmx160mm和18mmx180mm的滅菌試管、直徑90mm的滅菌培養(yǎng)皿、pH計、pH試紙、酒精燈、滅菌剪子和鑷子等。實(shí)施例一番茄醬中芽孢桿菌、葡萄球菌的分離與鑒定通過對六種番茄醬進(jìn)行35°C~37。C前增菌，將前增菌液培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)入嗜熱耐酸芽孢桿菌和平酸菌增菌瓊脂培養(yǎng)基。將分離出的菌抹經(jīng)VITEK-32生化鑒定，結(jié)果為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和矮小芽孢桿菌。通過從袋裝番茄醬和罐裝番茄醬進(jìn)行35°C-37。C前增菌，將前增菌液培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)入胰大豆胨肉湯培養(yǎng)基和改良BCP培養(yǎng)基。將分離出的菌株經(jīng)VITEK-32生化鑒定，結(jié)果為腐生葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。從新疆進(jìn)出口的Y6、Y10、Y19、Y35、Y36、Y41、Y53、Y56、Y65等二十多批番茄醬，按無菌操作取番茄醬25g，加入225mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，以體積比將10%混懸培養(yǎng)液在35°C37。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，經(jīng)平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液中，在35°C37。C進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。采用相同的前增菌和分離培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，劃線轉(zhuǎn)種于平酸菌增菌培養(yǎng)基平板或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基平板和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)基或改良BCP培養(yǎng)基中，在35。C37。C條件下分別培養(yǎng)24-48h。觀察獲得的菌落特征，將上述可疑菌落做涂片染色，進(jìn)行顯微鏡觀察判斷菌體形態(tài)。觀察菌體形態(tài)芽孢桿菌呈表面粗糙皺褶、不透明、白色，為革蘭氏陽性芽孢桿菌，單個細(xì)胞0.7jum0.8jumx2nim3jam、著色均勻；無莢膜，全身鞭毛，能活動，芽孢呈橢圓或柱狀；葡萄球菌呈圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、有光澤、不透明菌落。菌落直徑在lmm5mm,為革蘭氏陽性球菌，直徑0.4|um~1.2jum,呈葡萄串狀排列。通過利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖及檸檬酸鹽，接觸酶陽性，石蕊牛奶呈還原胨化反應(yīng)，判斷芽孢桿菌；通過分析不能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，曱基紅陽性，V-P為弱陽性，判斷葡萄球菌。參見附圖5、6上述試驗(yàn)步驟都可分離出芽孢菌和葡萄球菌，分離出的微生物采用VITEK-32進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明芽孢菌類主要有枯草芽孢桿菌(勘c///^^"7/s)、矮小芽孢桿菌(勘"7紋j9願7m)、地衣芽孢桿菌(勘"7/m//cAew/Zbr/ff/i1)等；葡萄球菌主要有腐生葡萄球菌(57ap/^cocc"51i^/7iTj9力/〃C〃51)和沃氏葡萄球菌(5Y^O,OC(9CC〃51附/7e".)等，這些菌種與現(xiàn)有公開報道的同類菌種相同。實(shí)施例二按照實(shí)施例一所述試驗(yàn)步驟，參見附圖5、6,其中，按重量體積百分比計(g/100mL),以無菌操作取番茄醬8%，加入200mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，以體積比將10Q/?；鞈遗囵B(yǎng)在35。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)基在35。C進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。采用相同的前增菌和分離培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種，在35°C-37。C分別培養(yǎng)24-48h。都可分離出芽孢菌和葡萄^^菌，分離出的微生物采用VITEK-32進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明芽孢菌類主要有枯草芽孢桿菌(A"7/m^"7/s)、矮小芽孢桿菌(勘"7/m.;7固7w51)、地衣芽孢桿菌(勘c///〃51//cAe///^/^1)等；葡萄球菌主要有腐生葡萄球菌(5Ya/^ococci/51s5/ro/7力y/7c〃s)和沃氏葡萄球菌(xS",a/^ococcw51附i72eri)等，這些菌種與現(xiàn)有公開報道的同類菌種相同。