專利名稱：PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的擴(kuò)增引物及其檢測(cè)試劑盒和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及禽類源性成分的檢測(cè)，主要涉及使用PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分。
背景技術(shù)：
瘋牛病、禽流感、羊搔癢病在世界各地的蔓延和傳染給人類的事例，引起了各國(guó)政 府和消費(fèi)者對(duì)肉食品、詞料安全性的高度關(guān)注。目前畜禽肉食品的動(dòng)物源性成分的鑒別 檢測(cè)已涉及到肉食品的工業(yè)、進(jìn)出口貿(mào)易、市場(chǎng)及餐飲業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外肉食品 及詞料貿(mào)易市場(chǎng)中的檢驗(yàn)檢疫工作對(duì)高新技術(shù)的需求也越來(lái)越迫切。因此，研究出一種 準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別總禽源性成分的方法，就非常有必要。目前，為了確定食物及飼料的真實(shí)性，已經(jīng)開發(fā)了很多對(duì)動(dòng)物源性成分鑒別的方法， 有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。在分子生物學(xué)方法中，分子標(biāo)記技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點(diǎn)顯示出巨 大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。目前在動(dòng)植物源性成分鑒別檢測(cè)中應(yīng)用的分子標(biāo)記主 要包括核DNA 、 RNA、線粒體DNA (mtDNA)、和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記等。PCR分子標(biāo)記 鑒別檢測(cè)技術(shù)，具有特異性高、針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、對(duì)檢測(cè)樣品要求低(幾 乎所有的樣本都可以作為PCR的材料，它只要求樣本中有完整的靶序列核酸)，因此， 無(wú)論是經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)途運(yùn)輸或低溫保存多年的陳舊樣本，都可以用于PCR擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物和禽類mtDNA在遺傳上相對(duì)獨(dú)立，是雙鏈的超螺旋環(huán)狀分子，具有基因 組小(約16kb)、沒有重復(fù)序列、生物個(gè)體內(nèi)無(wú)組織特異性、每個(gè)細(xì)胞中含有大量線粒 體基因組(哺乳動(dòng)物約1000 2300個(gè)拷貝)等特點(diǎn)。因此，用mtDNA分子標(biāo)記鑒別畜 禽肉食品及詞料動(dòng)物源性成分與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、快 速、降解小(加工過(guò)程中mtDNA保持較完整)、穩(wěn)定易操作等優(yōu)勢(shì)?；趧?dòng)物mtDNA 的PCR分子標(biāo)記技術(shù)的上述特點(diǎn)，因此在動(dòng)物源性成分鑒別檢測(cè)中的應(yīng)用具有廣闊的 前景。國(guó)外已對(duì)牛、綿羊、豬、雞的源性成分進(jìn)行了研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)對(duì)牛、綿羊、豬、雞、 驢、馬、鹿屬進(jìn)行了研究報(bào)道。在用分子生物學(xué)方法鑒定檢測(cè)動(dòng)物源性成分的研究上， 國(guó)內(nèi)外尚未見到對(duì)總禽源性成分鑒別檢測(cè)的研究報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的擴(kuò)增引物及其特異性引物的擴(kuò)增條件。本發(fā)明的另一目的是提供一種PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的檢測(cè)試劑盒。 本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的檢測(cè)試劑盒的使用方法。以準(zhǔn)確、快速、可靠的用PCR-mtDNA技術(shù)鑒別總禽源性成分。 本發(fā)明的目的可以通過(guò)采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種用于檢測(cè)總禽源性成分的 特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其主要特點(diǎn)是上下游長(zhǎng)度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC陽(yáng)3'; 下游引物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'。所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，還包括有所述的特 異性引物的擴(kuò)增條件為用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，94"C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn) 入PCR循環(huán)94。C變性30sec， 54'C退火30sec， 72'C延伸20sec，設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后 72'C延伸3min。所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測(cè)的試劑盒，包括有① 10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20 ,L/L;②dNTP ,其中2. 5畫L/L ;③上游引物PF， 其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，2U/l^L;⑥滅菌超純水；⑦ DNA模板。所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測(cè)的試劑盒的使用方法， 其主要特點(diǎn)是包括有如下步驟.-(1) 待檢物DNA的提??；(2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權(quán)利要求2的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。含有總禽源性成分的檢測(cè)物被引物PF+PR 擴(kuò)增出DNA特異性片段,呈陽(yáng)性。