專利名稱：增加骨礦化的組合物和方法
技術領域：
一般地，本發(fā)明涉及藥物學產品和方法，更具體地，本發(fā)明涉及適用 于增加骨礦質含量的方法和組合物。這些組合物和方法可用以治療多種 疾病，包括例如骨質減少、骨質疏松癥、骨折和其它以低骨礦質密度為 特征的疾病。
背景技術：
在一個個體的一生中會出現(xiàn)兩或三個明顯的骨質(bone mass)改變 期(見Riggs， West J. Med. 154: 63-77， 1991)。第一期在男性和女 性中均會出現(xiàn)，并持續(xù)至達到峰值骨質。此第一期通過軟骨內生長板的 線性生長和由于骨膜對合(periosteal apposition)的速度引起的徑向 生長來實現(xiàn)。對于小梁骨(扁骨例如推骨和骨盆)，第二期開始于大約30 歲，對于皮質骨(例如肢體中的長骨)則開始于大約40歲，并持續(xù)到老 年。此期的特征在于緩慢的骨丟失，并且在男性和女性中均會發(fā)生。在 女性中，還會出現(xiàn)骨丟失的第三期，其原因極可能是絕經后的雌激素缺 乏。僅在此期，女性可再從皮質骨丟失10%的骨質，從小梁區(qū)室丟失25% 的骨質(見Riggs,同上)。
骨礦質含量的丟失可以由多種情況引起，并可以導致嚴重的醫(yī)學問 題。例如，骨質疏松癥是一種使人衰弱的疾病，其特征在于患病個體中 骨骼骨質和礦質密度的明顯降低，骨的結構退化包括骨微體系結構 (microarchitecture)的降解，和相應的骨脆性以及骨折易發(fā)性的增加。 人類的骨質疏松癥是由臨床上的骨質減少(比年輕成年骨的骨礦質密度 平均值低一個以上至2.5個以下標準差的骨礦質密度)發(fā)展來的，在美 國有大約2千5百萬人患有骨質減少病。在美國另外有7-8百萬名患者 已被診斷患有臨床骨質疏松癥(定義為比成熟的年輕成年骨的骨礦質含量平均值低2.5個以上標準差的骨礦質含量)。對于健康護理系統(tǒng)而言， 骨質疏松癥是花費最大的疾病之一，在美國每年花費幾百億美元。除了 健康護理相關的費用外，長期的居住護理和工作日損失也增加了該疾病 的經濟和社會耗費。全球大約7千5百萬人有患骨質疏;松癥的危險。
在人類群體中骨質疏松癥的頻率隨年齡的增加而增加，在高加索人中 女性的骨質疏松癥頻率尤為突出(在美國，女性骨質疏松癥患者占骨質 疏松癥總患者的80%)。老年人骨錄骨脆性和骨折易發(fā)性的增加由于該群 體有較高的意外跌倒危險性而變得更為嚴重。在美國每年有超過1.5百 萬的骨質疏松相關骨折的報道。髖骨、腕和推骨骨折是骨質疏松相關的 最常見損傷。尤其是髖骨骨折對于患者而言是極為不便和費錢的，而且 對于婦女髖骨骨折與高死亡率和發(fā)病率相關。
盡管骨質疏松已被確定為由于骨質降低引起的骨折危險性提高，但現(xiàn) 有的骨骼疾病治療方案尚不能相當大程度地增加成年人的骨密度。所有 的醫(yī)師都強烈體會到需要能夠增加成年人骨密度的藥物，尤其是增加易 于發(fā)生骨質減少和骨質疏松的腕骨、脊柱骨和髖骨的骨密度的藥物。
目前防止骨質疏松的策略可以給個體提供一些益處，但不能確保消除 該疾病。這些策略包括隨著高齡的開始要節(jié)制身體活動(尤其是負重活 動)，在飲食中包括充足的鈣，并避免食用含酒精或煙草的產品。對于 表現(xiàn)為臨床骨質減少或骨質疏松的患者，所有目前的治療藥物和策略均 旨在通過抑制骨吸收進程來減少骨質的進一步喪失，骨吸收是組成型發(fā) 生的骨重塑過程中的一個天然組成部分。
例如，目前雌激素被用來延緩骨損失。然而，就是否對患者有長期益 處和是否對75歲以上的患者有作用，有一些爭議。而且，雌激素的使用 被認為會增加患乳腺癌和子宮內膜癌的危險性。
高劑量的食物鈣加上或不加維生素D也被建議用于絕經后的婦女。然 而，高劑量鈣經常會有令人不快的胃腸道副作用，而且必須對血清和尿 的鈣水平進行持續(xù)監(jiān)測(見Khosla和Rigss， Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995)。
其它建議使用的治療方法包括使用降釣素、二膦酸酯(bisphosphonate)、促蛋白合成笛類和氟化鈉。然而，這些治療方法 均有可能妨礙其使用的不良副作用(例如，盡管骨密度獲得適度增加， 但降鈣素和甾類會引起惡心并激發(fā)免疫反應，二膦酸酯和氟化鈉可以抑 制骨折修復)(見Khosla和Rigss，同上)。
目前實行的治療策略均不涉及刺激或增強新骨質生長的藥物。本發(fā)明 提供能用于增加骨礦化并因此可以用于治療多種期望增加骨質的疾病的 組合物和方法。而且，本發(fā)明提供了相關的其它益處。
發(fā)明概述
如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-p結合蛋白類型或家族，用于 篩選增加骨礦質含量和骨礦質密度的化合物的方法，增加骨礦質含量和 骨礦質密度的化合物，和在多種疾病的治療或預防中使用這些化合物的 方法。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其中所述核酸分 子選自(a)含有SEQ ID NOs. 1、 5、 7、 9、 11、 13或15，或它們的互 補序列的分離核酸分子；(b)在高嚴緊條件下與(a)的核酸分子特異雜交 的分離核酸分子；和(c)根據(a)或(b)的編碼TGF-p結合蛋白的分離核 酸分子。在本發(fā)明的相關方面中，提供基于與上述定義序列之一的僅一 部分發(fā)生的雜交(例如對于(a),可以是與選自SEQ ID NO. 1的第156-539位或第555-687位核苷酸的至少20、 25、 50或100個核普酸的探針 發(fā)生的雜交)的分離核酸分子。應當是很明顯的，用于雜交的必需嚴緊 性可以根據探針的大小而改變。例如，對于25個威基的探針，高嚴緊條 件可以包括60mMTrispH8. 0, 2mMEDTA， 5xDenhardt氏液，6xSSC, 0.1% (w/v)N-十二烷基肌氨酸(N-laurylsarcosin) , 0.5% (w/v) NP-40 (乙 基笨基聚乙二醇)，45t:過夜，之后用0. 2xSSC/0. 1% SDS于45-50X:洗 滌兩次。對于低嚴緊條件下100個堿基的探針，適合的條件可以包括 5xSSPE， 5xDenhardt氏液，和0. 5% SDS于42-50"C過夜，之后用2xSSPE (或2xSSC) /0.1% SDS于42-50"C洗滌兩次。
在本發(fā)明的相關方面中，提供根據Wilbur-Lipman算法與SEQ IDNOs.1、 5、 7、 9、、 11、 13或15有50%、 60%、 75%、 80%、 90%、 95%或98%水 平的同源性的分離核酸分子。例如，這樣的核酸分子的代表性例子包括 編碼含有SEQ ID N0s.2、 6、 10、 12、 14、或16的蛋白質的核酸分子， 或根據Lipman-Pearson算法與這些序列有50%、 6096、 75%、 80%、 90%、 95%il 989fr水平的同源性的核酸分子。
典型地，分離的核酸分子小于100kb,而且在某些實施方案中，小于 50kb、 25kb、 10kb、或甚至5kb。而且，在其它實施方案中，分離的核酸 分子在其它無關核酸分子的"文庫"(例如，亞克隆BAC,如GenBank登 記號AC003098和EMB登記號AQ171546中描述的)中是不存在的。然而， 可以在相關分子的文庫(例如用于改組的文庫，如美國專利5,837,458; 5, 830, 721 ;和5,811,238中描述的)中找到分離的核酸分子。最后，本 文所描述的分離核酸分子不包括編碼Dan、 Cerberus、 Gremlin或SCGF (美國專利5,780,263)的核酸分子。
本發(fā)明還提供含有上述核酸分子的克隆栽體，和含有可操作地與上述 核酸分子之一連接的啟動子(例如調節(jié)序列)的表達載體。合適啟動子 的代表性例子包括組織特異性啟動子和基于病毒的啟動子(例如CMV I-E 等基于CMV的啟動子、SV40早期啟動子和MuLV LTR)。表達載體也可以 基于或來源于病毒(例如"病毒載體")。病毒載體的代表性例子包括單 純皰瘆病毒栽體、腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體和逆轉錄病毒載體。 本發(fā)明還提供含有或包含任何上述載體的宿主細胞(包括例如人、猴、 狗、大鼠或小鼠來源的宿主細胞)。
在本發(fā)明的其它方面中，提供了制備TGF-&結合蛋白的方法，包括 步驟在足以產生TGF-P結合蛋白的時間和條件下培養(yǎng)上述含載體的宿 主細胞。在進一步的實施方案中，可以對通過該方法產生的蛋白質作進 一步純化(例如通過柱層析、親和純化以及諸如此類的方法)。因此，根 據本申請的公開可以容易地制備上述核酸分子所編碼的分離蛋白質(例 如SEQ ID NOs. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14或16 )。
還應該指出的是，上述蛋白質或其片段可以以融合蛋白的形式產生。 例如，在一個方面，提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的融合蛋白，其中第一多舦片段含有上述核酸分子所編碼的TGF-P結合蛋白或其 至少10、 20、 30、 50或IOO個氨基酸長的部分，第二多肽片段含有非TGF-P結合蛋白。在某些實施方案中，該第二多肽可以是適于純化或識別的 尾端(tag)(例如含有多個陰離子氨基酸殘基的多A-見美國專利 4,851,341)、標記(例如綠色熒光蛋白或堿性磷酸酶)、或毒性分子(例 如篦麻毒素)。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了能夠特異結合上述TGF-p結合蛋白 類型(例如人BEER)的抗體。在多種實施方案中，該抗體可以是(例如 人或鼠來源的)多克隆抗體或單克隆抗體。在進一步的實施方案中，該 抗體是保留了整個抗體的結合特性的抗體片段(例如F(ab，)2, F(ab)2， Fab，， Fab或Fv片段，或甚至是CDR)。本發(fā)明還提供能夠產生或表達上 述抗體的雜交瘤和其它細胞。
在本發(fā)明的相關方面中，本發(fā)明提供了檢測TGF-p結合蛋白的方法， 包括步驟在足以允許上述抗體與TGF-p結合蛋白結合的時間和條件下 孵育所述抗體，并檢測該結合。在多種實施方案中，抗體可以與固相支 持物結合以利于洗滌或分離，和/或可以是標記的(例如用選自酶、熒光 蛋白和放射性同位素的標記)。
在本發(fā)明的其它方面中，本發(fā)明提供了與根據SEQ IDNOs. 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17或18或它們的互補序列的核酸分子在高嚴緊條件 下雜交的分離寡核苷酸。在進一步的實施方案中，該寡核苷酸可以在編 碼SEQ ID NOs. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14或16的序列中找到。在某些 實施方案中，該寡核苷酸長至少15、 20、 30、 50或100個核苷酸。在進 一步的實施方案中，用另一個分子(例如酶、熒光分子或放射性同位素) 標記該寡核苷酸。本發(fā)明還提供能夠特異擴增編碼TGF-p結合蛋白的上 述核酸分子的全部或部分的引物。這里所用術語"特異擴增"應當理解 為是指擴增上述TGF-p結合蛋白，而非其它TGF-p結合蛋白例如Dan、 Cerberus、 Gremlin或SCGF (美國專利5， 780， 263)的引物。
在本發(fā)明的相關方面中，提供了檢測編碼TGF-p結合蛋白的核酸分 子的方法，包括步驟在高嚴緊條件下孵育上迷寡核苷酸，并檢測所述寡核苷酸的雜交。在某些實施方案中，該寡核苷酸可以是標記的和/或與 固相支持物結合的。
在本發(fā)明的其它方面中，提供了能夠切割編碼上述TGF-p結合蛋白 之一 (例如SEQIDNOs.2、 6、 8、 10、 12、 14或16)的RNA的核酶。 該核酶可以由DNA、 RNA (包括2，-0-甲基核糖核酸)、核酸類似物(例 如具有硫代磷酸酯鍵的核酸)或它們的混合物組成。還提供編碼這些核 酶的核酸分子(例如DNA或cDNA)，以及能夠表達或產生這些核酶的 載體。載體的代表性例子包括質粒、逆轉錄轉座子、粘粒和基于病毒的 栽體(例如，至少部分從逆轉錄病毒、腺病毒、或腺伴隨病毒產生的病 毒載體)。本發(fā)明還提供含有這些栽體的宿主細胞(例如，人、狗、大鼠 或小鼠細胞)。在某些實施方案中，可以用栽體穩(wěn)定地轉化宿主細胞。
在本發(fā)明的更進一步的方面，提供通過合成或體外或體內轉錄產生 核酶的方法。在更進一步的實施方案中，可以對由此產生的核酶作進一 步純化和/或將其制成藥物組合物(例如該核酶或編碼該核酶的核酸分子 和藥物學上可接受的載體或稀釋劑一起)。同樣，可以將本文描述的反義 寡核苷酸和抗體或其它選定分子制成藥物組合物。