實(shí)施例三按照實(shí)施例一所述試驗(yàn)步驟，參見附圖5、6，其中，按重量體積百分比計(g/100mL),以無菌#:作耳又番茄醬12%,加入250mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，以體積比將10%混懸培養(yǎng)液37。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)基在37。C進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。采用相同的前增菌和分離培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種，在35°C37。C分別培養(yǎng)24-48h。都可分離出芽孢菌和葡萄球菌，分離出的微生物采用VITEK-32進(jìn)行鑒定，出芽孢菌和葡萄球菌與現(xiàn)有公開報道的同類菌種相同。實(shí)施例四按照實(shí)施例一所述試驗(yàn)步驟，參見附圖5、6,其中，按重量體積百分比計(g/100mL),以無菌操作取番茄醬10%，加入240mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，以體積比將10。/?；鞈遗囵B(yǎng)液36。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)基在35.5°C、進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。采用相同的前增菌和分離培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種，在35°C37。C分別培養(yǎng)24-48h。都可分離出芽孢菌和葡萄球菌，分離出的微生物采用VITEK-32進(jìn)行鑒定，出芽孢菌和葡萄球菌與現(xiàn)有公開報道的同類菌種相同。實(shí)施例五按照實(shí)施例一所述試驗(yàn)步驟，參見附圖5、6，其中，按重量體積百分比計(g/100mL),以無菌操作取番茄醬9%,加入205mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，以體積比將10%混懸培養(yǎng)液36.5。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)基在35。C進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。采用相同的前增菌和分離培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種，在35°C37。C分別培養(yǎng)24-48h。都可分離出芽孢菌和葡萄球菌，分離出的微生物采用VITEK-32進(jìn)行鑒定，出芽孢菌和葡萄球菌與現(xiàn)有公開報道的同類菌種相同。實(shí)施例六芽孢桿菌對番茄醬品質(zhì)的影響對分離自番茄醬的枯草芽孢桿菌、矮小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌分別重新接入番茄醬液，37。C培養(yǎng)24h，每4h測定一次番茄醬中總酸量和還原糖量的變化，結(jié)果參見附l、圖2。參見附l、圖2表明，在培養(yǎng)8h-16h時有大量酸產(chǎn)生，還原糖量急劇降低，證明這四林菌均能導(dǎo)致番茄醬腐敗變質(zhì)。實(shí)施例七葡萄球菌對番茄醬品質(zhì)的影響對分離自番茄醬的腐生葡萄球菌和沃氏葡萄球菌分別重新接入番茄醬液中，37。C培養(yǎng)24h,每4h測定一次番茄醬中總酸量和還原糖量的變化，結(jié)果參見附3、圖4。由參見附3、圖4可見，腐生葡萄球菌在0h-8h和12h-24h時總酸量急劇增加，還原糖量迅速降低；沃氏葡萄i^菌在0h-16h時總酸量急劇增加，在0h-8h和16h-24h還原糖量迅速降低，最終導(dǎo)致番茄醬腐敗變質(zhì)。實(shí)施例八培養(yǎng)分離芽孢桿菌選用培養(yǎng)基的篩選釆用同一批番茄醬、同一培養(yǎng)條件，根據(jù)番茄醬特性，選用熟知的各類培養(yǎng)基，本發(fā)明選用最具代表性的五種培養(yǎng)基嗜熱耐酸桿菌培養(yǎng)基、脂耐熱嗜酸桿菌瓊脂、營養(yǎng)肉湯、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂和平酸菌增菌培養(yǎng)液。其培養(yǎng)條件都為熟知的技術(shù)。通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，選用平酸菌增菌培養(yǎng)基和嗜熱耐酸桿菌培養(yǎng)基有菌生長，參見表一。具體選用培養(yǎng)基的組分及培養(yǎng)條件如下平酸菌增菌培養(yǎng)基l.成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g嗜熱耐酸桿菌培養(yǎng)基脂耐熱嗜酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基甘露醇印黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基平酸菌增菌培養(yǎng)基有菌生長無菌生長無菌生長無菌生長有菌生長葡萄糖可溶性淀粉磷酸氫二鉀1%溴曱酚紫酒精溶液蒸餾水2.