專利名稱：德國(guó)肉用美利奴羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因snp位點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及德國(guó)肉用美利奴肌肉抑制素myostatin基因外顯子1單核苷酸多態(tài)性，本發(fā) 明還涉及肌肉抑制素myostatin基因外顯子1等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育受到眾多生長(zhǎng)發(fā)育因子的調(diào)控，肌肉抑制素基因是目前發(fā)現(xiàn)的功能較為明 確的負(fù)調(diào)控基因，主要在骨骼肌中表達(dá)。對(duì)小鼠、比利時(shí)藍(lán)牛、皮艾蒙特牛、德克塞爾羊、 小靈狗等的研究證實(shí)，由于缺失該基因或該基因編碼區(qū)發(fā)生突變，導(dǎo)致該基因活性喪失或被 抑制，造成肌肉過(guò)度生長(zhǎng)，因而確定其具有特異的抑制骨骼肌生長(zhǎng)的功能。篩選myostatin基 因突變等位基因或用分子生物學(xué)方法干擾、阻斷myostatin基因的負(fù)調(diào)控作用，對(duì)于肉用動(dòng)物 品種的選育和提高產(chǎn)肉性能方面具有重要意義。在本申請(qǐng)之前，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于德國(guó)肉用美利 奴myostatin基因外顯子1多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。
德國(guó)肉用美利奴myostatin基因外顯子1上發(fā)現(xiàn)的單核苷酸突變?yōu)橥x突變。由于密碼的 簡(jiǎn)并性，不改變編碼的氨基酸，但由于改變了核苷酸序列，有可能影響轉(zhuǎn)錄后加工mRNA接 切信號(hào)順序。由于存在同義突變，在mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中，攜帶氨基酸殘基結(jié)合到 核糖體上的tRNA就不相同，從而tRNA豐度也不同，如果同義突變后對(duì)應(yīng)的tRNA在細(xì)胞 內(nèi)豐度小，那么將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成效率下降，最終影響基因的表達(dá)量。
方法內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提示在德國(guó)肉用美利奴myostatin基因外顯子1上發(fā)現(xiàn)一個(gè)單核苷酸突變 位點(diǎn)，而該位點(diǎn)僅在該肉用綿羊品種中存在，并提供該等位基因突變的檢測(cè)方法。
檢測(cè)內(nèi)容及方法1確定德國(guó)肉用美利奴myostatin基因外顯子1單核苷酸突變位點(diǎn)位 于SEQID: DQ530260所示序列從起始密碼子ATG開始第+84位的位置，由GG等位基因突變 為GA等位基因。2檢測(cè)該突變等位基因的特異性核酸引物，來(lái)源于SEQID: DQ530260，長(zhǎng) 度為33bp和25bp,能夠特異性的結(jié)合到突變等位基因模板鏈上，可以擴(kuò)增到含有等位基因 突變的目的基因。3通過(guò)設(shè)計(jì)的核苷酸引物以及建立的檢測(cè)體系，較為準(zhǔn)確、快捷的擴(kuò)增群 體中等位基因，通過(guò)SSCP分析，可以準(zhǔn)確的分析得到綿羊myostatin基因外顯子1單核苷酸 突變位點(diǎn)存在與否。
具體實(shí)施方式
1體外擴(kuò)增
(1) 采集綿羊血液，使用肝素納抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA。
(2) 使用特異結(jié)合的核,苷酸引物對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行體外擴(kuò)增
(3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10xPCRbuffer(Mg2+free)2pL, 25mM MgCl 1.3uL, 10mmol/L dNTP混合物1 ^L， 10pmol/L引物(上游)0.5pL, 10nmol/L引物(下游)0.5pL, Taq酶 1.25U, 100ng/fiLDNA模板1 ddH20補(bǔ)足20pL。
(4) PCR反應(yīng)程序95 'C 5min 1個(gè)循環(huán)94'C 45s， 58。C退火35 s, 72 'C 40 s共35 個(gè)循環(huán)；72 'C 5 min 1個(gè)循環(huán)。
2 SSCP分析
(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，如果片段長(zhǎng)度為393bp,那么將PCR產(chǎn)物甲酰 胺變性緩沖液按h l體積比98'C變性10mim然后立即置于冰中冷卻，5min后上樣進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳。