在本發(fā)明的其它方面中，提供含有可與根據SEQIDNOs.l、 3、 5、 7、 9、 11、 13或15或其互補序列的核酸分子雜交的核酸分子的反義寡核 苷酸，其中所述寡核苷酸抑制本文所述的TGF-P結合蛋白(例如人 BEER)的表達。在多種實施方案中，該寡核苷酸長15、 20、 25、 30、 35、 40或50個核苷酸。優(yōu)選地，該寡核苷酸的長度小于100、 75或60 個核苷酸。應該易于明了的是，該寡核苷酸可以含有一或多種核酸類似 物、核糖核酸或脫氧核糖核酸。而且，該寡核苷酸可以由一個或多個鍵 (linkage)修飾，這些鍵包括例如共價鍵如硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、 膦酸甲酯鍵、亞曱基(曱基亞胺基)鍵、嗎啉代鍵(morpholino linkage)、 酰胺鍵、聚酰胺鍵、短鏈烷基糖間鍵、環(huán)烷基糖間鍵、短鏈雜原子糖間 鍵和雜環(huán)糖間鍵。嵌合寡核苷酸的一個代表性例子見美國專利5,989,912。
在本發(fā)明的再一方面，提供用于增加骨礦化的方法，包括向恒溫動 物導入有效量的上述核酶。在相關方面中，該方法包括步驟在利于核酸分子轉錄產生該核酶的條件下，向患者導入有效量的能產生期望核酶的 本文所描述核酸分子或載體。
在本發(fā)明的其它方面，提供轉基因非人動物。在一個實施方案中，提
供其生殖細胞和體細胞含有編碼上述TGF-P結合蛋白的核酸分子的轉基 因動物，其中所述核酸分子可操作地與可有"達該基因的啟動子相連， 該基因是在胚胎階段導入該動物或該動物祖先的，且條件是所述動物并 非人類。在其它實施方案中，提供轉基因敲除動物，包括其生殖細胞和 體細胞中至少有一個可與編碼上述TGF-p結合蛋白的核酸分子雜交的內 源性核酸分子等位基因被破壞的動物，其中與不帶有該破壞的動物相比， 該破壞阻止了從所述等位基因轉錄信使RNA，且條件是該動物并非人類。 在多種實施方案中，該破壞是核酸缺失、替代或插入。在其它實施方案 中，該轉基因動物是小鼠、大鼠、綿羊、豬或狗。
在本發(fā)明另外方面，提供用于檢測TGF-P結合蛋白基因表達的試劑 盒，其包括一個含有核酸分子的容器，其中該核酸分子選自(a)含有SEQ ID Nos: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13或15的核苷酸序列的核酸分子；(b) 含有(a)之核苷酸序列的互補序列的核酸分子；(c)是長度為至少15、 20、 30、 50、 75或100個核苷酸的(a)或(b)的片段的核酸分子。還提供用于 檢測TGF-p結合蛋白的試劑盒，該試劑盒包含一個含有一種本文所述的 TGF-p結合蛋白抗體的容器。
例如，在本發(fā)明的一個方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨 礦質含量的方法，包括步驟(a)將一種或多種候選分子與權利要求1的 核酸分子編碼的TGF-p結合蛋白，以及TGF-p蛋白質家族的一個選定成 員(例如BMP5或6)相混合，(b)測定該侯選分子是否改變了 TGF-P家 族成員的信號轉導(signaling),或改變了 TGF-卩結合蛋白與TGF-P家 族成員的結合。在某些實施方案中，該分子改變TGF-p起間充質細胞分 化的正調節(jié)物作用的能力。在本發(fā)明的此方面，該侯選分子可以通過例 如減少(如抑制)或增加(如增強)信號轉導或結合來改變信號轉導或 結合。
在另一方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質含量的方法，包括步驟確定所選分子是否抑制TGF-p結合蛋白與骨或其類似物 的結合。骨或其類似物的代表性例子包括鞋基磷灰石和通過活組織檢查 獲得的人原始骨樣品。
在以上列舉的方法的某些實施方案中，該所選分子包含在分子混合物 中，而且這些方法可以進一步包括步驟分離在該測定中發(fā)揮功能的一 種或多種分子。在其它實施方案中，將TGF-P蛋白質家族結合在固相支 持物上并測量TGF-p結合蛋白的結合，或者將TGF-p結合蛋白結合在固 相支持物上并測量TGF-p蛋白質的結合。
利用諸如以上描述的方法，可以分析多種分子通過抑制TGF-p結合 蛋白與TGF-p蛋白質家族的結合增加骨礦質含量的能力。這些分子的代 表性例子包括蛋白質或肽、有機分子和核酸分子。
在本發(fā)明的其它相關方面中，提供用于增加恒溫動物骨礦質含量的方 法，包括步驟給恒溫動物施用治療上有效量的從本文所列舉分析方法 鑒定的分子。在另一方面，提供用于增加恒溫動物骨礦質含量的方法， 包括步驟:給恒溫動物施用治療上有效量的抑制TGF-p結合蛋白與TGF-p 蛋白質超家族，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)結合的分子。適合分子的 代表性例子包括反義分子、核酶、核酶基因和特異識別并改變TGF-p結 合蛋白活性的抗體(例如人源化抗體)。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于增加恒溫動物骨礦質含量的方法，包 括步驟(a)向返回骨的細胞導入指導抑制TGF-p結合蛋白與TGF-p蛋白 質家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)結合的分子表達的載體，和(b)給恒 溫動物施用該含有載體的細胞。如本文中所用的，應該理解，如果細胞 在外周施用后定位在骨基質中，則細胞"返回骨"。在一個實施方案中， 該方法還包括，在導入步驟之前，從骨髓分離返回骨的細胞。在再一實 施方案中，返回骨的細胞選自CD34+細胞和成骨細胞。
在本發(fā)明的其它方面，提供抑制TGF-p結合蛋白與TGF-p蛋白質超 家族結合的(優(yōu)選分離的)分子。
在另一些實施方案中，該分子可以以組合物的形式提供，而且可以進 一步含有骨吸收抑制物。這些抑制物的代表性例子包括降鈣素、雌激素、二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三笨氧胺。
可以用于前述治療方法中的分子的代表性例子包括例如核酶、核酶基 因、反義分子和/或抗體(例如人源化抗體)。依據這些分子的選擇，它
們可以用來改變、拮抗或激動本文所述的TGF-p結合蛋白家族成員的信 號轉導或結合。
在本發(fā)明的各種實施方案中，上述治療或預防的分子和方法可以用于 疾病例如骨質疏松癥、骨軟化、牙周病、壞血病、庫欣病(Cushing，s Disease )、骨折和由于肢體不動和類固醇使用引起的疾病。
參考如下詳細說明和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將是明顯的。此 外，本文給出了各種更為詳細地描述某些程序和組合物(例如質粒等) 的文獻，并因此將它們完整地以參考文獻方式并入。
附圖簡要^兌明


圖1是人Dan、人Gremlin、人Cerberus和人Beer的氨基酸序列比 較示意圖。箭頭指示半胱氨酸骨架。
圖2總結了從對各種組織進行TGF-p結合蛋白基因，具體是人Beer 基因表達研究獲得的結果。使用半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 方法，從由總RNA合成的第一鏈cDNA擴增該基因的一部分(在實施例2A 中有更為詳細的描述)。
圖3總結了使用與小鼠Beer轉錄本互補的cRNA探針進行小鼠胚胎 切片RNA原位雜交所獲得的結果(在實施例2B中有更為詳細的描述)。A 組為10.5 dpc胚胎的橫向切片。B組是12.5 dpc胚胎的縱向切片，C組 和D組是15. 5 dpc胚胎的縱向切片。
圖4說明了通過Western印跡分析顯示的三種不同多克隆抗體對于 它們各自抗原的特異性(在實施例4中有更詳細地描述)。圖4A顯示了 抗人Beer抗體對于人Beer抗原，而非人Dan或人Gremlin的特異反應 性。圖4B顯示了抗人Gremlin抗體對于人Gremlin抗原，而非人Beer 或人Dan的特異反應性。圖4C顯示了抗人Dan抗體對于人Dan抗原， 而非人Beer或人Gremlin的特異反應性。圖5說明了通過Western印跡分析顯示的TGF-p結合蛋白Beer對 BMP-5和BMP-6，而非BMP-4的選擇性(在實施例5中有更詳細地描述)。
圖6闡明了 TGF-p結合蛋白Beer與BMP-5之間的離子相互作用具有 15-30nM范圍的解離常數(shù)。
發(fā)明詳述
定義
在詳細陳述本發(fā)明之前，闡明某些術語的定義并列出和定義下文將用 到的縮寫，可能對于本發(fā)明的理解是有用的。
"M"應理解為包括蛋白質或肽(例如抗體、重組結合伴侶(binding partner).具有期望結合親和性的肽)、核酸(例如DNA、 RNA、嵌合核酸 分子和核酸類似物如PNA);和有機或無機化合物。
"TGF-B"應理解為包括任何已知或新的TGF-p超家族成員，該TGF-p超家族也包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)。
"TGF-B受體"應理解為是指對于TGF-p超家族(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋 白質(BMP))的特定成員具有特異性的受體。
、"TGF-B結合蛋白"應理解為是指對于TGF-p超家族(包括骨形態(tài)發(fā) 生蛋白質(BMP))的特定成員或子集具有特異結合親和性的蛋白質。TGF-p 結合蛋白的具體例子包括SEQ ID NOs. 1、 5、 7、 9、 11、 13和15所編 碼的蛋白質。
抑制"TGF-B結合蛋白與TGF-(3蛋白質家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質 (BMP)的結合"應理解為是指，通過除去TGF-p或阻止TGF-p與TGF-p 結合蛋白結合，從而允許激活TGF-p或骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP),或允 許TGF-p家族成員包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)與其各自的受體結合的 分子。該抑制可以通過例如抑制TGF-p結合蛋白與TGF-p超家族的特定 成員結合的分子來實現(xiàn)。
"載體"是指能夠指導目的蛋白質表達的裝置。載體必須包括可操 作地與目的基因連接的轉錄啟動子元件。載體可以由脫氧核糖核酸 ("DNA")、核糖核酸("RNA")、或兩者的結合(例如DNA-RNA嵌合物)
26組成。任選地，載體可以包括聚腺苷酸化序列、 一或多個限制性位點、 以及一或多個選擇標記例如新霉素磷酸轉移酶或潮霉素磷酸轉移酶。此 外，依據所選宿主細胞和所用載體，還可以在本文所述的載體中并入其 它遺傳元件例如復制起點、其它的核酸限制性位點、增強子、賦予轉錄 可誘導性的序列、和選擇標記。
"分離的核酸分子"是非整合在生物體基因組DNA中的核酸分子。 例如，從真核細胞的基因組DNA中分離的編碼TGF-p結合蛋白的DNA分 子即是分離的DNA分子。分離的核酸分子的另一個例子是非整合在生物 體基因組中的化學合成核酸分子。該分離核酸分子可以是基因組DNA、 cDNA、 RNA，或至少部分由核酸類似物組成。
"分離的多肽"是基本上不帶有污染細胞成分例如本質上與該多肽 相聯(lián)的碳水化合物、脂質或其它蛋白性質雜質的多肽。在某些實施方案 中，如果看起來一個特定的蛋白質制品在考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE凝 膠上表現(xiàn)為單一條帶，則它含有分離的多肽。當指有機分子時，"分離的" 意味著采用本領域熟知方法(例如NMR、熔點法)測定時，該化合物具有 大于90%的純度。
"硬化性狹窄(Sclerostenosis)"是Hansen ( 1967)用以指一種 疾病的術語(Hansen, H. G., Sklerosteose. In: Opitz， H. ; Schmid, F. ， Handbuch der Kinderheikunde. Berlin: Springer (出版)6 1967， 第351-355頁)，該疾病類似于范布肯姆全身性骨化層肥厚病，但可能有 如下不同骨改變的放射性表現(xiàn)，和許多案例中食指和中指的不對稱皮 膚并指(趾)現(xiàn)象的存在。在該疾病中下頜具有不尋常的正方形外觀。
"人源化抗體"是重組蛋白質，其中鼠單克隆抗體的互補決定區(qū)已 從鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉移至人的可變區(qū)。
