專利名稱：一種釀酒酵母菌株及其高效發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于釀酒酵母生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體是乙醇發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，特別是涉及一種優(yōu)良釀 酒酵母菌株及其高效發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
以糖質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇， 一直由于高昂的原料成本，而為人們所忽視。原油價格的不 斷攀升，以及糖價的下跌，以及巴西甘蔗燃料乙醇的巨大成功，已經(jīng)向世人展現(xiàn)出甘蔗乙醇 良好的市場潛力。我國南部，地處亞熱帶，氣溫高、陽光充足、多雨而秋旱，具有悠久的甘 蔗栽培歷史并巳形成規(guī)模，不但具備了發(fā)展甘蔗燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的自然條件，同時還形成了良 好的原料產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)。遺憾的是，目前，在我國尚未見到規(guī)模化甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)業(yè)應(yīng) 用報道。盡管甘蔗乙醇還不是目前乙醇生產(chǎn)的主要形式，但作為一項儲備技術(shù)，是有必要對
其進行研究的。
國內(nèi)有一些研究甘蔗乙醇生產(chǎn)技術(shù)的相關(guān)文獻報道，如
文獻1:能源甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)酵工藝優(yōu)化作者潘琢鄭穗平林影等作者 單位華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院刊名迎接工業(yè)生物技術(shù)的新世紀——第四屆 發(fā)酵工程學(xué)術(shù)研討會論文集，200文摘以能源甘蔗為原料，"新橋"酵母為發(fā)酵菌 種，在新鮮蔗汁中進行直接發(fā)酵，對氮源添加和發(fā)酵條件進行了研究。實驗結(jié)果表明，氮源
的添加可以改善酵母的生長和發(fā)酵情況，發(fā)酵周期為66h，殘?zhí)菫?.04g/l，酒精度為 11.5%，最適接種量為10%，最適發(fā)酵初始pH值為6.5，最適發(fā)酵溫度為35'C，震蕩狀態(tài)下 的發(fā)醉可顯著縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵周期為32h。
文獻2:適合甘蔗汁發(fā)酵高產(chǎn)酒精酵母的選育作者范元發(fā)江賢章陳由強等作 者單位福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心刊名生物技術(shù)，2008, (1)文 摘目的:選育出適合發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)燃料乙醇的高產(chǎn)釀酒酵母的菌株。方法:以酵母菌株 YS5作為出發(fā)菌株,將酶解破壁后獲得的原生質(zhì)體進行紫外誘變，通過初篩和復(fù)篩進行選 育。結(jié)果:獲得一株高產(chǎn)酒精的釀酒酵母突變株YS5-1，該突變株發(fā)酵甘蔗汁的乙醇含量可達 12.6n/。(V/V)，較出發(fā)菌株的11.6。/。(V/V)提高了 8.6%，其糖的轉(zhuǎn)化率高達94.5%，高于出發(fā)菌 株的87.0%。結(jié)論:通過5次連續(xù)傳代培養(yǎng)后其突變株的乙醇產(chǎn)量保持穩(wěn)定，表明該突變株完 全可以用于發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)燃料乙醇。
文獻3:甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)展現(xiàn)狀及前景展望作者李苗苗于淑娟機 構(gòu)華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州510640刊名釀酒科技.2007(6).-111-113。
3文中提到，在國外，巴西的乙醇廠采用間接發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵兩種工藝生產(chǎn)燃料乙醇，酵母被 分離出繼續(xù)回用，成熟醪乙醇濃度可達8% 11%，發(fā)酵時間縮短至6 10h， 一天可回用3 次。新西蘭的H.W.Doellel等以甘蔗汁為原料，以運動發(fā)酵單孢菌作為發(fā)酵菌株規(guī)?；?產(chǎn)工業(yè)酒精，100L和1000L發(fā)酵試驗顯示，經(jīng)17 20小時發(fā)酵后，其糖轉(zhuǎn)化率為91 95 %，酒精濃度為10%(v/v)。 Limtong, S.等以甘蔗汁為原料，馬克斯克魯維酵母為發(fā)酵菌株生 產(chǎn)燃料酒精，該酵母耐40 45。C高溫，在4(TC發(fā)酵，酒精濃度為6.78% (w/v)，酒精得率 為60.4%。
