專利名稱：：農(nóng)作物甲基化差異dna標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種構(gòu)建植物分子標(biāo)記連鎖圖譜的新方法，特別是一種利用甲基化差異的DNA片段作為分子標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜的方法，以及其應(yīng)用于農(nóng)作物輔助育種。
背景技術(shù)：
：DNA甲基化是活體細(xì)胞中最常見的一種DNA共價修飾現(xiàn)象，是在甲基轉(zhuǎn)移酶(甲基化酶)催化下將S-腺苷-甲硫氨酸上的甲基連接到DNA分子腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)堿基上，進(jìn)行DNA修飾的過程。在大多數(shù)真核生物的細(xì)胞中，90%以上的甲基化作用都是發(fā)生在DNA的CpG雙堿基序列處，而且這些序列大部分被對稱地甲基化；在高等植物中，多數(shù)DNA甲基化發(fā)生在CpG二核苷酸對中的胞嘧啶5-碳原子上，但甲基化也常發(fā)生在CAG、CTG三核苷酸中和CCG基元中，常常是對稱發(fā)生的，也有非對稱序列甲基化的報道。DNA的甲基化是生物體中的表觀遺傳現(xiàn)象，即在發(fā)育過程中，雖然基因表達(dá)調(diào)控發(fā)生改變，但核苷酸序列沒有變化，它可以遺傳，也可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)(脫甲基化)。在高等植物中，DNA攜帶著兩種形式的信息，即由核苷酸序列決定的遺傳信息和由它的結(jié)構(gòu)決定的外遺傳信息。外遺傳信息是不處于DNA自身的核苷酸序列中的可影響DNA活性的任何可遺傳的物質(zhì)，能夠控制基因的表達(dá)。DNA甲基化并不改變基因的堿基序列而是通過基因的表達(dá)以改變吝功能。大量研究表明，DNA甲基化不僅可以遺傳，而且存在特定的動態(tài)變化模式。DNA甲基化是調(diào)節(jié)植物基因的一種表達(dá)方式，在基因表達(dá)調(diào)控中扮演了很重要的角色。DNA的甲基化修飾參與基因表達(dá)調(diào)控，胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、基因組印跡、X染色體失活和細(xì)胞記憶等諸多生物學(xué)過程，DNA發(fā)生甲基化可以關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化后又可以重新誘導(dǎo)基因的活化表達(dá)，在植物轉(zhuǎn)基因的研究中，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象均與轉(zhuǎn)基因及其啟動子的甲基化有關(guān)，目前的研究認(rèn)為發(fā)生在轉(zhuǎn)基因啟動子5'端的甲基化是造成轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的主要原因。不同生育期的植物以及植物的不同器官，由于基因表達(dá)模式的不同，會導(dǎo)致基因組總甲基化水平發(fā)生變化。而且不同植物在生長發(fā)育過程中甲基化水平變化的趨勢不同，不同器官間甲基化水平也有差異?；蚣谆Ｊ降母淖兛梢杂绊懼参锏幕ㄆ?、育性、花及葉片的形態(tài)等。找到控制不同器官甲基化差異表達(dá)的基因，可以研究其在植物生長發(fā)育過程中的特定時空表達(dá)和調(diào)控；對DNA甲基化水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)許多植物在雜交種中一些位點(diǎn)與親本相比表現(xiàn)為去甲基化，而另一些位點(diǎn)表現(xiàn)為甲基化水平增加，表明在雜交種中DNA甲基化水平的改變，導(dǎo)致新的基因調(diào)控系統(tǒng)的形成，通過與雜種優(yōu)勢性狀的相關(guān)性分析，可進(jìn)一步研究雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，有利于在早代就選出能產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的親本。DNA甲基化分子標(biāo)記是DNA甲基化水平遺傳變異的直接反映，為研究植物整個基因組甲基化水平的變化，利用甲基化差異的DNA片段作為分子標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜很有意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種具有更直接與基因表達(dá)相關(guān)優(yōu)勢的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建方法，并應(yīng)用于農(nóng)作物輔助育種。