所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢領(lǐng)啲試劑盒的使用方法，所述的DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測(cè)物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入500^1 細(xì)胞裂解液消化；② 加入蛋白酶Kl(Hd，濃度為20mg/ml慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化過(guò)夜，適時(shí)混勻多次；③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液； 4°C13000rpm/min離心10min，從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動(dòng)，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色， 中間有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)。用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成 大于3mm的口，使孔徑變大，以免核酸通過(guò)吸頭時(shí)發(fā)生機(jī)械剪切)小心吸出上 層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面；⑤加入RNase3ul ，濃度為1.5ul /ml，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿:異戊醇，其比例為25:24:1，溫和的混 勻兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液；(Z)重復(fù)步驟④；⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提；⑨ 重復(fù)步驟④；⑩ 在水相中加入1/10體積的3MNaAc混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙 醇，棄上清液；0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min; 加入3(^1 TE緩沖液，室溫放置24h，然后4'C保存?zhèn)溆谩?CZ)重復(fù)步驟④；本發(fā)明的有益效果是，近年來(lái)隨著數(shù)個(gè)國(guó)家高致病性禽流感的相繼發(fā)生，除雞以外 己波及到人、天鵝、貓等的死亡，因感染禽流感而致死的人數(shù)不斷增加，禽類食品和飼 料的安全性已關(guān)系到人類的安危。因此，研究出準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別禽類動(dòng)物源性 成分的方法和技術(shù)，對(duì)有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現(xiàn)實(shí) 意義。本研究以滅菌超純水對(duì)禽類DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，能檢測(cè)到的最低濃度為120pg/ul,即該引物的靈敏度 是120pg/ul。


圖1為鵪鴉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓聘、牛、羊、馬、驢、魚動(dòng)物的基因組DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果圖；圖2為含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚飼料基因組 DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果圖；圖3總禽的特異性弓l物驗(yàn)證圖；圖中2kb Marker; DNA:1:鵪鶴；2:鵒3:雞；4鴨；5:鵝；6:鴕鳥；7: 鷓鴣；8:牛；9 :羊；10:馬；11:驢；12:魚；13:空白對(duì)照。 圖4含動(dòng)物源性成分飼料的特異性引物驗(yàn)證圖；圖中2kb Marker; DNA:1:鵪享鳥；2:鵒3:雞；4鴨；5:鵝；6:鴕鳥；7: 鷓鴣；8:牛；9 :羊；10:馬；11:驢；12:魚；13:空白對(duì)照。圖5總禽特異性PCR靈敏度驗(yàn)證結(jié)果檢測(cè)電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述 實(shí)施例l:對(duì)鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚動(dòng)物和含鵪 鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚源性成分飼料檢測(cè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。(1) 總DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、 魚動(dòng)物的基因組DNA和含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、 魚源性成分飼料DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果(如圖l、 2)。提取基因組DNA均經(jīng)紫外分光光 度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。測(cè)定OD260/OD280值均為1.8左右，說(shuō)明DNA純度較高符合 PCR擴(kuò)增要求。(2) PCR-mtDNA特異性引物的設(shè)計(jì)比較GenBank中公布的各種動(dòng)物線粒體基因序列，依據(jù)其物種保守序列設(shè)計(jì)出鑒別 檢測(cè)總禽源性成分的PCR特異性引物(只能擴(kuò)增出總禽DNA限制性片段，而擴(kuò)增不出 其它哺乳動(dòng)物DNA限制性片段)，引物如下上游引物 PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游弓l物 PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3';擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為208—215bp。 (3)總禽引物的特異性驗(yàn)證利用所設(shè)計(jì)的總禽特異性引物PF和PR，分別對(duì)鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓 鴣、牛、羊、馬、驢、魚等動(dòng)物組織DNA和含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、 羊、馬、驢、魚源性成分飼料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3.1) 10XPCR緩沖液(含Mg"20 mmoL/L) 2. 5|4; dNTP (2.5國(guó)L/L) , 0.5|4; 上游引物PF (25pmoL/L) 1. 0W; 下游弓I物PR (25pmoL/L) LOW; T叫酶(2U/MU 0.5^1; DNA模板 1.014; 加滅菌超純水至25Pl。(3.2) PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸3min。 原理1) 模板DNA的變性模板DNA經(jīng)力B熱至94。