正如本文所用，"抗體片段"是指抗體的部分例如F(ab，)2、 F(ab)2、 Fab，、 Fab等等。無論結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原 結合。例如，抗TGF-p結合蛋白單克隆抗體片段與TGF-p結合蛋白表位 結合。
術語"抗體片段"也包括通過結合特異抗原形成復合物來象抗體一樣起作用的任何合成蛋白質或遺傳工程蛋白質。例如，抗體片段包括由
輕鏈可變區(qū)構成的分離片段、由重鏈和輕鏈可變區(qū)構成的"Fv"片段、 通過肽接頭連接輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的重組單鏈多肽分子("sFv蛋 白質")、和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基構成的最小識別單位。
"可檢測標記(label)"是可以和抗體部分結合產生對于診斷有用的 分子的分子或原子?？蓹z測標記的例子包括螯合劑、光敏劑、放射性同 位素、熒光試劑、順磁離子、酶和其它標記物(marker)部分。
如本文所用，"免疫結合物(i咖unocon.iugate)"是含有抗TGF-p結 合蛋白抗體或抗體片段，和可檢測標記的分子。免疫結合物在結合 (conjugation)之后具有與結合之前大致上相同的，或僅輕微降低的結合 TGF-p結合蛋白的能力。
縮寫TGF-p~ "轉化生長因子-p"; TGF-pBP— "轉化生長因子-p 結合蛋白"(一種代表性的TGF-pBP稱為"人Beer"); BMP—"骨形態(tài)發(fā) 生蛋白質"；PCR—"聚合酶鏈式反應"；RT-PCR—在第一步使用逆轉錄酶 (RT)將RNA首先轉錄成DNA的PCR方法；cDNA—通過將RNA序列拷貝 成DNA形式所產生的任何DNA。
如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-p結合蛋白類型，以及用于增 加恒溫動物的骨礦質含量的方法和組合物。筒單地說，本發(fā)明以如下意 外發(fā)現(xiàn)為基礎編碼TGF-p結合蛋白家族一個新成員的基因的突變導致 了稀有疾病(硬化性狹窄)，該疾病的特征在于與正常個體相比患者骨礦 質含量高了 1-4倍。因此，正如以下將更為詳細地討論的，該發(fā)現(xiàn)導致 開發(fā)了可以用于篩選抑制TGF-p結合蛋白與TGF-p蛋白質家族和骨形態(tài) 發(fā)生蛋白質(BMP)相結合的分子的方法，以及使用這些分子增加恒溫動 物(包括例如人)的骨礦質含量的方法。
對稱為硬化性狹窄的疾病的討論 硬化性狹窄是Hansen( 1967)應用于一種疾病的術語(Hansen, H. G.， Sklerosteose.In:Opitz,H. ;Schmid，F(xiàn). ，Handbuch derKinderheikunde. Berlin: Springer (出版)6 1967，第351-355頁)， 該疾病類似于范布肯姆全身性骨化層肥厚病，但骨改變的放射性表現(xiàn)可 能不同，而且在許多案例中存在食指和中指的不對稱皮膚并指(趾)現(xiàn) 象。
現(xiàn)已知道硬化性狹窄是一種以成年時期廣泛播散性骨硬化損傷 (disseminated sclerotic lesions of the bone)為特征的常染色體半 顯性疾病。該疾病是進行性的。硬化性狹窄還有一個與并指(趾)(兩個 或多個指(趾)融合在一起)相關的發(fā)育問題。硬化性狹窄綜合征與巨 型身高相關，許多患病個體達到6英尺高或更高。純合子的骨礦質含量 可以比正常個體高1-6倍，而且骨礦質密度可以比正常值(例如，從未 患病同胞獲得的值)高1-4倍。
硬化性狹窄綜合征主要在南非荷蘭人血統(tǒng)的Afrikaaner人中發(fā)生。 在Afrikaaner群體中大約1/140的個體是該突變基因的攜帶者(雜合 子)。該突變表現(xiàn)出100%的外顯率。關于不帶有相關病理學特征(并指(趾) 或頭骨過度生長)的雜合子中骨礦質密度增加也有軼事報道。
目前，似乎在硬化性狹窄中還沒有垂體-下丘腦軸的異常。尤其是， 似乎還沒有生長激素和可的松的過度產生。此外，在患病個體中性激素 水平正常。然而，骨更新標記(bone turnover markers)(成骨細胞特 異'&喊性磷酸酶、骨鈣素、I型原膠原C，前肽(PICP)，以及總的堿性磷 酸酶；(見Cornier, C., Curr. Opin. in Rheu. 7:243， 1995))指示有 與該疾病相關的高成骨細胞活性(hyperosteoblastic activity),但破 骨細胞活性正常至輕微降低，這是用骨吸收標記(吡咬啉、脫氧吡啶啉、 N-端肽、尿羥脯氨酸、血漿酒石酸抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羥賴氨酸 (見Cornier,同上))測量的。
硬化性狹窄的特征在于在患病個體的一生中全身骨骼骨的持續(xù)沉積。 在純合子中骨礦質的持續(xù)沉積導致在缺^械剌激感受器的骨骼區(qū)域(頭 骨、頜、顱骨)中骨的過度生長。在患硬化性狹窄的純合子中，頭骨的 過度生長導致顱壓迫，并最終由于腦干所受到的過高流體靜壓導致死亡。 在骨骼的所有其它部分，出現(xiàn)普通性和彌散性硬化。長骨的皮質區(qū)極大地增厚，導致骨長度的顯著增加。小梁連接(trabecular connections) 增厚，而這又增加了小梁骨的強度。硬化骨表現(xiàn)出不尋常的X射線不透性。
正如實施例1中將更詳細描述的，負責硬化性狹窄綜合征的這種稀有 遺傳突變定位在人第17號染色體編碼TGF-(5結合蛋白家族一個新成員的 區(qū)域(該新成員的一個代表性例子稱為"人Beer")。如下文將更為詳細 地描述的，基于該發(fā)現(xiàn)，骨礦化機制獲得了更為全面的理解，從而允許 開發(fā)測定增加骨礦化的分子的方法，以及這些分子在增加骨礦質含量和 治療或預防許多疾病中的應用。
TGF-B超家族
轉化生長因子-P (TGF-p)超家族包含各種(在二級和三級水平上) 具有共同的序列元件和結構基序的生長因子。已知該蛋白質家族在眾多 的細胞類型上執(zhí)行著廣泛的生物學反應。其中許多在胚胎發(fā)育期間模式 的形成和組織的特化中發(fā)揮著重要作用；在成年個體中它們參與例如傷 口愈合和骨修復及骨重塑，以及免疫系統(tǒng)的調節(jié)。除了三種TGF-p夕卜， 該超家族還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)、活化素、抑制素、生長和分 化因子(GDF)以及膠質來源的神經營養(yǎng)因子(GDNF)。通過將特定蛋白 質劃入普通亞家族的一般序列特征，建立初級分類。由于較小群體的成 員間更為嚴格的序列保守性，在亞家族中進行其它分層是可能的。在某 些情況中，例如對于BMP-5、 BMP-6和BMP-7,這可以是此較小群體成員 間的高達75%的氨基^同源性。這種一致性水平使得單個代表性序列即可 說明將此子群體與較大家族的其它成員分開的此子群體的關鍵生化元 件。
TGF-p通過誘導I型和II型受體形成異寡聚體復合物(hetero-oligomeric complexes)來實現(xiàn)信號轉導。已經測定了 TGF-p2的晶體結 構。TGF-p2的通常折疊形式含有一個由三個二硫橋形成的穩(wěn)定緊湊的半 胱氨酸節(jié)狀結構。通過一個二磁撟穩(wěn)定的二聚化是反向平行的。
TGF-p家族成員通過結合具有內在絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的受體來起始其細胞作用。該受體家族由兩個亞家族組成，表示為I型和II型受
體。TGF-p家族的每個成員均與I型和II型受體的一個特征性組合相結 合，這兩種受體均是信號轉導所必需的。在目前的TGF-p受體激活模型 中，首先TGF-p與II型受體(TbR-II)結合，這以具有激活的激酶活性 的寡聚形式在細胞膜中發(fā)生。之后，在缺乏TbR-II時不能與配體結合的 I型受體(TbR-I)被吸收進該復合物中。然后，主要在近膜區(qū)的富含甘氨 酸和絲氨酸殘基的域(GS域)中TbR-II使TbR-1磷酸化，并由此激活 TbR-I。
迄今已鑒定了 7種I型受體和5種II型受體。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)是決定人體骨礦質 密度的關^調節(jié)蛋白質 骨形成理解方面的主要進展是骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP),又稱生骨 蛋白質(OP)的鑒定，該蛋白質調節(jié)體內軟骨和骨的分化。BMP/OP通過 一連串級聯(lián)事件誘導軟骨內的骨分化，這些事件包括軟骨的形成、軟骨 的過量生長和^化、血管入侵、成骨細胞的分化、和骨的形成。如上所 述，BMP/OP (BMP 2-14，和生骨蛋白1和2即QP-1和0P-2)是TGF-p 超家族的成員。BMP/OP亞家族成員之間的驚人進化保守性提示，它們在 動物的正常發(fā)育和機能中是關鍵的。而且，多種形式的BMP/OP的存在引 出一個重要問題，即關于此明顯冗余的生物學意義的問題。BMP/OP除了 在胎兒之后(postfetal)的軟骨形成和骨生成中起作用外，還在骨骼形 成(包括顱面(craniofacial)組織和牙組織的發(fā)育)以及實質器官包 括腎的胚胎發(fā)育和器官形成中起著多種作用?，F(xiàn)在我們知道，自然界依 靠著剪裁的共同(但稀少)的分子機制來實現(xiàn)特化組織和器官的形成。 BMP/OP超家族是自然界筒約性的一個很好例子，即通過使用在高度保守 羧基端區(qū)域的氨基酸基序中具有微小變異的分子同種型(isoform)來規(guī)劃 多種特化功能。 BMP的拮抗作用BMP亞家族和活化素亞家族均受到明顯的翻譯后調節(jié)。存在一個復雜 的細胞外控制系統(tǒng)，籍此合成并輸出一個高親和性拮抗劑，隨后該拮抗 劑選擇性地與BMP或活化素形成復合物以破壞它們的生物學活性(W.C. Smith (1999) TIG 15(1) 3-6)。已經鑒定了許多這種天然拮抗劑，而且 基于序列差異百分數(shù)，由于缺乏一級序列的保守性，它們似乎是獨立進 化的。目前還沒有關于這類蛋白質的結構研究。這些拮抗劑的研究突出 顯示，其明顯偏好與BMP-2和BMP-4相互作用，并中和之。而且，不同 拮抗劑的抑制機制似乎不同(S. Iemura等(1998)美國國家科學院院刊 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95， 9337-9342)。
新的TGF-B結合蛋白 1. TGF-p結合蛋白的背景
如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-p結合蛋白類型，當與人DAN、 人Gremlin和人.Cerberus以及SCGF (美國專利5,780,263)相比時此 新TGF-p結合蛋白類型具有幾乎一致的半胱氨酸(二硫鍵)支架，但核 苷酸水平上幾乎沒有同源性(背景知識一般參見Hsu， D. R. ， Economides， A. N., Wang，， X., Eimon, P.M., Harland, R. M.，"非洲爪塘屬背部化 (dorsaliz&g)因子Gremlin鑒定了一個拮抗BMP活性的新分泌蛋白質家 族"，分子細胞(Molecular Cell) 1:673-683,1998)。 」
該新TGF-p結合蛋白類型的一個代表性例子在SEQ ID NOs. 1、 5、 9、 11、 13和15中公開。還應當理解，這類結合蛋白的代表性成員包括TGF-p 結合蛋白變休(例如SEQ ID NOs. 5和7)。本文中所使用的"TGF-p結 合蛋白變體基因"是指編碼具有SEQ ID Nos: 2、 10、 12、 14或16的修 飾氨基酸序列的多肽的核酸分子。該變體包括天然存在的TGF-p結合蛋 白基因多態(tài)性或等位基因變體，以及含有這些氨基酸序列的保守氨基酸 替換的合成基因。TGF-p結合蛋白基因的其它變體形式是含有上述核苷酸 序列的插入或缺失的核酸分子。TGF-p結合蛋白變體基因可以通過確定該 基因是否能與具有SEQ ID Nos: 1、 5、 7、 9、 11、 13或15的核苷絲 列在嚴緊條件下雜交來鑒定。此外，TGF-p結合蛋白變體基因應編碼具有)的蛋白質。