從理論上講，根據(jù)植物不同生育期DNA甲基化的差異，可以構(gòu)建不同發(fā)育時期的DNA甲基化圖譜，但通過長期的育種實(shí)踐工作可以發(fā)現(xiàn)，在植物整個基因組中發(fā)生DNA甲基化的敏感部位應(yīng)該大體上是一致的，或者至少范圍不會有太大變化，只是在不同時期，敏感部位發(fā)生甲基化或去甲基化存在著差異。本發(fā)明首先獲得甲基化特異性DNA片斷，然后根據(jù)甲基化差異片段在雜交親本之間的異同及其在雜交、回交等后代群體中的分離狀況，確定這些片段之間以及目的性狀與這些分離片段之間的連鎖強(qiáng)度。尋找與目標(biāo)性狀緊密連鎖的甲基化差異DNA分子標(biāo)記，從而構(gòu)建該時期甲基化敏感的分子標(biāo)記連鎖圖譜。本發(fā)明采用限制性內(nèi)切酶一PCR方法獲得甲基化差異片段。為了能夠檢測到盡可能多的某一發(fā)育階段生物體基因組甲基化位點(diǎn)，必須將DNA基因組完全消化，從而得到完全消化的DNA甲基化差異片段，用于構(gòu)建DNA甲基化的分子標(biāo)記連鎖圖譜。DNA甲基化差異分子標(biāo)記連鎖圖譜既可以利用已有DNA分子標(biāo)記連鎖圖及其上的標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，確定已有圖譜上的標(biāo)記與DNA甲基化差異標(biāo)記間的距離，也可以全部采用DNA甲基化差異多態(tài)性標(biāo)記單獨(dú)構(gòu)建。本發(fā)明將SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，由于其標(biāo)記相對較少，只構(gòu)建出高粱部分染色體連鎖群，與未構(gòu)建的高粱染色體連鎖群相連鎖的甲基化標(biāo)記會單獨(dú)構(gòu)成連鎖群，盡管目前無法確定它們與哪條染色體連鎖，但隨著SSR標(biāo)記數(shù)目的增加，它們會被定位到相應(yīng)的染色體上。選擇較多的錨定引物和甲基化標(biāo)記引物，在材料親本間進(jìn)行基因組多態(tài)性檢測，獲得較多的多態(tài)性標(biāo)記，可以對甲基化遺傳連鎖圖譜進(jìn)行加密和完善。本發(fā)明農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，是采用限制性內(nèi)切酶一PCR方法獲得甲基化差異片段，酶切和連接可同時進(jìn)行，或者分別進(jìn)行；PCR擴(kuò)增方法，可采用預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩步完成，或者一步擴(kuò)增完成。本發(fā)明農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建方法的應(yīng)用，是利用甲基化片段的差異，構(gòu)建分子標(biāo)記的連鎖圖譜，應(yīng)用于育種工作中輔助對優(yōu)良性狀的選擇，應(yīng)用于與甲基化相關(guān)的功能基因的分析克?。粦?yīng)用于分析與作物雜種優(yōu)勢相關(guān)的甲基化標(biāo)記，并進(jìn)一步研究作物雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的分子機(jī)理；可以找到控制不同器官甲基化差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步研究其在植物生長發(fā)育過程中特定時空表達(dá)和調(diào)控；可以找到甲基化熱點(diǎn)區(qū)域，分析植物不同生長發(fā)育階段的甲基化模式，研究生物體表觀遺傳性狀;還可分析轉(zhuǎn)基因作物目的基因表達(dá)沉默的原因。本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)材料是高粱。選取高粱品種中強(qiáng)優(yōu)勢組合B2V4X1383-2，建立其Fi群體及衍生的F2群體。實(shí)驗(yàn)用高粱材料播種于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱所實(shí)驗(yàn)田，出苗后約五周取上部葉子，采用PEX方法提取親本B2V4、1383-2、F,及衍生的&群體120株單株的DNA，測定它們的濃度和純度，稀釋到400ng/ul待用；用^boRI/處al1和1/#印1兩種酶切組合分別對以上高粱材料的DNA基因組進(jìn)行限制性消化，酶切作為整個發(fā)明的第一步，其完成情況直接決定以后的各步實(shí)驗(yàn)和結(jié)果，酶切和連接同時進(jìn)行，37'C反應(yīng)8-10小時；根據(jù)接頭和酶切位點(diǎn)核心序列設(shè)計預(yù)擴(kuò)增引物，對以上高粱材料DNA基因組的酶切連接片斷進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