到目前為止，糖廠的酒精生產(chǎn)都以糖蜜為原料，雖然甘蔗汁與糖蜜一樣以含蔗糖成分為 主，但甘蔗汁有其特殊性，如甘蔗汁灰分較少，而蛋白質(zhì)、膠體等較多，易引起發(fā)酵過程中 影響酵母繁殖、酵母菌絮凝、發(fā)酵速度偏慢和生產(chǎn)工藝繁瑣易等問題。針對甘蔗汁直接發(fā)酵 的特殊性，選育出適宜蔗汁發(fā)酵的酵母菌種，改進并優(yōu)化其發(fā)酵工藝，以期提高產(chǎn)率方面需 開展深入研究。國內(nèi)外的研究人員已經(jīng)對甘蔗乙醇的生產(chǎn)做了大量的有價值的研究工作，其 中，巴西尤為突出，取得了顯著的成效，其采用天然優(yōu)良酵母發(fā)酵，并結(jié)合酵母回用技術(shù)。 但針對我國目前乙醇廠的現(xiàn)狀，進行酵母回用技術(shù)，不但設(shè)備需要改進，而且對工作人員的 要求相對較高，如何有效利用現(xiàn)有設(shè)備進行甘蔗乙醇的生產(chǎn)，本發(fā)明進行了有益的探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對甘蔗汁直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株發(fā)酵速度偏慢、殘?zhí)歉?、生產(chǎn)工藝繁 瑣等不足，提供一種適宜蔗汁發(fā)酵的優(yōu)良釀酒酵母菌株，并提供該菌株在蔗汁產(chǎn)乙醇中的單 濃度連續(xù)流加發(fā)酵工藝方法，以填補我國在該項生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的空白。
本發(fā)明所提供的釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)，是發(fā)明人利用生物學(xué)手 段，從酒精廠排污口的土壤中分離選育得到的一株耐高溫、耐酒精、適合甘蔗發(fā)酵的菌株， 即酵母菌株gXas02，已于2008年7月19日保藏在位于中國武漢市武漢大學(xué)的中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M208110。
CCTCC N0:M208110的分離選育過程如下
從酒精廠排污口采集廢棄的醪液、廢水、淤泥及周邊的泥土作分離樣品，分別接入含 50mlYPD (葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值)液體的250ral三角瓶 中，接入的分離樣品約為lg， 3(TC， 160rpm搖瓶富集培養(yǎng)24h。取富集培養(yǎng)液進行不同濃 度的稀釋，涂YPD平板，3CTC培養(yǎng)2天，將菌株稀釋涂布于TTC下層平板中，3(TC培養(yǎng)24h, 長出可見菌落后，選擇菌落數(shù)為100 300的平板倒入約12mL TTC上層培養(yǎng)基覆蓋原來菌 落，之后在3(TC下避光保溫2 3h，由菌落的呈色來判定酵母產(chǎn)酒精能力的大小。通過TTC 顯色劑對酵母代謝產(chǎn)物的呈色特性，篩選出產(chǎn)酒精能力強的酵母。發(fā)明人按照上述方法，先后從來自于2個酒精廠，共4批的30余份樣品中，選擇出一個屬于本發(fā)明的，具有利用甘 蔗汁產(chǎn)酒精優(yōu)良發(fā)酵特性的分離物，實驗室編號gxas 02，即CCTCC N0:M208110。 CCTCC N0:M208110的分類鑒定
CCTCC N0:M208110的細胞形態(tài)特征為圓形或卵圓形，在幼年菌落中，細胞為4 14X 3 7微米，長和寬的比率是l: 1 1: 2，在麥芽汁中沉淀，子囊孢子圓形，平滑。
挑取含CCTCC N0:M208110平板上的單菌落，接種于含3mlYPD培養(yǎng)基的指形瓶中，30 'C， 160rpm，過夜培養(yǎng)，然后，利用酵母總DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提 取CCTCC NO，8110的基因組DNA。
其中采用
正向引物NL-1:5 ， -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ，， 反向引物NL-4:5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，
以CCTCC N0:M208110的總DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),擴增大小為 575bp的26S rDNA Dl/D2區(qū)域核苷酸序列，擴增產(chǎn)物連接到pMD18—T載體(大連寶生物工 程有限公司)上，用此序列在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(Nucleitide — Nucleitide BLAST)。搜索結(jié)果表明CCTCC N0:M208110的26S rDNA Dl/D2區(qū)域核酸序 歹U ， 與 Genbank 現(xiàn)有 Saccharomyces cerevisiae isolate TJY-29 、 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-4 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-2禾口 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-1等同一區(qū)域核酸序列同源性均達到100%。