作為一種替代方法，TGF-p結合蛋白變體基因可以通過序列比較來鑒 定。正如本文中所用的，當以獲得最大對應(correspondence)的方式對 比(aligning)時，如果兩個氨基酸序列的氨基酸殘基相同，則這兩個 氨基酸序列具有"100%的氨基酸序列一致性"。同樣，當以獲得最大對應 的方式對比時，如果兩個核苷酸序列的核苷酸殘基相同，則這兩個核苷 酸序列具有"100%的核苷酸序列一致性"。序列比較可以采用標準軟件程 序例如DNASTAR (Madison, Wisconsin)生產的LASERGENE生物信息計 算軟件包中包括的那些程序來進行。其它通過確定最佳對比來比較兩個 核苷酸或氨基酸序列的方法是本領域技術人員所熟知的(見例如Peruski 和Peruski，因特網和新生物學基因組和分子研究的工具(The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research), (ASM Press公司，1997); Wu等(編)，"核酸及蛋白質的信息高速公路 和計算機數(shù)據庫"，基因生物技術方法(Methods in Gene Biotechnology),第123-151頁(CRC Press公司，1997);和Bishop (編)人類基因組計算指南(Guide to Human Genome Computing)第2 版(Academic Press公司，1998))。
TGF-(3結合蛋白變體應與SEQ ID Nos: 2、 6、 10、 12、 14或16有 至少50%的#^酸序列一致性，優(yōu)選高于60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90械95%的一致性?；蛘?，TGF-p結合蛋白變體可以通過與SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15有至少70%的核苷酸序列一致性來鑒定。而且， 本發(fā)明還設想了與SEQ ID NO: 1有大于75%、 80%、 85%、 90%或95%—致 性的TGF-p結合蛋白基因變體。無論使用何種鑒定TGF-p結合蛋白變體 基因或TGF-p結合蛋白變體的具體方法，TGF-p結合蛋白變體或由TGF-卩 結合蛋白基因變體編碼的多肽均可以從功能上通過例如其結合TGF-p蛋 白質家族選定成員和/或抑制該成員的信號轉導的能力來表征，或通過其 特異結合抗TGF-p結合蛋白抗體的能力來表征。
本發(fā)明包括TGF-p結合蛋白基因的功能性片段。在本發(fā)明范疇內， TGF-p結合蛋白基因的"功能性片段"是指編碼TGF-P結合蛋白多肽的(1)
33具有上述功能活性，或(2)特異地與抗TGF-p結合蛋白抗體結合的部分的 核酸分子。例如，本文所述TGF-p結合蛋白基因的功能性片段包含SEQID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15核苷酸序列的一部分。
2. TGF-p結合蛋白基因的分離
編碼結合蛋白基因的DNA分子可以通過使用基于例如SEQ ID No: 1 的寡核苷酸探針，篩選人cDNA或基因組文庫來獲得。
例如，cDNA文庫制備的第一步是采用本領域技術人員所熟知的方法 分離RNA。 一般地，RNA的分離技術必需提供用于破碎細胞的方法、抑制 RNA酶指導的RNA降解的手段、以及從DNA、蛋白質和多糖污染物中分離 RNA的方法。例如，總RNA可以通過如下步驟獲得在液氮中冷凍組織， 用研缽和研棒磨碎此冷凍組織以裂解細胞，用酚/氯仿溶液抽提該研碎組 織以去除蛋白質，并通過用氯化鋰選擇性沉淀從剩余的雜質中分離出RNA (見例如Ausubel等(編)，精編分子生物學實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology),第三版，第4-1至4-6頁(John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu等,基因生物技術方法，第33-41頁(CRC 出版公司1997) ["Wu (1997)"])。
或者，總RNA可以通過如下步驟分離用異硫氰^l^提研碎組織， 用有機溶劑抽提，并使用差速離心從污染物中分離RNA(見例如Ausubel (1995)第4-1至4-6頁；Wu ( 1997)第33-41頁)。
為了構建cDNA文庫，必需從總RNA制品中分離poly(A)+RNA?？梢?通過使用oligo(dT)-纖維素層析標準技術從總RNA中分離poly(A)+RNA (見例如Ausubel (1995)第4-11至4-12頁)。
采用本領域技術人員熟知的技術從poly (A)+RNA合成雙鏈cDNA分子。 (見例如Wu ( 1997)第41-46頁)。而且，可以使用商業(yè)上可獲得的試劑 盒來合成雙鏈cDNA分子。例如，這些試劑盒可以獲自Life Technologies 公司(Gaithersburg， Maryland), CLONTECH Laboratories公司(Palo Alto, California), Promega公司(Madison， Wisconsin)和Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California^可以對用以獲得TGF-卩結合蛋白cDNA克隆的這種基本方法進行修 改，方法是構建富集TGF-(J結合蛋白特異性cDNA分子的扣除cDNA文庫。 構建扣除文庫的技術是本領域技術人員所熟知的(見例如，Sargent,"差 異表達基因的分離 (Isolation of Differentially Expression Genes)"，酶學方法(Meth. Enzymol. ) 152:423， 1987,以及Wu等(編) "扣除和完整表達cDNA文庫的構建和篩選(Construction and Screening of Substracted and Complete Expression cDNA Libraries)"基因生 物技術方法(Methods in Gene Biotechnology),第20-65頁(CRC出 版乂>司，1997))。
多種克隆栽體適合用于cDNA文庫的構建。例如，可以在來源于噬菌 體的載體如入gtlO載體中制備cDNA文庫(見例如，Huynh等，"在XgtlO 和入gtll中構建和篩選c腿文庫(Constructing and Screening cDNA Libraries in人gtlO and入gtll)", DNA克隆實用方法(DNA Cloning: A Practical Approach)第I春，Glover (編)，第49頁(IRL Press, 1985); Wu ( 1997)第47—52頁)。
或者，可以將雙鏈cDNA分子插入質粒栽體如pBluescript栽體 (Stratagene Cloning Systems; La Jolla， California), 入GEM—4 (Promega乂^司；Madison, Wisconsin)或其它商業(yè)可獲得的載體。合 適的克隆載體還可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville, Maryland)獲得。
為了擴增克隆的cDNA分子，采用標準技術將cDNA文庫插入原核宿 主中。例如，可以將cDNA文庫導入大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞中，該細胞 可以從Life Technologies公司(Gaithersburg, Maryland)獲得。
可以通過本領域熟知的方法制備人類基因組DNA文庫(見例如Ausubel (1995)第5-1至5-6頁；Wu ( 1997)第307-327頁)?；蚪MDNA可以通 過如下步驟分離用去污劑Sarkosyl裂解組織，蛋白酶K消化裂解物， 通過離心從裂解物中清除不溶性碎片，使用異丙醇從裂解物中沉淀核酸， 并在氯化銫密度梯度上純化重懸的DNA。
可以通過基因組DNA的隨機剪切或通過用限制性內切酶部分消化基
35因組DNA,獲得適合用于產生基因組文庫的DNA片段。根據常規(guī)技術，例 如使用限制性酶消化提供合適的末端、使用堿性磷酸酶處理以避免DNA 分子不合要求的連接、并用合適的連接酶進行連接，可以將基因組DNA 片段插入載體如噬菌體或祐粒載體中。用于這些操作的技術是本領域所 熟知的(見例如Ausubel (1995)第5-1至5~6頁；Wu ( 1997)第307-327 頁)。
編碼TGF-p結合蛋白的核酸分子還可以使用具有基于上迷人TGF-P 結合蛋白基因之核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸引物采取聚合酶鏈 式反應(PCR)來獲得。用PCR篩選文庫的一般方法參見例如，Yu等"使 用聚合酶鏈式反應篩選喧菌體文庫(Use of Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries)", 分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)第15巻PCR搡作指南目前的方法和應用(PCR Protocols: Current Methods and Applications )， White(編)第211-215頁 (Humama 出版公司，1993)。而且，使用PCR分離相關基因的技術描述于例如Preston "簡并寡核苷酸引物和聚合酶鏈式反應在克隆基因家族成員中的應用 (Use of Degenerate Oligonucleotide Primes and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Member)", 分子生物學方法， 第15巻PCR操作指南目前的方法和應用，White (編)第317-337頁 (Humama出版公司，1993)。
或者，可以從商業(yè)途徑例如Research Genetics (Huntsville， AL) 和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rokville, Maryland)獲得人類基因組文 庫。
可以采用標準方法(見例如Ausubel (1995)第6-1至6-11頁)，用 基于SEQ ID No: 1的一或多個多核苷酸探針篩選含有cDNA或基因組克 隆的文庫。
按下述方法制備的抗TGF-p結合蛋白抗體也可以用來從cDNA文庫中 分離編碼TGF-p結合蛋白基因的DNA序列 例如，可以使用該抗體篩選 入gtll表達文庫，或者可以在雜交體選擇和翻譯(hybrid selection and translation)后使用該抗體進行免疫篩選(見例如Ausubel (1995)第6-12至6-16頁；Margolis等"用抗體和蛋白質探針篩選入表達文庫(Screening 入 expression libraries with antibody and protein probes) ，，， EWA 克隆2:表達系統(tǒng)(腿Cloning 2: Expression Systems)第2版，Glover 等(編)第1-14頁(牛津大學出版社1995))。
TGF-p結合蛋白cDNA或TGF-p結合蛋白基因組片段的序列可以采用 標準方法確定。而且，可以采用成熟技術如缺失分析(deletion analysis) ( 一般參見Ausubel ( 1995)),實現(xiàn)對含有TGF-(J結合蛋白啟動子或調 節(jié)元件的基因組片段的鑒定。
作為替代方法，可以通過采用相互引發(fā)(mutually priming)的長 寡核苷酸以及本文所述的核苷酸序列，合成DNA分子，獲得TGF-p結合 蛋白基因(見例如Ausubel (1995)第8-8至8-9頁)。使用聚合膝逸式 反應的已有技術使得能夠合成長至少2千堿基對的DNA分子(Adang等， 植物分子生物學(Plant Molec. Biol. ) 21:1131， 1993; Bambot等,PCR 方法和應用(PCR Methods and Applications) 2:266， 1993; Dillon 等，"聚合酶鏈式反應在快速構建合成基因中的應用(Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes)",分子生物學方法，第15巻PCR搡作指南目前的方法和應 用，White (編)第263-268頁(Humama出版公司，1993); Holowachuk 等，PCR方法應用(PCR Methods Appl.) 4:299， 1995)。
3. TGF-(5結合蛋白基因的制備