；在預(yù)擴(kuò)增引物3'端加l-3個選擇性堿基作為選擇擴(kuò)增引物，在高粱親本間進(jìn)行基因組多態(tài)性檢測，選用多態(tài)性引物，對高粱親本B2V4、1383-2、雜交種F,及衍生的F2群體中120株高粱材料的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；聚丙烯酰胺凝膠電泳，1%硝酸銀染色，膠干后進(jìn)行帶型統(tǒng)計分析；本實(shí)驗(yàn)中，以SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，高粱10個連鎖群上分別隨機(jī)選取至少10對引物，SSR引物序列從http:〃sorgblast2.tamu.edu獲得，由上海生工生物工程公司合成。本實(shí)驗(yàn)中選取129對Xtxp系列的高粱SSR引物，運(yùn)用作圖軟件，構(gòu)建高粱的SSR分子標(biāo)記連鎖圖譜，以SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，確定現(xiàn)有SSR圖譜上的標(biāo)記與DNA甲基化差異標(biāo)記間的距離，構(gòu)建高粱甲基化差異DNA標(biāo)記的連鎖圖譜，本發(fā)明方法同樣可用于構(gòu)建其他作物的DNA甲基化的分子標(biāo)記連鎖圖譜。實(shí)驗(yàn)證明，利用甲基化差異的DNA片段作為分子標(biāo)記，可以構(gòu)建出植物的甲基化差異片段連鎖圖譜。本發(fā)明利用構(gòu)建的甲基化差異DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜，可以得到與作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和多種抗性等優(yōu)良基因連鎖的甲基化位點(diǎn)，從而能夠?qū)υS多功能基因進(jìn)行分析和克??；利用構(gòu)建的甲基化差異DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜，通過甲基化差異片段的帶型類型的統(tǒng)計與雜種優(yōu)勢性狀的相關(guān)性分析，可以得到與作物雜種優(yōu)勢相關(guān)的甲基化分子標(biāo)記，并可進(jìn)一步研究雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)；利用構(gòu)建的甲基化差異DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜，可以找到控制不同器官甲基化差異表達(dá)的基因，研究其在植物生長發(fā)育過程中的特定時空表達(dá)和調(diào)控；利用構(gòu)建的甲基化差異DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜，通過對不同發(fā)育時期的DNA甲基化片段分析，可以發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)熱點(diǎn)區(qū)域，對生物體表觀遺傳進(jìn)行深入研究，并有助于解釋轉(zhuǎn)基因作物目的基因表達(dá)沉默的原因；利用構(gòu)建的甲基化差異DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜，在育種工作中，還可以利用與目標(biāo)性狀連鎖的甲基化差異DNA標(biāo)記，有利于在早代就選出能產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的親本，由于許多甲基化標(biāo)記直接與基因的表達(dá)相關(guān)，所以在輔助與雜種優(yōu)勢利用為目標(biāo)的親本選擇上會更優(yōu)于其它分子標(biāo)記。本發(fā)明適用于農(nóng)作物構(gòu)建甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜，并在農(nóng)作物輔助育種實(shí)踐中加以應(yīng)用。本發(fā)明與其它分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜比較具有更直接與基因表達(dá)相關(guān)的優(yōu)勢，應(yīng)用前景更廣泛。圖1.高粱甲基化標(biāo)記連鎖圖譜(&OJI/ifepI酶切組合)。圖2.高粱甲基化標(biāo)記連鎖圖譜(fcoRI/〃pall酶切組合)。圖3.高粱SSR標(biāo)記和甲基化標(biāo)記連鎖圖譜(￡cMl/i&pI酶切組合)。圖4.高粱SSR標(biāo)記和甲基化標(biāo)記連鎖圖譜(fcoRI/Wpall酶切組合)。具體實(shí)施例方式(一)選擇實(shí)驗(yàn)材料，建立實(shí)驗(yàn)所需Fi群體及衍生的F2群體。