由于CCTCC N0:M208110單純的26S rDNA Dl/D2區(qū)域核酸序列與其他菌株的沒有區(qū) 別，為了更好的區(qū)別該菌株，對該菌株和釀酒酵母的測序菌株S288C進行了 CGH (comparative genomic hybridization)的生物芯片，并進行了熒光交換實驗，尋找到 271個與S288C有明顯差異的基因，23個基因拷貝數(shù)明顯增多，主要集中在第17條染色體 上，248個基因拷貝數(shù)明顯減少，分布在其余的16條染色體上。
將CCTCC N0:M208110進行溫度和酒精耐受度測試，發(fā)現(xiàn)該菌株為能耐受高溫、高糖和 高酒精菌株，其溫度耐受度為37。C，耐糖度為60%質(zhì)量比的葡萄糖，酒精耐受度體積百分比 為20%。
根據(jù)上述的菌落外觀、細胞形態(tài)、生理生化與分子生物學(xué)特征的可以確定，CCTCC N0:M208110的分類地位屬于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本發(fā)明還提供了利用CCTCC N0:M208110直接發(fā)酵蔗汁生產(chǎn)乙醇的單濃度流加發(fā)酵方 法。具體工藝方法如下
將CCTCC N0:M208110按微生物發(fā)酵常規(guī)液體種子培養(yǎng)方法，以YPD培養(yǎng)基，即葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值進行培養(yǎng)，當每毫升培養(yǎng)液含酵母菌數(shù)達 到1.5億個以上時，按1 10%的接種量轉(zhuǎn)接到處理過的甘蔗汁中(添加了濃硫酸調(diào)整pH為 3.0 4.0并添加質(zhì)量比為0.1%的尿素、質(zhì)量比為0.02%的磷酸)，按此比例逐步放大，一 直到可以進行發(fā)酵罐培養(yǎng)，當發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)液滿足流加條件時，即每毫升培養(yǎng)液含酵母 菌數(shù)達到1.5億個以上，開始連續(xù)流加處理過的甘蔗汁進行發(fā)酵，按常規(guī)技術(shù)控制發(fā)酵罐培 養(yǎng)液酵母數(shù)及各發(fā)酵罐的常規(guī)運行參數(shù)， 一直到發(fā)酵醪成熟，然后便按常規(guī)的蒸餾工藝制取 乙醇。
采用本發(fā)明的單濃度流加發(fā)酵方法，發(fā)酵過程中，各罐溫度控制在26 37°C，發(fā)酵所 用時間為12 16小時；其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇全過程完成時，發(fā)酵液中乙醇體積百分比濃度為 8.6 9.4%，殘?zhí)菫?.2 0.3g/100ml。本工藝可在一個發(fā)酵罐內(nèi)進行也可以在多個發(fā)酵罐中 進行。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步是
1、 分離選育出了適于蔗汁直接發(fā)酵的優(yōu)良發(fā)酵菌株
本發(fā)明人通過大量篩選比較，分離選育出了具有多種優(yōu)良特性的釀酒酵母菌株CCTCC N0:M208110。該菌株適合發(fā)酵的溫度范圍較廣，耐高糖的能力較好，可以滿足單濃度流加工 藝的要求，同時，還具有發(fā)酵速度快、糖利用率高等特性，適合甘蔗汁為原料的乙醇發(fā)酵。
2、 生產(chǎn)工藝得到了優(yōu)化
通過選育并利用優(yōu)良的發(fā)酵菌株，使得效率更高的單濃度流加工藝得以實現(xiàn)。該工藝相 較現(xiàn)有的雙濃度流加工藝，工藝得到了大大簡化，不但工藝更易于控制，同時還節(jié)省了發(fā)酵 罐的投入，增加了設(shè)備的使用效率，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，并可獲得更高酒精 濃度的發(fā)酵醪，使酒精得率明顯提高。而且，本工藝未采用巴西現(xiàn)行的酵母回用技術(shù)，工藝 流程和操作方法更加簡化。


圖1是CCTCC N0:M208110與釀酒酵母S288C比較的染色體差異圖。 圖2是單濃度流加發(fā)酵制備乙醇工藝流程圖。 保藏信息說明
一種釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae gxas02，真空冷凍干燥保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏單位地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0:M208110，保藏日期為2008年7月19日。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖2，通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不限制本發(fā)明。實施例一20L三聯(lián)發(fā)酵罐甘蔗汁發(fā)酵乙醇小試
1、 液體培養(yǎng)基小量酵母菌種培養(yǎng)
將在YPD平板保藏的CCTCC N0:M208110單菌落接入液體YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度 28°C，過夜培養(yǎng)。