可以通過采用上述程序，利用具有基于SEQ ID NO: 1、 5、 9、 11、 13 或15的核苷M列的多核苷酸探針，篩選各種cDNA或基因組文庫，來 獲得編碼TGF-P結合蛋白基因變體的核酸分子。也可以通過合成構建 TGF-p結合蛋白基因變體。例如，可以設計一個核酸分子，其編碼與SEQ ID Nos: 2、 6、 8、 10、 12、 14或16的氨基酸序列相比具有保守氨基酸改變 的多肽。即，可以獲得含有SEQ ID Nos: 2、 6、 8、 10、 12、 14或16的 一或多個氨基酸替換的變體，其中TGF-卩結合蛋白氨基酸序列中的烷基 氨基酸由烷基氨基酸替代，TGF-卩結合蛋白氨基酸序列中的芳香族氨基酸由芳香族氨基酸替代，TGF-p結合蛋白氨基酸序列中的含硫氨基酸由含硫 氨基酸替代，TGF-p結合蛋白氨基酸序列中的含羥基氨基酸由含羥基氨基 酸替代，TGF-p結合蛋白氨基酸序列中的酸性氨基酸由酸性氨基酸替代， TGF-p結合蛋白氨基酸序列中的堿性氨基酸由堿性氨基酸替代，或TGF-p 結合蛋白氨基酸序列中的二堿基(dibasic)單羧基氨基酸由二堿基單羧 基氨基酸替代。
在通常的氨基酸中，例如，"保守氨基酸替代"可通過下列每組內的 氨基酸之間的替代來說明(l)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮 氨酸，(2)笨丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)絲氨酸和蘇氨酸，(4)天冬氨 酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)賴氨酸、精氨酸和組氨酸。 在進行這些替換時，重要的是盡可能維持圖l描畫的半胱氨酸骨架。
TGF-p結合蛋白氨基酸序列中的保守氨基酸改變可以通過用核苷酸替 代SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸來引入。這種"保守氨基酸"變體可以 通過例如寡核苷酸指導的誘變、接頭分區(qū)誘變、使用聚合酶鏈式反應進 行的誘變等等獲樹見Ausubel (1995)第8-10至8-22頁；以及McPherson (編)，定向資變實踐方法(Directed Mutagenesis: A Practical Approach) (IRL出版社1991))。這些變體的功能性能力可以采用標準方 法例如本文所述試驗方法來測定。或者，TGF-p結合蛋白變體多肽可以通 過其特異結合抗TGF-p結合蛋白抗體的能力來鑒定。
可以進行核酸分子的常規(guī)缺失分析以獲得編碼TGF-(5結合蛋白多肽 的核酸分子的"功能性片段"。作為一個說明例子，可以用Bal3 I核酸 酶消化具有SEQ ID NO: 1核苷酸序列的DNA分子，獲得一系列嵌套缺失。 然后以正確的閱讀框將這些片段插入表達載體，分離表達的多肽并檢測 其活性，或檢測其結合抗TGF-p結合蛋白抗體的能力。外切核酸酶消化 的一個替代方法是使用寡核苷酸指導的誘變引入缺失或終止密碼子以規(guī) 定產生期望片段?；蛘?，可以使用聚合酶鏈式反應合成TGF-p結合蛋白 基因的特定片段。
用于蛋白質功能分析的標準技術描述于例如，Treuter等，分子普通 遺傳學(Molec. Gen. Genet. ) 240:113， 1993; Content等，"人干擾素誘導的42kDa 2-5A合成酶的表達和初步缺失分析"，生物干擾素系統(tǒng)， 關于干擾素系統(tǒng)的ISIR-TNO會議報告(Biological Interferon Systems, Proceeding's of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems ) ， Cantell (編),第65-72頁(Nijhoff 1987) ; Herschman, "EGF受體"，動物 細胞增殖控制(Control of Animal Cell Proliferation ),第I巻，Boynton 等(編)第169-199 (Academic Press 1985); Coumaileau等，生物化 學雜志(J. Biol. Chem.)270:29270， 1995; Fukunaga等，生物化學雜 志，270: 25291， 1995; Yamaguchi等，生物化學藥物學(Biochem. Pharmacol. )50:1295, 1995;和Meisel等，植物分子生物學(Plant Molec. Biol. )30:1， 1996。
本發(fā)明還考慮到具有保守氨基酸改變的TGF-(5結合蛋白基因功能片段。
可以通過按如上所述方法確定與SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 1、 13或15 以及2、 6、 10、 12、 14或16的核苷酸和氨基^列的一致性水平，以 結構為基礎筌定TGF-p結合蛋白變體基因。基于結構鑒定變體基因的一 個替代方法是，確定編碼可能的TGF-p結合蛋白基因變體的核酸分子是 否能在嚴緊條件下與具有SEQ ID Nos: 1、 5、 9、 11、 13或15,或其長 度不少于15或20個核苷酸的部分的核苷酸序列的核酸分子雜交。作為 嚴緊雜交條件的舉例說明，在如下緩沖液中55-60t:錄育過夜，具有TGF-P結合蛋白變體序列的核酸分子可以與具有SEQ ID NO: 1序列的核酸分 子的片段結合，該緩沖液含有例如5 x SSPE( 1 x SSPE=180mM氯化鈉，lOmM 磷酸鈉，ImM EDTA ( pH7. 7)), 5 x Denhardt氏液(100 x Denhardt氏液=2% (w/v)牛血清白蛋白，2% (w/v) Ficoll， 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮)和 0. 5% SDS。高度嚴緊的雜交后洗滌典型地是在0. 5 x SSC ( 1 x SSO150mM 氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)或0.5xSSPE中于55-60X:進行的。
無論TGF-P結合蛋白基因變體的具體核苷酸序列如何，該基因都編 碼能夠用其功能活性或其特異結合抗TGF-P結合蛋白抗體的能力來表征 的多肽。更具體地，TGF-P結合蛋白基因變體編碼的多肽表現(xiàn)出本文所 述人TGF-P結合蛋白基因所編碼多肽的活性的至少50%，優(yōu)選60%、 70%、80%il 90%以上。
4.在培養(yǎng)細胞中產生TGF-P結合蛋白
為了表達TGF-P結合蛋白基因，在表達載體中編碼該多肽的核酸分 子必需可操作地與控制轉錄表達的調節(jié)序列連接，之后導入宿主細胞中。 除了轉錄調節(jié)序列例如啟動子和增強子，表達載體還可包括翻譯調節(jié)序 列和適用于篩選攜帶該表達載體的細胞的標記基因。
適用于在真核細胞中產生外源蛋白質的表達載體典型地含有(l)編碼 細菌復制原點和抗生素抗性標記的原核DNA元件，以為表達載體在細菌 宿主中的生長和篩選作準備；(2)控制轉錄起始的真核DNA元件，例如啟 動子；和(3)控制轉錄本加工的DNA元件，例如轉錄終止/多腺苷酸化序 列。
本發(fā)明的TGF-P結合蛋白優(yōu)選在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物宿 主細胞的例子包括非洲綠猴腎細胞(Vero; ATCC CRL 1587)，人胚胎腎 細胞(293-HEK; ATCC CRL 1573)，新生倉鼠腎細胞(BHK-21; ATCC CRL 8544);犬腎細胞(MDCK; ATCC CCL 34),中國倉鼠卵巢細胞(CH0-K1; ATCC CCL 61),大鼠垂體細胞(GH1; ATCC CCL 82 )， Hela S3細胞(ATCC CCL 2.2)，大鼠肝癌細胞(H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40轉化的猴 腎細胞(COS-1; ATCC CRL 1650)和鼠胚胎細胞(NIH-3T3; ATCC CRL 1658 )。
對于哺乳動物宿主，轉錄和翻譯調節(jié)信號可以來自病毒，例如腺病毒、 牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等等，在這些病毒中這些調節(jié)信號與具有高水 平表達的特定基因相聯(lián)系。適合的轉錄和翻譯調節(jié)序列還可以從哺乳動 物基因例如肌動蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白和金屬硫蛋白基因獲得。
轉錄調節(jié)序列包括足以指導RNA合成起始的啟動子區(qū)域。適合的真 核啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子[Hamer等，分子應用遺傳 學雜志(J. Molec. Appl. Genet.) 1:273， 1982],皰滲病毒的TK啟動 子[McKnight，細胞(Cell) 31:355， 1982], SV40早期啟動子[Benoist 等，自然(Nature) 290:304， 1981], Rous肉瘤病毒啟動子[Gorman等， 美國國家科學院院刊79:6777, 1982],巨細胞病毒啟動子[Foecking等，基因(Gene) 45:101， 1980],和小鼠乳腺瘤病毒啟動子( 一般見， Etcheverry,"工程蛋白質在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的表達(Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture)，，， 蛋白質工 程原理和實踐(Protein Engineering: Principles and Practice)， Cleland等(編)第163—181頁(John Wiley & Sons公司，1996))。
或者，如果一種原核啟動子受到真核啟動子的調節(jié)，則可以使用該原 核啟動子，例如噬菌體T3 RNA聚合酶啟動子來控制TGF-P結合蛋白基因 在哺乳動物細胞中的表達(Zhou等，分子細胞生物學(Mol. Cell Biol.) 10:4529， 1990; Kaufman等，核酸研究(Nucl. Acids Res. ) 19:4485， 1991 )。
TGF-P結合蛋白基因還可以在細菌、酵母、昆蟲或植物細胞中表達。 可以用以在原核宿主細胞中表達TGF-P結合蛋白多肽的適合啟動子是本 領域技術人員所熟知的，包括能識別T4、 T3、 Sp6和T7聚合酶的啟動子， 入噬菌體的PK和Pt啟動子，大腸桿菌的trp、 recA、熱休克、lacUV5、 tac、 lpp-lacSpr、 phoA和lacZ啟動子，枯草芽孢桿菌(B. subtiis)的啟 動子，芽孢桿菌屬(Bacillus )噬菌體的啟動子，鏈霉菌屬(Str印tomyces) 的啟動子，入噬菌體的int啟動子，pBR322的bla啟動子，以及氯霉素 乙酰轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的綜述見Glick， J. Ind. Microbiol. 1:277， 1987; Watson等，基因分子生物學(Molecular Biology of the Gene)第4版(Benjamin Cummins 1987); 以及Ausubel 等(1995)。
優(yōu)選的原核宿主包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)。適合的大腸桿菌菌抹包括BL21(DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、 BL21(DE3)pLysE、 DHl、 DH4I、 DH5、 DH5I、 DH5IF，、 DH5IMCR、 DH10B、 DH10B/p3、 DH11S、 C600、 HBIOI、 JM101、 JM105、 JM109、 JM110、 K38、 RR1、 Y1088、 Y1089、 CSH18、 ER1451和ER1647(見例如Brown(編)Molecular Biology Labfax (Academic出版社1991))。合適的枯草芽孢桿菌菌抹 包括BR151、 YB886、 MI119、 MI120和B170 (見例如Hardy,"芽孢桿菌 克隆方法"，DNA克隆實踐方法(DNA Cloning: A Practical Approach),Glover (編)(IRL出版社1985))。