選擇高粱品種中強(qiáng)優(yōu)勢組合B2V4X1383-2，建立其h群體及衍生的F2群體。親本B2V4和1383-2由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱所提供。(二)提取親本及其雜交種R群體及衍生的F2群體的DNA，測定其濃度和純度，稀釋到400ng/ul待用。采用PEX方法提取高粱親本B2V4、1383-2、F,群體及衍生的F2群體中120株高粱的DNA。具體步驟如下(1)樣本葉片在液氮中研磨后收集到2.0ml的離心管中；加入800pi提取緩沖液(PEX12.5mmol/L,TrisCl100mmol/LpH8.0，NaCl700mmol/L，EDTA10纖ol/LpH8.0)，65。C水浴1h。(2)13000rpm離心5min，取上清于新的離心管中，13000rpm再次離心5min;取上清，加入1/10體積醋酸鈉(pH5.2)和lx體積的異丙醇，混勻后置-20°Clh或-75'C15min沉淀DNA。(3)13000rpm離心15min，棄上清，用70%酒精洗沉淀2次。DNA經(jīng)室溫風(fēng)干后加適量lxTE(10mmol/LTrisCl，pH8.0，lmmol/LEDTA，pH8.0)溶解DNA，可65。C助溶15min;13000rpm離心8min，吸出上清。測定其濃度和純度，稀釋到400ng/ul待用。(三)在本實(shí)驗(yàn)中主要是采用限制性內(nèi)切酶-PCR的方法獲得甲基化差異片段，用DNA限制性內(nèi)切酶和與其相對應(yīng)的甲基化特異性同裂酶，分別消化高粱親本B2V4、1383-2、h群體及衍生的F2群體中120株高粱的DNA基因組，并將相應(yīng)的銜接物連接到酶切的DNA片段上。具體步驟如下(1)用fcoRI/處an和&0^1/#印1兩種酶切組合分別對高粱親本B2V4、1383-2、F,群體及衍生的F2群體中120株高粱的DNA基因組進(jìn)行限制性消化^coRI識別切割G4AATTCCTTAAtG位點(diǎn)和#mI識別切割c}cggGGCtC位點(diǎn)對c甲基化敏感，如在ccgg位點(diǎn)上有1個或2個c被甲基化就不能識別和切割，但對半甲基化的mCCGG,能切割(一條鏈)；#砂1對C甲基化不敏感，能切割雙鏈CmCGG，但不能切割mCCGG。(2)在消化的DNA片斷兩端分別連接上與&oRI和^7a//互補(bǔ)的人工接頭I接頭5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，3'-CTGACGCATGGTTAA-5'Hpall/Mspl接頭5，-GACGATGAGTCCTGAG_3，3'-TACTCAGGACTCGC-5'(3)酶切和連接一步完成，也可以分成兩步完成。對于每份高粱DNA樣品，同時設(shè)置&0///處3//和fco///#邵/兩種酶切體系。12.5ul的反應(yīng)體系包含400ng樣品DNA、1XT4DNA連接酶Buffer(含lmmol/LATP)、2.5ugBSA、各50pmol/L^b。yI(處a//)接頭、各3ufcoyI和MspI你pa/"內(nèi)切酶、1.5uT4DNA連接酶。37'C反應(yīng)8-10小時。(四)PCR擴(kuò)增可以采用預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩步完成，也可以一步擴(kuò)增完成。在本實(shí)驗(yàn)中分為兩步。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)接頭和酶切位點(diǎn)核心序列設(shè)計引物對以上高粱基因組酶切連接片斷進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增fco)I(E)拳ll/ifepl(HM)預(yù)擴(kuò)增引物5，-GACTGCGTACCMTTC-3，(E00)5，-GATGAGTCCTGAGCGGC-3，(HM01)PCR預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?4°C，1分鐘；94°C，30秒；56'C，1分鐘；72°C，1分鐘，擴(kuò)增20個循環(huán)，然后1(TC,12分鐘。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，用于選擇性擴(kuò)增。(五)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)預(yù)擴(kuò)增引物設(shè)計選擇性擴(kuò)增引物，在預(yù)擴(kuò)增引物3'端加上1-3個選擇性堿基，作為選擇性擴(kuò)增引物。選擴(kuò)增引物5，-GACTGCGTACCAATTC-3，5，-GATGAGTCCTGAGCGG-3，1MC(E32)CAA(HMll)2AAG(E33)CAC(HM12)3ACC(E36)CAG(HM13)4CAT(腿4)5CTA(腿5)6CTC(HM16)7CTG(腿7)PCR選擴(kuò)增程序?yàn)?4°C，2分鐘；94°C，30秒；65°C，30秒；72°C，1分鐘，擴(kuò)增12個循環(huán)(每循環(huán)一次降0.7。