C5min后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò) 增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；2) 模板DNA與引物的復(fù)性模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至57。C，弓|物 模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3) 引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反 應(yīng)原料，耙序列DNA序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-復(fù)性-延伸三個(gè)過(guò)程，就可獲得更多的"半 保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。從擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖(圖3、 4)可以看出，只能從鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、 鷓鴣的DNA模板和含鵪鵓、鴿、雞、ff鵝、鴕鳥、鷓鴣源性成分飼料DNA中擴(kuò)增出 大小約為210bp的片段，與預(yù)期目的片段大小基本一致，而哺乳動(dòng)物和魚擴(kuò)增結(jié)果均無(wú) 擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。 (4)引物的準(zhǔn)確性驗(yàn)證用總禽引物分別擴(kuò)增雞、鴨、鴿、鵝、鵪鶉、鴕鳥、鷓鴣DNA，其PCR-mtDNA產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如下(4. 1)擴(kuò)增雞DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatag c 211 該序列長(zhǎng)度為211bp，與GenBank中序列比較分析表明，與雞線粒體DNA的12sRNA 基因區(qū)段序列完全一致，符合率達(dá)到99%。(4.2) 擴(kuò)增鴨DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc180 accccgctaa taagacaggt caaggtatag c 211 該序列長(zhǎng)度為211bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鴨線粒體DNA的12sRNA 基因區(qū)序列完全一致，符合率達(dá)到100%。(4.3) 擴(kuò)增鵒DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca120gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt atagc 215 該序列長(zhǎng)度為215bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鴿線粒體DNA的12sRNA 基因區(qū)段序列完全一致，符合率達(dá)到94%。(4.4) 擴(kuò)增鵝DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaatc gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180 ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc 210該序列長(zhǎng)度為210bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵝線粒體DNA的12sRNA 基因區(qū)段序列完全一致，符合率為100%。(4.5) 擴(kuò)增鵪鶉DNA產(chǎn)纟勿測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208 該序列長(zhǎng)度為208bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵪鶉線粒體DNA的 12sRNA基因區(qū)段序列完全一致，符合率為100%。(4.6) 擴(kuò)增鴕鳥DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatc gataatccac gattcaccca accacccctt gccatgcagc 120ctacataccg ccgtcgccag cccgcctcat gagagaacaa tagcgagcac aatagcccac 180ccgctaacaa gacaggtcaa ggtatagc 208 該序列長(zhǎng)度為208bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鵪鶉線粒體DNA的 12sRNA基因區(qū)段序列完全一致，符合率達(dá)到99%。(4.7) 擴(kuò)增鷓鴣DNA產(chǎn)物測(cè)序序列agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctataatcgataatccacgattcaccca accatccttt gccaacacag 120cctacatacc gccgtcgcca gctcacctcc aatgaaagag caacagtgag cccaacagtc 180tccactaata agacaggcaa aggtatagc 209該序列長(zhǎng)度為209bp，與GenBank中序列比較分析表明，與鷓鴣，藍(lán)孔雀等33條 鳥類線粒體DNA的12sRNA基因區(qū)段序列完全一致，符合率達(dá)到93%。以上測(cè)序結(jié)果的分析表明所建立的禽類源性成分PCR-mtDNA檢測(cè)技術(shù)具有準(zhǔn)確 性、特異性、可靠性。 (6)特異性PCR的靈敏度驗(yàn)證以滅菌超純水對(duì)目標(biāo)禽類的DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后用總禽特 異性引物PF和PR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖(圖3)可知，能檢測(cè)到的 最低線為120pgM,即該引物的靈敏度是120pg/ul。實(shí)施例2:對(duì)含有禽類源性成分的飼料的PCR檢測(cè)方法。分別對(duì)含有含鵪鶉、鴿、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、驢、魚源性成 分飼料進(jìn)行檢測(cè)。 (一)提取跳采用酚氯仿抽提法(參照"分子克隆試驗(yàn)指南(第二版).北京科學(xué)出版 社，1995:34 60")① 稱取0.03g研碎的待檢測(cè)物樣品于高壓滅菌后的L5ml離心管中，加入50(^1 細(xì)胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/ml)l(Vl，慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于50'C水浴中消化過(guò)夜，適時(shí)混勻多次；③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液；④4。