制法將上述成分混合，加熱并輕輕攪拌溶解pH7.0±0.2。加入2%的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。嗜熱耐酸桿菌培養(yǎng)基成分喜二鐘5.0g2.0g4.0g1.OmL1000mL分裝后，12rC高壓滅菌15min,5.0g,5.0g，5.0g4.0g1000mL制法將上述成分混合，加熱并輕輕攪拌溶解，分裝后，12rC高壓滅菌15min,pH7.0±0.2。加入2°/。的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。表一芽孢桿菌分離用培養(yǎng)基實(shí)施例九培養(yǎng)分離葡萄球菌選用培養(yǎng)基的篩選釆用同一批番茄醬、同一培養(yǎng)條件，根據(jù)番茄醬特性，選用熟知的各類培養(yǎng)基，本發(fā)明選用最具代表性的五種培養(yǎng)基胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液、改良BCP培養(yǎng)液、營養(yǎng)肉湯、疊氮鈉血瓊脂和血瓊脂。其培養(yǎng)條件都為熟知的技術(shù)。通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，選用胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液和改良BCP培養(yǎng)液有菌生長，參見表二。具體選用培養(yǎng)基的組分及培養(yǎng)條件如下胰蛋白胨17g大豆胨3g葡萄糖2.5g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g11浸胨糖氬水母白萄酸餾酵蛋葡磷蒸蒸餾水1000mlpH=7.1-7,5制法將上述成分混合，加熱并輕輕攪拌溶解，分裝后，121。C高壓滅菌15minpHLO士0.2。加入2%的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。改良BCP培養(yǎng)液蛋白胨10.Og牛肉浸膏3g氯化鈉5.Og葡萄糖10g碳酸4丐1%蒸餾水IOO(MpH=7.0±0.2制法將上述成分混合，加熱并輕輕攪拌溶解，分裝后，12rC高壓滅菌15min，pH7.0±0.2。加入2%的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。表二<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例十芽孢桿菌與葡萄球菌常見生化反應(yīng)方法1.單糖發(fā)酵試驗(yàn)(1)將葡萄糖(乳糖或麥芽糖或蔗糖等)加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為O.5%，并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管。(2)將細(xì)菌按照液體接種方法分別接種于單糖發(fā)酵管內(nèi)，置37。C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24小時。(3)觀察結(jié)果接種細(xì)菌經(jīng)37。C培養(yǎng)18-24小時，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解曱酸有C02和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。注蔗糖應(yīng)釆用過濾除菌2.V-P(一es-尸薦l雄力試驗(yàn)(1)接種細(xì)菌于葡萄糖蛋白胨水中。(2)置37。C培養(yǎng)48小時后，取出分別加入40%KOHlmL和6。/。a-奈酚溶液lmL，搖勻，靜置試管架上5-15分鐘。(3)觀察結(jié)果培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性。3.甲基紅試驗(yàn)(1)接種細(xì)菌于葡萄糖蛋白胨水中。(2)置37。C培養(yǎng)2-3天取出，分別滴加曱基紅試劑2-3滴，混勻。(3)觀察結(jié)果培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性，黃色為陰性。4.接觸酶實(shí)驗(yàn)(1)挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加2mL3。/。過氧化氫溶液。(2)觀察結(jié)果于半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。5.檸檬酸鹽反應(yīng)(1)取幼齡菌種接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)3-7天。(2)觀察結(jié)果培養(yǎng)基呈堿性(藍(lán)色)者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性6.石蕊牛奶的反應(yīng)(1)取菌液接入510ml的石蕊牛奶培養(yǎng)基中，在37。