2、 液體培養(yǎng)基擴大酵母菌種培養(yǎng)
以步驟1中的YPD培養(yǎng)液為種子液，按1%的接種量接入處理過的甘蔗汁(添加濃硫酸 調(diào)整pH為3.5 4.0，添加質(zhì)量比為0. 1%的尿素，質(zhì)量比為0.02%的磷酸)，制備得到 500ml甘蔗汁培養(yǎng)液。
3、 20L三聯(lián)發(fā)酵罐甘蔗汁發(fā)酵
以步驟2中的甘蔗汁培養(yǎng)液為種子液，接入含IOL處理過甘蔗汁的1號發(fā)酵罐(容積為 20L)中，進行發(fā)酵，在1號發(fā)酵罐中控制通氣量為100L/h，發(fā)酵溫度3(TC，當菌體數(shù)達到 1.5億個時，開始緩慢流加處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數(shù)，當1號罐體中發(fā)酵液 體積達到16L時，將1號罐與2號罐的接口打開，發(fā)酵液開始進入2號罐，當2號罐體中發(fā) 酵液體積達到16L時，將2號罐與3號罐的接口打開，發(fā)酵液開始進入3號罐，2號、3號 罐發(fā)酵溫度32°C，菌體數(shù)在2億以上，總發(fā)酵時間為12h，發(fā)酵醪成熟，酒度達到8.6 (V/V)，殘?zhí)沁_到0.3g/100ml。
實施例二甘蔗汁發(fā)酵日產(chǎn)10噸乙醇中試
1、 液體培養(yǎng)基小量酵母菌種培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基擴大酵母菌種培養(yǎng)同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發(fā)酵，日產(chǎn)10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養(yǎng)到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發(fā)酵罐(容積為120立方米)中進行發(fā)酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調(diào)整pH為3.0 4.0，添加質(zhì)量比為0.1%的尿素，質(zhì)量比為0.02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發(fā)酵溫度26°C，當菌體數(shù)達到1.5億個時，開始緩慢向1號 罐泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數(shù)不變，當1號罐體中發(fā)酵液液面達到和 2號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入2號 罐，控制菌體數(shù)，當2號罐體中發(fā)酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發(fā)酵液發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入3號罐，待發(fā)酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現(xiàn)有技術(shù)進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發(fā)酵罐上方的管路統(tǒng)一排出。整個過程其余各 罐發(fā)酵溫度28'C，菌體數(shù)在1.5億個以上，總發(fā)酵時間為12 16h，發(fā)酵醪成熟，酒精濃度 達到8.6% (V/V)，殘?zhí)沁_至U 0.3g/100ml。
實施例三甘蔗汁發(fā)酵日產(chǎn)10噸乙醇中試1、 液體培養(yǎng)基小量酵母菌種培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基擴大酵母菌種培養(yǎng)同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發(fā)酵，日產(chǎn)10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養(yǎng)到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發(fā)酵罐(容積為120立方米)中進行發(fā)酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調(diào)整pH為3. 0 4. 0，添加質(zhì)量比為0. 1%的尿素，質(zhì)量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發(fā)酵溫度29°C，當菌體數(shù)達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數(shù)不變，當1號罐體中發(fā)酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入2號 罐，控制菌體數(shù)，當2號罐體中發(fā)酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發(fā)酵液發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入3號罐，待發(fā)酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現(xiàn)有技術(shù)進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發(fā)酵罐上方的管路統(tǒng)一排出。整個過程其余各 罐發(fā)酵溫度3rC，菌體數(shù)在2億以上，總發(fā)酵時間為12 16h，發(fā)酵醪成熟，酒精濃度達到 9.4% (V/V)，殘?zhí)沁_到0.2g/100ml。