C13000rpm/min離心10min;小心從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動(dòng)，可見 有清晰的分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相，一 般為黃色，中間可見有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)。用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成大于3mra的口，使孔徑變大，以免核酸通過(guò)吸頭時(shí)發(fā)生機(jī)械剪切) 小心吸出上層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase (1%) 3 u 1 (1. 5 u 1 /ml)，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1)溫和的混勻兩相，振 蕩2min，形成均勻乳濁液；⑦ 重復(fù)步驟④；⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提； 重復(fù)步驟 ;⑩在水相中加入1/10體積的3M醋酸鈉混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無(wú)水 乙醇，棄上清液；@用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min;⑩加入30ri TE緩沖液，室溫放置24h，然后4"C保存?zhèn)溆谩?二) 引物合成將上游引物PF(18bp): 5'-AGAACTACGAGCACAAAC-3';下游引物PR(19bp): 5'-GCTATACCTTGACCTGTCT-3'送往生物公司合成，每條引物各20D ，用時(shí)稀釋到 25pmol/L。(三) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)試劑盒10XPCR緩沖液(含Mg"20 mmoL/L)2. 5W;d證(2. 5 ,L/L)0.PF (25pmoL/L)PR (25praoL/L)1. 014Taq酶(2U/叱)0.514DNA模板加滅菌超純水至25W。將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合。 PCR反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循環(huán)94'C變性30sec， 54。C退火30sec, 72'C延伸20sec，設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸3min。(四) 電泳檢測(cè) ' PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖(見圖4)(五) 檢測(cè)結(jié)果含有禽類源性成分的檢測(cè)物會(huì)被引物PF+PR擴(kuò)增出DNA特異性片段，呈陽(yáng)性。 實(shí)施例3:基因組DNA的提取試劑的制備(1)細(xì)胞裂解液的制備① 1M Tris-HC1 250mL:稱30.285gTris，加水定容至250mL，加HC1調(diào)解pH至8. 0，高壓滅菌，4'C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL雙蒸水中加入37. 22g EDTA-Na2. 2H20,劇烈攪拌，用Na0H調(diào)節(jié)pH至8. 0 (約需4gNaOH)，定容至200 raL，分裝后高壓滅菌，4'C保存。③ 10% (m/v) SDS:將10g SDS溶于90mL雙蒸水中，加熱至68°C (助溶幾滴濃HC1， pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分裝備用，室溫保存，無(wú)須滅菌。取lmol/L的Tris-HCl (pH8. 0) 2mL、0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、10% (m/v) 的SDS 10mL，加滅菌雙蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制備100mg蛋白酶K溶于5ml滅菌雙蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿異戊醇(24:1):按24: 1的體積將氯仿、異戊醇混合，置棕色瓶中4'C 保存。(4) 苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)的制備:按25: 24: 1的體積將苯酚、氯仿、 異戊醇混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3麗aAc的制備稱取40. 8gNaAc. 3H20，溶解，加水至100mL。高壓滅菌15min ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制備稱取RNase A lOmg溶于10ramol/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IOO'C加熱煮沸15min滅活DNase，緩慢冷卻至室溫，分 裝成小份保存于一2(TC。如為Sigma公司產(chǎn)品， 一般則不需加熱煮沸。序列表〈110〉張利平 張慧霞〈120〉 PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分的擴(kuò)增引物及其檢測(cè)試劑盒和使用方法 〈160〉 7〈210〉 1 〈211〉 211 〈212〉 DNA〈213〉擴(kuò)增雞DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataatcgataatccac gattcaccca accacccctt gccagcacag 120 cctacataccgccgtcgcca gcccacctct aatgaaagaa caacagtgag ctcaatagcc 180 cctcgctaat aagacaggtc aaaggtatagc 211〈210〉 2 〈211〉 211 〈212〉腿〈213〉擴(kuò)增鴨DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccta aacccaccta 60gaggagcctg ttctgtaatc gatgatccac gatcaaccca accgcccctt gccaagcaca 120gcctacatac cgccgtcgcc agcccacctc gaatgagagc gcaacagtgg gcgcaacagc 180accccgctaa taagacaggt caaggtatagc 211〈210〉 3 〈211〉 215 〈212〉 DNA〈213〉擴(kuò)增鵒DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aatccaccta '60gaggagcctg ttctgtaatc gatactccac gatacacccg accacttctt gccatggaca 120 gcctacatac cgccgtcgcc agctcacctc ctctgagagc actacagtga gcacaaccgc 180 cctaaccccg ctaacaagac aggtcaaggt' atagc 215〈210〉 4 〈211〉 210 