在原核宿主中表達蛋白質的方法是本領域技術人員所熟知的(見例如 William等，"應用質粒載體在大腸桿菌中表達外源蛋白質以及特異性多 克隆抗體的純化"，DNA克隆2:表達系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第 15頁(牛津大學出版社1995); Ward等，"抗體的遺傳操作和表達"，單 克隆抗體原則和應用 (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications),第137頁(Wiley-Liss公司，1995);和Georgiou,"細 菌中蛋白質的表達"，蛋白質工程原理和實踐，Cleland等(編)第101 頁(John Wiley & Sons^S司，1996))。
桿狀病毒系統(tǒng)提供了一種將克隆TGF-P結合蛋白基因導入昆蟲細胞 的有效手段。合適的表達載體以苜蓿銀紋夜蛾(Autogr鄰ha californica)多核型多角體病毒(AcMNPV)為基礎，并含有熟知的啟動 子例如果蠅(Drosophila)熱休克蛋白質(hsp) 70啟動子、苜蓿銀紋夜蛾 多核型多角體病毒的立即早期基因啟動子(ie-1)和遲早期39K啟動子、 桿狀病毒plO啟動子、和果竭金屬硫蛋白啟動子。合適的昆蟲宿主細胞 包括來源于IPLB-sf-21的細胞系， 一 種草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)蛹卵巢細胞系，例如Sf9 ( ATCCCRL 1711), Sf21AE和Sf21
(Invitrogen 乂>司；San Diego, CA),以及果錄Schneider-2細胞。用 于在桿狀病毒系統(tǒng)中產生重組蛋白質的確立技術參見Bailey等，"桿狀 病毒載體的操作(Manipulation of Baculovirus Vectors)，，， 分子生 物學方法(Methods in Molecular Biology)第7巻基因轉移和表達 實驗指南(Gene Transfer and Expression Protocols), Murray (編) 第147-168頁(The Humana出版公司1991); Patel等，"桿狀病毒表達 系統(tǒng)"，DNA克隆2:表達系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第205-244頁
(牛津大學出版社1995); Ausubel ( 1995)第16-37至16-57頁， Richardson (編)桿狀病毒表達實驗指南(Baculovirus Expression Protocols) (The Humana出版公司1995);以及Lucknow，"昆蟲細胞 表達技術(Insect Cell Expression Technology)，，， 蛋白質工程原 理和實踐，Cleland等(編)，第183-218頁(John Wiley & Sons公司
421996 )。
用于酵母中表達的啟動子包括來源于GAL1 (半乳糖)、PGK (磷酸甘 油酸激酶)、ADH (醇脫氫酶)、A0X1 (醇氧化酶)、HIS4 (組氨醇脫氫酶) 等的啟動子。已經設計了許多酵母克隆栽體，而且這些載體均容易獲得。 這些載體包括基于YIp的栽體如YIp5， YRp載體如YRpl7， YEp栽體如 YEpl3，和YCp載體如YCpl9。本領域技術人員將理解有許多種合適載體 可以用于酵母細胞中的表達。
還可以將表達栽體導入植物原生質體、完整的植物組織、或分離的植 物細胞。培養(yǎng)植物組織的一般方法參見例如Miki等，"向植物導入外源 DNA的方法(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", 植物分子生物學和生物技術方法(Methods in Plant Molecualr Biology and Biotechnology), Glick等(編),第67-88頁(CRC出版社1993)。
可以采用各種標準技術將表達載體導入宿主細胞，這些技術包括磷酸 釣轉染、脂質體介導的轉染、微粒介導的遞送、電穿孔等等。優(yōu)選地， 對轉染細胞進行篩選和增殖，以提供含有穩(wěn)定整合在宿主細胞基因組中 的表達載體的重組宿主細胞。將載體導入真核細胞的技術和使用顯性選 擇標記篩選這些穩(wěn)定轉化體的技術描述于例如Ausubel (1995)和Murray (編)基因轉移和表達實驗指南(Humana出版社1991 )。 Ausubel (1995) 也提供了用于將表達載體導入細菌、酵母、昆蟲和植物細胞的方法。
表達和回收哺乳動物細胞系統(tǒng)產生的外源蛋白質的一般方法參見例如 Etcheverry，"工程蛋白質在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的表達"，蛋白質工 程原理和實踐，Cleland等(編)，第163頁(Wiley-Liss公司，1996)。 回收細菌系統(tǒng)產生的蛋白質的標準技術參見例如Grisshammer等，"從大 腸桿菌細胞中純化過量產生的蛋白質"，DNA克隆2:表達系統(tǒng)，第2版， Glover等(編)，第59-92頁(牛津大學出版社1995)。 用于從桿狀病 毒系統(tǒng)中分離重組蛋白質的已確立方法描述于例如Richardson (編)，桿 狀病毒表達實驗指南(Baculovirus Expression Protocols) ( The Humana 出版乂^司，1995)。
更為一般地，可以通過標準技術分離TGF-P結合蛋白，例如親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、HPLC等等。本領域技術人員可以設 計分離和純化TGF-P結合蛋白的其它變化方法。例如可以使用按如下描 述獲得的抗TGF-P結合蛋白抗體，通過免疫親和純化分離大量蛋白質。
5.抗TGF-P結合蛋白抗體的產生
例如，可以使用表達載體的產物作為抗原來獲得抗TGF-P結合蛋白 抗體。尤其有用的抗TGF-P結合蛋白抗體"特異結合"SEQ ID Nos:2、 6、 10、 12、 14或16的TGF-P結合蛋白，而不與其它TGF-P結合蛋白 例如Dan、 Cerberus、 SCGF或Gremlin結合。本發(fā)明抗體(包括其片段 和衍生物)可以是多克隆抗體，或尤其是單克隆抗體。該抗體可以屬于 任何免疫球蛋白類型，即可以是例如IgG,如IgGp IgG2、 IgG3、 IgG4; IgE; IgM;或IgA抗體。該抗體可以是動物例如哺乳動物來源的，可以是例如 小鼠、大鼠、人或其它靈長類動物的抗體。如果需要，該抗體可以是內 化抗體(internalising antibody )。
可以采用本領域技術人員所熟知的方法制備抗重組TGF-P結合蛋白 的多克隆抗體(見例如，Green等，"多克隆抗血清的制備"，免疫化學實 驗指南(Immunochemical Protocols) (Manson, 編)，第1-5頁(Humana 出版社1992); Williams等，"采用質粒載體在大腸桿菌中表達外源蛋白 質以及特異性多克隆抗體的純化"，DNA克隆2:表達系統(tǒng)，第2版，Glover 等(編)，第15頁(牛津大學出版社1995))。盡管多克隆抗體典型地是 在動物例如大鼠、小鼠、兔、山羊或綿羊中產生的，但本發(fā)明的抗TGF-P結合蛋白抗體也可以來源于非人靈長類動物的抗體。在狒狒中產生診 斷上和治療上有用的抗體的一般技術可以參見例如Goldenberg等，國際 專利申請公開文本WO 91/11465 ( 1991 )， Losman等，國際癌癥雜志(Int. J. Cancer) 46:310， 1990。
所述抗體應至少含有一個可變區(qū)結構域。該可變區(qū)結構域可以是任意 大小或氨基酸組成，并且一般在構架序列中包含至少一個負責抗原結合 的高變氨基酸序列。 一般地，術語可變(V)區(qū)結構域可以是免疫球蛋白 重(VH)鏈和/或輕(Vt)鏈可變結構域的任何適合配置。因此，例如V區(qū)結構域可以是單體，是能夠以可接受的親和性獨立地與抗原結合的vH
或\結構域?；蛘?，V區(qū)結構域可以是二體，含有Vh-Vh、 Vh-Vl或Vl-V^ 二聚物，其中L和\鏈以非共價形式相連(以下縮寫為Fv)。然而，如 果需要，這些鏈可以直接地例如通過兩個可變結構域之間的二硫鍵，或 通過接頭例如肽接頭共價偶聯(lián)，以形成單鏈結構域(以下縮寫為scFv)。
可變區(qū)結構域可以是任何天然存在的可變結構域，或其工程版本。工 程版本是指采用重組DNA工程技術構建的可變區(qū)結構域。該工程版本包 括那些例如通過在或向天然抗體的氨基酸序列中插入、缺失或改變，從 天然抗體可變區(qū)產生的可變區(qū)結構域。這種類型的具體例子包括那些含
有至少一個CDR并任選含有來自一個抗體的一或多個構架氨基酸和來自 第二個抗體的該可變區(qū)結構域的其余部分的工程可變區(qū)結構域。
可變區(qū)結構域可以在C端氨基酸上共價連接至少一個其它抗體結構域 或其片段。因此，例如當VH域存在于可變區(qū)結構域中時，其可以與免疫 球蛋白的Ch1域或其片段連接。同樣，Vl域可以與Ck域或其片段連接。 以此方式，例如抗體可以是Fab片段，其中抗原結合域含有在C端分別 共價連接了 (y和Q域的相關的、和、結構域。CH1域可以再增加兩個 氨基酸，例如用以提供如同F(xiàn)ab，片段中的鉸鏈區(qū)結構域，或提供其它結 構域例如抗體CH2和CH3域。
抗體片段的另一種形式是編碼單個互補決定區(qū)(CDR)的多肽。CDR 肽("最小識別單位")可以通過構建編碼目的抗體的CDR的基因來獲得。 該基因的制備方法例如使用聚合酶鏈式反應從產生抗體的細胞的RNA合 成可變區(qū)(見例如Larrick等，方法酶學方法手抓Methods: A Companion to Methods in Enzymology) 2:106, 1991; Courtenay-Luck,"單克隆 抗體的遺傳操作"，單克隆抗體生產、工程化和臨床應用(Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application), Ritter等(編)，第166頁(劍橋大學出版社1995);和Ward等，"抗 體的遺傳操作和表達"，單克隆抗體原理和應用，Birch等(編)，第137 頁(Wiley-Liss乂〉司1995))。
用于本發(fā)明的抗體一般可以是單克隆的(通過常規(guī)免疫和細胞融合程序制備的)，或者對于片段而言是通過采用任何合適的標準化學技術例如 還原或酶裂解和/或消化，例如通過胃蛋白酶處理獲得的。
更具體地，可以利用各種技術產生單克隆抗TGF-P結合蛋白抗體。 嚙齒類動物的針對特異抗原的單克隆抗體可以通過本領域技術人員所熟 知的方法獲得(見例如Kohler等，自然256:495， 1975;和Coligan等
(編)，當代免疫學實驗指南(Current Protocols in Immunology), 1:2.5. 1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan，，] ; Picksley等，
"針對大腸桿菌中所表達蛋白質的單克隆抗體的產生(Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli.)", DNA克隆2:表達系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第93頁(牛津大學出 版社1995))。
筒單地說，單克隆抗體可以通過如下步驟獲得給小鼠注射含有TGF-&結合蛋白基因產物的組合物，通過取出血清樣品驗證存在抗體的產生， 取出脾臟以獲得B淋巴細胞，融合B淋巴細胞和骨髓瘤細胞產生雜交瘤， 克隆雜交瘤，篩選產生抗該抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)產生抗該抗原 抗體的克隆，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離該抗體。
此外，本發(fā)明抗TGF-P結合蛋白抗體也可以來源于人單克隆抗體。 從經遺傳改造應答抗原刺激產生特異人抗體的轉基因小鼠獲得人單克隆 抗體。在該技術中，人的重鏈和輕鏈座位元件被導入胚胎干細胞系來源 的小鼠抹中，其中該胚胎干細胞系含有被定向破壞的內源性重鏈和輕鏈 座位。該轉基因小鼠可以合成特異針對人抗原的人抗體，而且該小鼠可 以用于產生分泌人抗體的雜交瘤。從轉基因小鼠獲得人抗體的方法描述 于例如Green等，自然遺傳學(Nature Genet. ) 7:13， 1994; Lonberg 等，自然368:856， 1994;和Taylor等，國際免疫學(Int. I咖un. )6:579， 1994。