(2) 電泳使用凝膠配置7.7%非變性PAGE凝膠
29n/。丙烯酰胺-l。/。N，N-雙丙烯酰胺 7.7mL
5xTBE 3mL
10%過(guò)硫酸銨(AP) 0.2lmL
TEMED (四甲基乙二胺) 2(HU
去離子水 14.77mL
總體積 30mL
(3) 電泳前先在4'C環(huán)境、300V電壓下凝膠預(yù)電泳30min，然后將變性后產(chǎn)物加入加樣 孔，在4'C環(huán)境、180V電壓條件下電泳19hr。
(4) 電泳結(jié)束取下凝膠，使用快速染色顯影方法先用蒸餾水清洗凝膠，然后轉(zhuǎn)入染色 盒中，加入染色液，搖床上染色10分min;用蒸餾水清洗凝膠，轉(zhuǎn)入顯影盒，先加入少量顯 影液沖洗并把液體倒掉，然后加入適量顯影液顯影3min，待條帶清晰用蒸餾水清洗，凝膠成 像系統(tǒng)照相。
(5) 染色液0.1%硝酸銀溶液，稱取0.5克硝酸銀溶于500ml去離子水，置于棕色瓶 中，室溫保存。顯影液NaOH片10克，NaCO30.2克，甲醛2ml,加去離子水定容至500ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3測(cè)序分析
這一過(guò)程是為了檢測(cè)獲得的結(jié)果的可靠性，在實(shí)際操作中憑帶型即可區(qū)分，無(wú)需此過(guò)程。
在非變性聚丙烯酰胺凝膠中帶型顯示為三條的判斷為雜合型等位基因，將兩條的判斷為 純合型等位基因，選擇這兩類樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)連接到T載體、轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5a 、選擇性培養(yǎng)基篩選、挑選陽(yáng)性克隆檢測(cè)，然后擴(kuò)菌送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。 結(jié)果顯示判斷正確無(wú)誤帶型三條的為雜合型等位基因，兩條的為純合型等位基因。本專利所設(shè)計(jì)的核苷酸引物序列如下.-
S- 5， gzit tgt att gat ttt aaet acc atg caa aaa ctg3 AS- 5， etc cgt ggg cat ggt aat gac cgt t3，。
權(quán)利要求
1、德國(guó)肉用美利奴羊myostatin基因外顯子1單核苷酸突變位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于Genebank序列(SEQ IDDQ530260，Access number)從起始密碼子ATG開始+84位的G→A突變。
2、 該位點(diǎn)的SSCP檢測(cè)技術(shù)。包括樣品變性條件和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 條件。
3、用于SSCP分析的引物設(shè)計(jì)。 引物序列為上游5 ， gat tgt att gat ttt a犯acc atg caa aaa ctg 3 ，-下游5 ， etc cgt ggg cat ggt aat gac cgt t3 ，c
全文摘要
本發(fā)明公布了德國(guó)肉用美利奴羊肌肉生長(zhǎng)抑制素基因SNP位點(diǎn)。發(fā)明涉及德國(guó)肉用美利奴羊myostatin基因外顯子1單核苷酸突變的檢測(cè)方法。目前在多個(gè)物種上發(fā)現(xiàn)myostatin基因編碼區(qū)的單核苷酸位點(diǎn)突變對(duì)肌肉生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯效應(yīng)，而德國(guó)肉用美利奴羊編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。本發(fā)明建立了穩(wěn)定的體系檢測(cè)到肌肉抑制素基因外顯子1的SNP位點(diǎn)，本發(fā)明特征在于引物序列特異性好，建立穩(wěn)定的PCR-SSCP檢測(cè)體系，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)、丙烯酰胺與N，N-雙丙烯酰胺比例、凝膠濃度、電泳條件等。該方法能夠?qū)Σ煌贩N綿羊myostatin基因外顯子1第84等位基因突變進(jìn)行分析，對(duì)于判斷綿羊myostatin基因型以及分析其功能具有意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101591696SQ20081007288
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者劉明軍, 森 唐, 張惠玲 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心