C培養(yǎng)48小時。(2)觀察結(jié)果石蕊應(yīng)還原為無色，牛奶應(yīng)呈正常凝固現(xiàn)象，培養(yǎng)基上層表面應(yīng)呈紫紅色環(huán)。7.革蘭氏染色方法革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是:(1)涂片固定。(2)草酸銨結(jié)晶紫染l分鐘。(3)自來水沖洗。(4)加碘液覆蓋涂面染1分鐘。(5)水洗，用吸水紙吸去水分。(6)加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水分。(7)蕃紅染色液(稀)(或沙黃)染IO秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。(8)染色的結(jié)果革蘭氏陽性菌體呈紫色，陰性菌體呈紅色。實(shí)施例十一番茄醬中主要腐敗微生物分布通過多年從進(jìn)出口的各類番茄醬分離腐敗微生物，導(dǎo)致腐敗的微生物分布如表三所示表三匯總多年來從番茄醬中分離微生物結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過上述系列實(shí)驗(yàn)，利用統(tǒng)計學(xué)分析手段得知，進(jìn)出口番茄醬中微生物研究中分離出的芽孢桿菌占50%,葡萄球菌占25°/。，其它桿菌占15%，酵母菌占3%，乳酸菌占2%及霉菌占1%，大腸菌群、厭氧菌占4%,說明導(dǎo)致番茄醬主要腐敗菌為芽孢桿菌和葡萄球菌。權(quán)利要求1.一種番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法，通過選擇合適的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液培養(yǎng)、分離培養(yǎng)，經(jīng)過單糖發(fā)酵試驗(yàn)、Voges-Proskauer試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)、石蕊牛奶的反應(yīng)和革蘭氏染色方法檢驗(yàn)，鑒定獲得具體腐敗微生物的方法，其特征在于，A.采用前增菌培養(yǎng)，按重量體積百分比計，取番茄醬8％～12％，加入200mL～250mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，將8％～12％混懸培養(yǎng)液分別接種于平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液中，在35℃～37℃中培養(yǎng)24-48h；B.分離培養(yǎng)和鑒定采用與步驟A前增菌相同平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液；C.將上述培養(yǎng)物劃線分別轉(zhuǎn)種于平酸菌增菌培養(yǎng)基或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)基或改良BCP培養(yǎng)基的平板中，35℃～37℃中分別培養(yǎng)24-48h。2、如權(quán)利要求1所述的番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法，其特征在于，優(yōu)先按無菌操作取番茄醬25g，加入225mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，將10%混懸培養(yǎng)液在36。C將接種于相應(yīng)的培養(yǎng)液，分別經(jīng)平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液中，在36°C進(jìn)行增菌培養(yǎng)24-48h。全文摘要公開了一種番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗(yàn)方法。針對國內(nèi)外沒有報道檢測番茄醬中主要腐敗微生物的方法。通過對采用前增菌培養(yǎng)，按重量體積百分比計，取番茄醬8％～12％，加入200mL～250mL生理鹽水，混合均勻制成混懸液，將8％～12％混懸培養(yǎng)液分別接種于平酸菌增菌培養(yǎng)液或嗜熱耐酸桿菌瓊脂培養(yǎng)液和胰大豆胨肉湯培養(yǎng)液或改良BCP培養(yǎng)液中，在35℃～37℃中培養(yǎng)24-48h，分離培養(yǎng)和前增菌相同的培養(yǎng)液，經(jīng)過系列生化試驗(yàn)，鑒定確定番茄醬中主要存在芽孢菌、葡萄球菌為主要腐敗微生物。對促進(jìn)番茄醬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，維護(hù)國際市場中番茄醬貿(mào)易的優(yōu)勢地位，均具有重要意義。文檔編號C12Q1/04GK101270383SQ20081007287公開日2008年9月24日申請日期2008年5月8日優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日發(fā)明者劉小蘭,吳海文,季新成,曾獻(xiàn)春,田延河,輝竇,蔣剛強(qiáng),鄭樹桐,玲黃申請人:新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心