〈212〉隨〈213〉擴(kuò)增鵝DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60gaggagcctg ttctacaate gataatcccc gattaacccg accacccctt gccagcacag 120cctacatacc gccgtcgcca gcccacctcg aatgagagaa caacagtgga cacaatagca 180ccccgctaat aagacaggtc aaggtatagc, 210〈210〉 5 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉擴(kuò)增鵪鶉DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60 gaggagcctg ttctataacc gataatccac gatctaccca accacccctt gccaacacag 120 cctacatacc gccgtcgcca gcccacctta atgaaagaac aacagtgagc tcaatagccg 180 ccactaataa gacaggtcaa ggtatagc 208〈210〉 6 〈211〉 208 〈212〉 DNA〈213〉擴(kuò)增鴕鳥DNA產(chǎn)物測(cè)序序列 〈400〉agaactacga gcacaaacgc ttaaaactct aaggacttgg cggtgcccca aacccaccta 60<formula>formula see original document page 16</formula>
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其特征是上下游長(zhǎng)度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列如下上游引物PF5′-AGAACTACGAGCACAAAC-3′；下游引物PR5′-GCTATACCTTGACCTGTCT-3′。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其特 征是還包括有所述的特異性引物的擴(kuò)增條件為9fC預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn) 入PCR循環(huán)94。C變性30sec， 54。C退火30sec， 72'C延伸20sec，設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)， 最后72'C延伸3min。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測(cè)的試劑盒，其特征是包括有①10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 腿oL/L;③上游引物PF，其中25pmoL/L;④下游引物PR，其中25pmoL/L;⑤Taq 酶，2U/PL;⑥滅菌超純水；⑦DNA模板。
4. 如權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測(cè)的試劑盒的使用方法，其特征是包括有如下步驟(1) 待檢物DNA的提?。?2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權(quán)利要求2的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，含有總禽源性成分的檢測(cè)物被引物PF+PR 擴(kuò)增出DNA特異性片段,呈陽(yáng)性。
5. 如權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測(cè)的試劑盒的 使用方法，其特征是所述的DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測(cè)物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入50(^1 細(xì)胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10^U，濃度為2amg/ml慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于50'C水浴中消化過(guò)夜，適時(shí)混勻多次；③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液；④4ri3000卬m/min離心10min，從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動(dòng)，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色，中間有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)，用大口的tip頭吸出上層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase3u 1 ，濃度為1. 5u 1 /ml，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇，其比例為25:24:1，溫和的混勻兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液； 重復(fù)步驟 ; 加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提； 重復(fù)步驟④；⑩在水相中加入1/10體積的3麗aAc混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙 醇，棄上清液；(0)用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min;⑩加入30W TE緩沖液，室溫放置24h，然后4。C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明主要涉及禽類源性成分的檢測(cè)，主要涉及使用PCR-mtDNA檢測(cè)總禽源性成分。一種用于檢測(cè)總禽源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其主要特點(diǎn)是上下游長(zhǎng)度分別為18bp和19bp的核苷酸，序列為上游引物PF(18bp)5’-AGAACTACGAGCACAAAC-3’；下游引物PR(19bp)5’-GCTATACCTTGACCTGTCT-3’。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別禽類動(dòng)物源性成分的方法和技術(shù)，對(duì)有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以滅菌超純水對(duì)禽類DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，能檢測(cè)到的最低濃度為120pg/ul，即該引物的靈敏度是120pg/ul。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101270392SQ20081008240
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者吳建平, 卉 宗, 張利平, 張慧霞, 李麗娟, 阮周曦 申請(qǐng)人:張利平;張慧霞