C)，然后94。C，30秒；56°C，30秒；72°C，1分鐘，返回第六步，23個循環(huán)，72。C延伸5分鐘。(六)聚丙烯酰胺凝膠電泳在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.025%溴酚藍(lán)，0.025%二甲苯青)樣品94。C變性5min后立即置于冰上用5%的變性聚丙烯酰胺凝膠,恒功率80W電泳1h后，取5uL樣品上樣，恒功率80W電泳2h后，1%硝酸銀染色，膠干后進(jìn)行帶型統(tǒng)計分析。(七)帶型統(tǒng)計在高粱實(shí)驗(yàn)中，以親本的帶為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計雜交種F,及其衍生的F2材料的帶型。最初實(shí)驗(yàn)記錄中，有帶的記錄為1，無帶的記錄為O，不同酶切組合分別登記，為了便于應(yīng)用作圖軟件，在軟件分析中把與1383-2帶型相同的變更為C，與B2V4帶型相同的變更為D，缺失或模糊的帶型用表示。(八)篩選多態(tài)性引物在高粱親本間進(jìn)行基因組多態(tài)性檢測。H代表AcoRI/^^n酶切組合所得到的帶，M代表^coyI/i&;7l酶切組合所得到的帶。觀察同一酶切組合中親本和雜交種F,的帶型，如該帶型在親本B2V4和1383-2間有差異，就視為多態(tài)性引物。不同引物組合可以產(chǎn)生不同的帶型，帶型類型如下圖所示(有帶的記為l，無帶的記為0):表1.多態(tài)性引物篩選舉例<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(十)運(yùn)用Mapmaker/EXP3.0軟件，構(gòu)建遺傳圖譜在本實(shí)驗(yàn)中，我們從巳發(fā)表高粱遺傳連鎖圖譜(http://sorgblast2.tamu.edu)中的每個連鎖群上隨機(jī)選取10對以上SSR標(biāo)記，本實(shí)驗(yàn)共選取129個Xtxp系列SSR引物，將這些SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記確定本研究中甲基化標(biāo)記在各連鎖群中的位置。SSR標(biāo)記譜帶記作A、B、H和"-"。來自母本B2V4的帶記為A，來自父本1383-2的帶記為B，雜合型的(父母本帶同時出現(xiàn))記為H，與父母本帶相異的記為OFF,沒有擴(kuò)增出來或缺失數(shù)據(jù)記為"-"。應(yīng)用Mapmaker/Exp(Version3.0)進(jìn)行連鎖分析后，得到高粱的SSR連鎖圖譜。選取不同酶切組合中多態(tài)性標(biāo)記所得的數(shù)據(jù)，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)進(jìn)行連鎖分析，得到甲基化標(biāo)記(fco/I/i&pI和^boRIA^alI酶切組合)構(gòu)建的高粱甲基化圖譜(圖l、圖2)，與圖3，圖4中共有的標(biāo)記用黑體標(biāo)出，由于選用SSR引物多態(tài)性不高，不能很好的覆蓋高粱染色體連鎖群，部分甲基化標(biāo)記未能與本實(shí)驗(yàn)中SSR標(biāo)記相連鎖，不能確定其屬于那個連鎖群。在圖1和圖2中以SBI-i(M)、SBI-ii(H)、SBI-iii(H)、SBI-iv(H)、SBI-v(H)和SBI-vi(H)標(biāo)出該六個連鎖群，隨著SSR標(biāo)記的增加，它們會被連鎖到相應(yīng)的染色體上。根據(jù)高粱的SSR連鎖圖譜，其上的標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，選取其數(shù)據(jù)與不同酶切組合中多態(tài)性標(biāo)記所得的數(shù)據(jù)，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)進(jìn)行連鎖分析，確定已有圖譜上的SSR標(biāo)記與甲基化差異標(biāo)記間的遺傳距離，得到SSR標(biāo)記和甲基化標(biāo)記(fco/IAJfe/I和fcoRI/^oalI酶切組合)構(gòu)建的高粱甲基化連鎖圖譜(圖3，圖4)，其中SSR標(biāo)記用黑體標(biāo)出。在圖3中SBI-08連鎖群上只有SSR標(biāo)記，甲基化標(biāo)記未與其相連鎖；在圖4中，只有SBI-01(H)、SBI-02-l(H)、SBI-02-2(H)和SBI-05(H)這四個連鎖群上既有SSR標(biāo)記又有甲基化標(biāo)記，其余的連鎖群均只有SSR標(biāo)記，甲基化標(biāo)記未與其相連鎖。