可以通過各種成熟的技術從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。 這些分離技術包括用A蛋白S印harose進行的親和層析、大小排阻層析、 和離子交換層析(見例如Coligan，第2. 7.1-2. 7.12頁和第2. 9. 1-2. 9. 3 頁；Baines等，"免疫球蛋白G ( IgG)的純化"，分子生物學方法，第10巻，第79-104頁(The Humana出版公司1992))。
對于特定應用，可能希望制備抗TGF-P結合蛋白抗體的片段。這些 抗體片段可以通過例如抗體的蛋白水解來獲得?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法將整 個抗體進行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，獲得抗體片段。作為一個說明 例子，可以通過胃蛋白酶酶解抗,供稱為F(ab，)2的5S片段，產生抗 體片段?？梢允褂脦€基還原劑進一步裂解該片段，產生單價3.5S Fab，片 段。任選地，可以使用封閉二硫鍵斷裂所產生巰基的基團，進行該裂解 反應。作為替代方法，使用胃蛋白酶酶解直接產生兩個單價Fab片段和 一個Fc片段。這些方法描述于例如Goldenberg，美國專利4， 331, 647; Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89:230， 1960; Porter，生物 化學雜志(Biochem. J. )73:119， 1959; Edelman等，酶學方法(Methods in Enz，logy ) 1:422 (Academic出版社1967); 和Coligan第 2. 8. 1-2. 8. 10頁和第2. 10. —2. 10. 4頁。
還可以使用其它裂解抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價輕-重鏈 片段，片段的進一步裂解，或其它酶的、化學的或遺傳的技術，只要這 些片段能與完整抗體所識別的抗原結合即可。
或者，抗體可以是通過使用重組DNA技術，包括對編碼抗體可變和/ 或恒定區(qū)的DNA的操作和再表達，獲得的重組或工程抗體。這些DNA是 已知的和/或可以容易地從DM文庫包括例如噬菌體抗體文庫獲得(見 Chiswell， D J和McCafferty， J. Tibtech. 80-84 (1992))，或如 果需要，可以合成這些DNA?？梢允褂脴藴实姆肿由飳W和/或化學方法 測序和操作該DNA，以便例如按需要引入密碼子創(chuàng)造半胱氨酸殘基、或修 改、添加或缺失其它氨基酸或結構域。
由此，可以制備一或多個含有該DNA的可復制表達載體，并用以轉 化合適的細胞系，例如非產病毒性(non-producing)雜交瘤細胞系如小 鼠NS0系或細菌如大腸桿菌系，在其中進行抗體的生產。為了獲得有效 轉錄和翻譯，每個載體中的該DNA序列應該包括合適的調節(jié)序列，尤其 是可操作地與可變結構域序列連接的啟動子和前導序列。用于通過此方 式生產抗體的具體方法一般是熟知的，并且是常規(guī)使用的。例如，由Maniatis等描述的基本分子生物學程序(分子克隆(Molecular Biology), Cold Spring Harbor Laboratoty,紐約，1989); DNA測序 可以按Sanger等的描述(PNAS ^， 5463， (1977))和Amersham International pic測序手冊進行；而位點定向誘變可以根據Kramer等 (核酸研究12， 9441, ( 1984))的方法和Anglian生物技術有限公司手 冊來進行。此外，還有許多出版物詳細描述了適用于通過操作DNA、構建 表達載體和轉化合適細胞來制備抗體的技術，例如由Mountain A和Adair, J R在生物技術和遺傳工程綜述(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews) (Tombs, MP編，巡第1章，1992, Intercept, Andover,英國)中和國際專利說明書W091/09967中所評論的。
如果需要，根據本發(fā)明的抗體可以具有與之相連的一或多個效應或報 道分子，而且本發(fā)明擴展到這些修飾蛋白質。效應或報道分子可以通過 任何可利用的氨基酸側鏈、末端氨基酸或，如果存在的話位于抗體中的 糖功能基團，與抗體相連，當然總是假設這并不會對該分子的結合性質 和最終有效性產生不利影響。具體的功能基團包括例如任何游離的氨基、 亞氨基、巰基、鞋基、羧基或醛基?？贵w與效應和/或報道分子的連接可 以通過這些基團和效應或報道分子中的合適功能基團來實現(xiàn)。該連接可 以是直接的或間接的，通過間隔基團或橋連基團實現(xiàn)。
效應分子包括例如抗腫瘤劑、毒素(例如細菌或植物來源的酶活性毒 素和其片段，如篦麻毒素和其片段)、生物學活性蛋白質例如酶、核酸和 其片段如DNA、 RNA和它們的片段、天然存在的和合成的聚合物如多糖和 聚烷撐聚合物(polyalkylene polymer)如聚(乙二醇)和其衍生物、 放射性核素尤其是放射性碘、和螯合金屬。合適的報道基團包括螯合金 屬、熒光化合物或可以通過NMR或ESR光譜學檢測的化合物。
具體的抗腫瘤劑包括細胞毒性和細胞抑制試劑，例如烷化劑如氮芥 (nitrogen mustard )(如笨丁酸氮芥、美法侖、氮芥 (mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺或烏拉莫司汀)和其衍生物、三亞乙基 磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺、白消安、或順鉑；抗代謝物例如氨甲蝶 呤、氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、氟乙酸或氟檸檬酸；抗生素，例如博來霉素(如博來霉素>^酸鹽)、阿霉素、 道諾紅霉素、絲裂霉素(如絲裂霉素c)、放線菌素(如放線菌素D)、普
卡霉素、加利車霉素(calichaemicin)和其衍生物、或埃斯波霉素和其 衍生物；有絲分裂抑制劑例如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、長春新堿或長春 堿和它們的衍生物；生物堿，例如玫瑰樹堿；多元醇例如taxicin-I或 taxicin-II;激素例如雄激素(如屈他雄酮或睪內脂)、孕酮(如醋酸甲 地孕酮或醋酸甲羥孕酮)、雌激素(二甲基己烯雌酚二磷酸酯 (dimethylstiblestrol diphosphate )、聚磷酸雌二醇或雌二醇氮芥褲 酸酯(estramustine phosphate))或抗雌激素(如三笨氧胺)；蒽疲例 如米托蒽醌；脲例如羥基脲；肼例如甲基千肼；或咪唑例如達卡巴漆。
尤其有用的效應基團是加利車霉素和其衍生物(見例如南非專利說明 書85/8794、 88/8127和90/2839)。
鏊合金屬包括具有2-8 (包括2和8)配位數(shù)的正二價或三價(di-or tripositive)金屬鏊合物。該金屬的具體例子包括锝(Tc )、錸(Re )、 鈷(Co)、銅(Cu)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、鉍(Bi)、銦(In)、鎵(Ga)、 釔(Y)、鋱(Tb)、釓(Gd)和鈧(Sc)。 一般地，該金屬優(yōu)選是放射性核素。 具體的放射性核素包括"-Tc、 186Re、 188Re、 58Co、 ^Co、 67Cu、 195Au、 199Au、 110Ag、 203Pb、 206Bi、 207Bi、 mIn、 67Ga、朋Ga、朋Y、 ，、 160Tb、 153Gd和47Sc。
該鏊合金屬可以是例如被任何適合的多齒鍫合劑鐾合的上述金屬類型 之一，這些鏊合劑例如無環(huán)或環(huán)狀多胺、多醚(如冠醚和其衍生物)；聚 跣胺；p卜淋；和碳環(huán)衍生物(carbocyclic derivatives)。
一般地，鏊合劑的類型取決于所用金屬。然而，在根據本發(fā)明的偶聯(lián) 物中一組尤其有用的鏊合劑是無環(huán)多胺和環(huán)狀多胺，特別是聚氨基羧酸 (polyaminocarboxylic acid)夯!l如二亞乙基三胺五乙酸和其衍生物，和 大環(huán)胺(macrocyclicamine)例如環(huán)狀三氮雜(aza)和四氮雜衍生物(例 如國際專利說明書WO 92/22583中所描述的)；以及聚酰胺，特別是去鐵 銨和其衍生物。
因此，例如當希望在抗體中使用巰基作為連接點時，這可以通過與存 在于效應或報道分子中的巰基反應性基團反應來實現(xiàn)。這些基團的例子包括4-卣羧酸或酯(4-halcarboxylic acid or ester)例如碘乙酰胺、 二酰亞胺例如順丁烯二醜亞胺、乙歸砜、或二硫化物。這些和其它合適 的連接程序一般地和更為具體地描述于國際專利說明書WO 93/06231、 WO 92/22583、 WO 90/091195和WO 89/01476。
篩選增加骨密度的分子的方法
如上所討論的，本發(fā)明提供用于篩選和/或分離能夠增加骨密度的化 合物的方法。例如，在本發(fā)明的一個方面中，提供用于確定所選分子是 否能夠增加骨礦質含量的方法，包括步驟(a)將所選分子與TGF-P結合 蛋白和TGF-P蛋白質家族的一個選定成員混合，(b)測定該所選分子是否 刺激了通過TGF-P蛋白質家族進行的信號轉導、或抑制了 TGF-P結合蛋 白與TGF-P蛋白質家族的結合。在某些實施方案中，該分子增強TGF-P 作為間充質細胞分化的正調節(jié)物起作用的能力。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質含 量的方法，包括步驟(a)將所選分子暴露于表達TGF-P結合蛋白的細胞， 和(b)測定所述暴露細胞的TGF-P結合蛋白的表達(或活性)是否降低， 并由此確定該化合物是否具有增加骨礦質含量的能力。在一個實施方案 中，該細胞選自從骨活組織檢查獲得的自發(fā)轉化或未轉化正常人骨和大 鼠頂骨的成骨細胞。該方法可以通過許多種試驗形式來完成，包括例如 對流免疫電泳(CIEP)、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測 定(ELISA)、斑點印跡試驗、抑制或竟爭試驗、以及三明治試驗(sandwich assays )(見美國專利4, 376, 110和4, 486， 530;也見抗體實驗室手冊 (Antibodies: A Laboratory Manual), 同上)。
在以下的實施例5和6中提供了這些試驗方法的代表性實施方案。 簡單地說，首先將TGF-P超家族的家族成員或TGF-P結合蛋白與固相支 持物結合，隨后加入候選分子。然后，向該測試試驗中加入標記的TGF-P超家族的家族成員或TGF-P結合蛋白，洗滌固相支持物，并測定該固 體支持物上結合的或標記的TGF-P超家族成員或TGF-P結合蛋白的量。 本文所描述的適用于增加骨礦質含量的分子是那些以統(tǒng)計學上顯著的方式降低TGF-P結合蛋白與TGF-P超家族的一個或多個成員結合的分子。 明顯地，在本發(fā)明中適用的試驗方法應不限于實施例2和3中所描述的 實施方案。尤其是，可以改變許多參數(shù)，例如通過TGF-P與固相支持物 的結合，或完全去除固相等方式來改變。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質含 量的方法，包括步驟(a)將所選分子暴露于表達TGF-P的細胞，和(b) 測定所述暴露細胞的TGF-P活性是否發(fā)生改變，并由此確定該化合物是 否具有增加骨礦質含量的能力。與上述方法相同，可以利用多種方法來 評價由于所選測試化合物導致的TGF-P結合蛋白表達的改變。
例如，在本發(fā)明的一個方面，提供確定所選分子是否能夠增加骨礦質 含量的方法，包括步驟(a)將所選分子與TGF-P結合蛋白和TGF-P蛋 白質家族的一個選定成員混合，(b)測定該所選分子是否上調了 TGF-P蛋 白質家族的信號轉導、或抑制了 TGF-P結合蛋白與TGF-P蛋白質家族的 結合。在某些實施方案中，該分子增強TGF- P作為間充質細胞 (mechemchymal cell)分化的正調節(jié)物起作用的能力。
與上述方法相同，可以利用許多種方法來評價由于所選測試化合物引 起的TGF-P刺激作用。以下實施例6中提供了一個這樣的代表性方法(也 見Durham等，Endo. 136:1374-1380)。