實施例四甘蔗汁發(fā)酵日產(chǎn)10噸乙醇中試
1、 液體培養(yǎng)基小量酵母菌種培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基擴大酵母菌種培養(yǎng)同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發(fā)酵，日產(chǎn)10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養(yǎng)到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發(fā)酵罐(容積為120立方米)中進行發(fā)酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調(diào)整pH為3. 0 4. 0，添加質(zhì)量比為0. 1%的尿素，質(zhì)量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發(fā)酵溫度32'C，當菌體數(shù)達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數(shù)不變，當1號罐體中發(fā)酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入2號 罐，控制菌體數(shù)，當2號罐體中發(fā)酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發(fā)酵液發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入3號罐，待發(fā)酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現(xiàn)有技術(shù)進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發(fā)酵罐上方的管路統(tǒng)一排出。整個過程各罐發(fā) 酵溫度34°C，菌體數(shù)在2億以上，總發(fā)酵時間為12 16h，發(fā)酵醪成熟，酒精濃度達到 9.1% (V/V)，殘?zhí)沁_到0.25g/100ml。
實施例五甘蔗汁發(fā)酵日產(chǎn)10噸乙醇中試
1、 液體培養(yǎng)基小量酵母菌種培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基擴大酵母菌種培養(yǎng)同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發(fā)酵，日產(chǎn)10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養(yǎng)到50L后，所得的新鮮種子液接入處理過的含10噸甘蔗汁的發(fā)酵罐(容積為120立方米)中進行發(fā)酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調(diào)整pH為3. 0 4. 0，添加質(zhì)量比為0. 1%的尿素，質(zhì)量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發(fā)酵溫度35'C，當菌體數(shù)達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數(shù)不變，當1號罐體中發(fā)酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入2號 罐，控制菌體數(shù)，當2號罐體中發(fā)酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發(fā)酵液發(fā)酵液由于勢能的驅(qū)動，開始進入3號罐，待發(fā)酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現(xiàn)有技術(shù)進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發(fā)酵罐上方的管路統(tǒng)一排出。整個過程各罐發(fā) 酵溫度37°C,菌體數(shù)在2億以上，總發(fā)酵時間為12 16h,發(fā)酵醪成熟，酒精濃度達到 8.6% (V/V)，殘?zhí)沁_到0.3g/100ml。序列表
〈110〉廣西科學(xué)院
〈120〉一種釀酒酵母菌株及其高效發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的方法 <■ 1 <210> 1 <211〉 575 〈212> DNA