在圖3中，觀察發(fā)現(xiàn)在引物Xtxp96附近出現(xiàn)較密集的甲基化位點(diǎn)，可以說明該引物附近就是甲基化敏感區(qū)域，研究定位在甲基化敏感區(qū)域的特定基因，可以分析與高粱優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和多種抗性等優(yōu)良基因連鎖的甲基化位點(diǎn)，從而能夠?qū)υS多功能基因進(jìn)行分析和克隆，甲基化熱點(diǎn)區(qū)域的發(fā)現(xiàn)有助于對生物體表觀遺傳進(jìn)行深入研究。權(quán)利要求1、一種農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，其特征是首先獲得甲基化特異性DNA片斷，然后根據(jù)甲基化差異片段在雜交親本之間的異同及其在雜交、回交等后代群體中的分離狀況，確定這些片段之間以及目的性狀與這些分離片段之間的連鎖強(qiáng)度；尋找與目標(biāo)性狀緊密連鎖的甲基化差異DNA分子標(biāo)記，從而構(gòu)建該時期甲基化敏感的分子標(biāo)記連鎖圖譜。2、如權(quán)利要求1所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，其特征是采用限制性內(nèi)切酶一PCR方法獲得甲基化差異片段。3、如權(quán)利要求1或2所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，其特征是將DNA基因組完全消化，從而得到完全消化的DNA甲基化差異片段，用于構(gòu)建DNA甲基化的分子標(biāo)記連鎖圖譜。4、如權(quán)利要求1或2所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，其特征是酶切和連接可同時進(jìn)行，或者分別進(jìn)行。5、如權(quán)利要求1或2所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法，其特征是PCR擴(kuò)增方法，可采用預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩步完成，或者一步擴(kuò)增完成。6、如權(quán)利要求1所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征是可利用甲基化片段的差異，構(gòu)建分子標(biāo)記的連鎖圖譜，應(yīng)用于育種工作中輔助對優(yōu)良性狀的選擇。7、如權(quán)利要求1所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征是應(yīng)用于與甲基化相關(guān)的功能基因的分析克隆。8、如權(quán)利要求6所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征是可應(yīng)用于分析與作物雜種優(yōu)勢相關(guān)的甲基化標(biāo)記，并進(jìn)一步研究作物雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的分子機(jī)理。9、如權(quán)利要求6所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征是可以找到控制不同器官甲基化差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步研究其在植物生長發(fā)育過程中特定時空表達(dá)和調(diào)控。10、如權(quán)利要求6所述的農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征是能夠找到甲基化熱點(diǎn)區(qū)域，分析植物不同生長發(fā)育階段的甲基化模式，研究生物體表觀遺傳性狀，分析轉(zhuǎn)基因作物目的基因表達(dá)沉默的原因。全文摘要一種農(nóng)作物甲基化差異DNA標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，目的是具有更直接與基因表達(dá)相關(guān)優(yōu)勢并應(yīng)用于農(nóng)作物輔助育種。本發(fā)明首先獲得甲基化特異性DNA片斷，然后根據(jù)甲基化差異片段在雜交親本之間的異同及其在雜交、回交等后代群體中的分離狀況，確定這些片段之間以及目的性狀與這些分離片段之間的連鎖強(qiáng)度；尋找與目標(biāo)性狀緊密連鎖的甲基化差異DNA分子標(biāo)記，從而構(gòu)建該時期甲基化敏感的分子標(biāo)記連鎖圖譜，這一方法可用于育種中輔助對優(yōu)良性狀的選擇。文檔編號C12Q1/68GK101353703SQ20081007937公開日2009年1月28日申請日期2008年9月10日優(yōu)先權(quán)日2008年9月10日發(fā)明者儀治本,毅孫,梁小紅,段永紅,錦錢,敏閆申請人:山西大學(xué)