〈213>酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) <400> 1
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權(quán)利要求
1、一種能高效發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的生產(chǎn)菌，分類命名為釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae，菌株號為gxas02，是從酒精廠的排污口中采集分離得到的，真空冷凍干燥保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM208110，保藏日期為2008年7月19日。
2、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)菌，其特征在于所述菌株的26S rDNA Dl/D2區(qū)域具有序列1 所示的核酸序列，與Genbank現(xiàn)有Saccharomyces cerevisiae同一區(qū)域核酸序列同源性均 達到100%。
3、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)菌，其特征在于所述菌株與Genbank上公布的釀酒酵母測序 菌株Saccharomyces cerevisiae S288C在DNA水平上進行比較，有271個基因存在顯著性 差異，其中，23個基因拷貝數(shù)明顯增多，主要集中在第17條.(線粒體)染色體上，248個 基因拷貝數(shù)明顯減少，分布在其余的16條染色體上。
4、 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)菌，其特征在于所述菌株為能耐受高溫和高酒精菌株，其溫 度耐受度為37。C，酒精耐受度體積百分比為20%，葡萄糖耐受度質(zhì)量比為60%。
5、 利用權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)菌發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于生產(chǎn)過程如下 將CCTCC N0:M208110按微生物發(fā)酵常規(guī)液體種子培養(yǎng)方法，即以YPD培養(yǎng)基，即葡萄糖 20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值進行培養(yǎng)，當每毫升培養(yǎng)液含酵母菌數(shù)達 到1.5億個以上時，按1 10%的接種量轉(zhuǎn)接到添加了濃硫酸調(diào)整pH為3.0 4.0并添加質(zhì)量 比0.1%的尿素、質(zhì)量比0.02%的磷酸的甘蔗汁中，并按1 10%的接種比例逐步放大，一 直到可以進行發(fā)酵罐培養(yǎng)，當發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)液滿足流加條件時，即每毫升培養(yǎng)液含酵母 菌數(shù)達到1.5億個以上，開始連續(xù)流加處理過的甘蔗汁進行發(fā)酵，按常規(guī)技術(shù)控制發(fā)酵罐培 養(yǎng)液酵母數(shù)及各發(fā)酵罐的常規(guī)運行參數(shù)， 一直到發(fā)酵醪成熟，然后即可按照常規(guī)技術(shù)進行蒸 餾制取乙醇；發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度控制在26 37。C,發(fā)酵時間為12 16小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一株優(yōu)良釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae gxas02，及利用其為生產(chǎn)菌株，采用甘蔗汁為原料，進行規(guī)模化生產(chǎn)乙醇的方法。該菌株真空冷凍干燥保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM208110，保藏日期為2008年7月19日，經(jīng)鑒定系釀酒酵母，該菌株適合甘蔗汁發(fā)酵乙醇，速度快，殘?zhí)堑?，耐高溫，耐酒精。生產(chǎn)工藝采取單濃度連續(xù)流加工藝，在未使用酵母回用和固定化酵母技術(shù)的條件下，將經(jīng)過壓榨的但未經(jīng)濃縮或稀釋的甘蔗汁直接進行發(fā)酵，在日產(chǎn)10噸乙醇的生產(chǎn)線上，連續(xù)運行，效果良好，發(fā)酵時間為12～16h，酒度達到8.6～9.4(V/V)，殘?zhí)菫?.2～0.3g/100ml。本發(fā)明具有實施方便，設(shè)備利用率高，發(fā)酵醪乙醇濃度高，糖的利用率接近論理值等特點，降低了生產(chǎn)乙醇的成本。
文檔編號C12R1/865GK101434911SQ20081007382
公開日2009年5月20日 申請日期2008年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者妮 關(guān), 楊登峰, 米慧芝, 肖代俊, 琦 陸, 黃志民, 黃日波, 黎貞崇 申請人:廣西科學(xué)院