在本發(fā)明的再其它方面，提供確定所選分子是否能增加骨礦質含量的 方法，包括步驟測定所選分子是否抑制TGF-P結合蛋白與骨或其類似 物的結合。如本文中所用的，應當理解骨或其類似物是指羥基磷灰石、 多由粉狀形式的骨、壓碎的骨或完整的骨構成的表面。與上述方法相同， 可以利用許多種方法來評價對TGF-P結合蛋白定位到骨基質的抑制。以 下實施例7中提供了一個這樣的代表性方法。
應當指出的是，盡管本文列舉的這些方法可以指對單一測試分子的分 析，但本發(fā)明并不應由此受到限制。尤其是，所選分子可以包含在化合 物的混合物中。因此，所列舉的方法可以進一步包含步驟分離抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的分子。候選分子
對許多種分子都可以測試其抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員 結合的能力。代表性例子包括有機分子、蛋白質或肽、和核酸分子，以 下將作更為詳細的討論。盡管從以下討論來看，明顯地本文所述候選分 子可以用于本文所述的測定，但也應易于明了這些分子還可以用于各種 診斷和治療應用。
1.有機分子
對于許多有機分子都可以測定其抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族 成員結合的能力。
例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，合適的有機分子選自化學制品庫 (chemical library),其中對化學制品作單獨測定，或選自組合化學制
品庫，其中對多個化合物同時進行測定，然后展開以確定和分離具有最 高活性的化合物。
這些組合化學制品庫的典型例子包括由如下文獻描述的組合化學制品 庫Agrafiotis等，"自動產生具有期望性質的化學化合物的系統(tǒng)和方法
(System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties)，，, 美國專利5， 463, 564; Armstrong, R. W.,
"通過應用多成分組合陣列合成法合成有機化合物組合陣列(Synthesis of combirmtorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses) ，，, TO 95/02566; Baldwin, J. J.等，"磺胺衍生物和其應用"，W0 95/24186; Baldwin, J. J. 等,"且合二氬笨并畎喃庫 (combinatorial dihydrobenzopyran library)", W0 95/30642; Brenner, S.，"用于制備組合庫的新試劑盒"， W0 95/16918; Chenera， B.等，"樹脂結合的芳香族碳環(huán)化合物的文庫制 備"，W0 95/16712; Ellman, J. A.,"在固體支持物上固相和組合合成苯
(并)二氮革類化合物庫"，美國專利5,288,514; Felder, E.等，"新 組合化合物文庫"，WO 95/16209; Lerner, R.等，"編碼的組合化學文庫"， W0 93/20242; Pavia， M. R.等，"從結構上各異的通用文庫制備和篩選藥 物學上有用的非肽化合物的一種方法"，W0 95/04277; Summerton， J. E.和D.D. Weller，"嗎啉代-亞基組合文庫和方法"，美國專利5，506，337; Holmes， C.,"用于固相合成thiazolidinones、 matathiazanones和它們的 衍生物的方法"，WO 96/00148; Phillips, GB.和GP. Wei,"固相合成苯 并咪唑"，Tet. Letters 37:4887-卯，1996; Ruhland， B.等，"結構各異的P 內酰胺的固體支持組合合成"，美國化學學會雜志(J. Amer. Chem. Soc.) 111:253-4， 1996; Look, GC.等，"從4-噢唑烷組合文庫中鑒定環(huán)加氧酶-l 的抑制物"，Bioorg and Med. Chem, Letters 6:707-12， 1996。
2.蛋白質和肽
廣泛的蛋白質和肽同樣可以用作TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成 員結合的抑制物候選分子。
a. 組合肽文庫
可以通過組合肽文庫的篩選獲得可能是TGF- P結合蛋白與TGF- P 家族成員結合的抑制物的肽分子。這些文庫可以由本領域技術人員制備 (見例如美國專利4，528，266和4,359,535以及專利合作條約公開文本 WO 92/15679、 WO 92/15677、 WO 90/07862、 WO 90/02809)或從商業(yè) 途徑購買(例如New England Biolabs Ph.D.TM噬菌體展示肽文庫試劑 盒)。
b. 抗體
考慮到本文提供的此公開，可以容易地制備抑制TGF- P結合蛋白與 TGF-P家族成員結合的抗體。在本發(fā)明范圍內，抗體被理解為包括單克 隆抗體、多克隆抗體、抗獨特型抗體、抗體片段(例如Fab和F(ab，)2、 Fv可變區(qū)、或互補決定區(qū))。正如以上所討論的，如果抗體以大于或等 于107 M_1，優(yōu)選大于或等于108 的Ka與TGF- P結合蛋白或特定的 TGF-P家族成員結合，而不與或以小于或等于106 M-1的Ka與其它的 TGF-P結合蛋白結合，則該抗體被理解為是特異針對TGF-P結合蛋白 或特定的TGF- P家族成員的。而且，本發(fā)明的抗體應當阻斷或抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員的結合。
本領域普通技術人員可以容易地確定單克隆抗體或結合伴倡
53(partner)的親和力，以及結合的抑制(見Scatchard， Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。
簡單地說，本領域普通技術人員可以容易地從各種恒溫動物例如馬、 奶牛、各種家禽、兔、小鼠或大鼠產生多克隆抗體。典型地，使用TGF-P結合蛋白或其13-20個氨基酸的獨特肽(優(yōu)選通過使用戊二醛形成的 交聯(lián)與匙孔血藍蛋白偶聯(lián))，聯(lián)合佐劑例如Freund完全或不完全佐劑一 起，通過腹膜內、肌肉內、眼內、或皮下注射免疫動物。幾次加強免疫 后，收集血清樣品并檢測其對所述蛋白質或肽的反應性。尤其優(yōu)選的多 克隆抗血清將在一個這些試驗中給出至少高于背景三倍的信號。依據動 物對蛋白質的反應性， 一旦動物的效價達到平臺，則通過每周給動物放 血或抽血可以容易地獲得更大量的抗血清。
單克隆抗體還可以容易地采用常規(guī)技術產生(見以參考文獻方式并入 本文的美國專利RE 32， 011、 4,902,614、 4， 543， 439和4， 411， 993;也 見單克隆抗體，雜交瘤生物學分析中的一個方面(Monoclonal Antibodies, Hybrido邁as: A New Dimension in Biological Analyses), Plenum出版社，Kennett, McKearn和Bechtol(編)，1980; 和抗體實驗室手冊(Antibodies: A Laboratoty Manual), Harlow和 Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988，該文獻也以 參考文獻方式并入本文)。
簡單地說，在一個實施方案中，按以上描述，用TGF-P結合蛋白或 其部分免疫受試動物例如大鼠或小鼠。為了增強最終所獲的免疫應答， 可以將該蛋白與佐劑例如Freund完全或不完全佐劑混合。在最初免疫后 的一至三周之間，可以再用一次加強免疫對動物進行再免疫，并使用以 上描述的試驗檢測其對蛋白質的反應性。 一旦動物對注射蛋白質的反應 性達到平臺，即可將其處死，并收獲含有大量B細胞的器官例如脾和淋 巴結。
從被免疫動物獲得的細胞可以通過病毒例如埃-巴二氏病毒(EBV)感 染而永生化(見Glasky和Reading,雜交瘤(Hybridoma) 8(4) :377-389, 1989)。或者，在一個優(yōu)選的實施方案中，為了產生分泌單克隆抗體的"雜
54交瘤"，將收獲的脾和/或淋巴結細胞懸浮物與合適的骨髓瘤細胞融合。
合適的骨髓瘤系包括例如NS-1 ( ATCC TIB 18)和P3X63- Ag 8. 653 ( ATCC CRL 1580)。
在融合后，可以將細胞置于含有合適培養(yǎng)基例如RPMI 1640或DMEM (Dulbecoo氏修改的 Eagles培養(yǎng)基)(JRH Biosciences, Lenexa， Kansas)以及添加成分例如胎牛血清(即FBS,來自Hyclone， Logan, Utah, 或JRH Biosciences)的培養(yǎng)板中。此外，該培養(yǎng)基應含有選擇性地允許 脾和骨髓瘤融合細胞生長的試劑例如HAT (次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷) (Sigma Chemical公司,St. Louis, Missouri )。在大約7天后，可以 對所獲的融合細胞或雜交瘤進行篩選，以確定抗TGF-P結合蛋白(取決 于所用抗原)，并阻斷或抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的 抗體的存在。
有許多種試驗可以用以確定抗本發(fā)明蛋白質的抗體的存在，包括例如 對流免疫電泳、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、斑點印跡試驗、Western印跡、免疫沉淀、抑制或竟爭試驗、 以及三明治試驗(見例如美國專利4, 376,110和4, 486， 530;也見抗體 實驗室手冊(Antibodies: A Laboratory Manual )， Harlow和Lane (編)， Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988)。幾次克隆稀釋和再次試 驗之后，可以分離產生抗目的蛋白質抗體的雜交瘤。
也可以使用其它技術構建單克隆抗體(見William D. Huse等，"在 入噬菌體中產生具有免疫球蛋白譜的大型組合文庫"，科學(Science) 246:1275-1281， 1989年12月；也見L. Sastry等，"在大腸桿菌中克 隆免疫球蛋白的所有組成成分以產生單克隆催化抗體重鏈可變區(qū)特異 性cDNA文庫的構建"，美國國家科學院院刊86:5728-5732, 1989年8 月；還見Michelle Alting-Mees等，"單克隆表達文庫雜交瘤的一種 快速替代法55,分子生物學策略(Strategies in Molecular Biology) 3:1-9,1990年1月)。這些文獻描述了可從Stratagene (La Jolla, California)獲得的一個商業(yè)系統(tǒng)，該商業(yè)系統(tǒng)能夠通過重組技術產生抗 體。簡單地說，從B細胞群體分離mRNA,用以在入I咖unoZap(H)和入I,unoZ鄰(L)載體中構建重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表達文庫。這些載 體可以單獨進行篩選，也可以共表達以形成Fab片段或抗體(見Huse等， 同上；也見Sastry等，同上)。隨后可以將陽性噬菌斑轉變成允許從大 腸桿菌高水平表達單克隆片段的非裂解性質粒。
同樣，也可以采用常規(guī)酶消化，或重組DNA技術以插入編碼特異結合 抗體的基因的可變區(qū)，構建抗體的部分或片段例如Fab和Fv片段。在一 個實施方案中，使用針對可變區(qū)的核苦酸引物從產生目的單克隆抗體的 雜交瘤擴增編碼可變區(qū)的基因。這些引物可以由本領域普通技術人員合 成，或可以從商業(yè)途徑購買。Stratagene (La Jo 11 a， California)出售 針對小鼠和人可變區(qū)的引物，包括尤其是針對V他、Vft、 V比、Vw、 Ch!、、 和Cl區(qū)的引物。可以使用這些引物擴增重鏈或輕鏈可變區(qū)，然后可以將 其分別插入載體例如ImmunoZAP H或ImmunoZAP L (Stratagene)。之 后這些栽體可以被導入基于大腸桿菌、酵母或哺乳動物的系統(tǒng)中進行表 達。使用這些技術，可以產生大量含有融合的VH和VL域的單鏈蛋白質(見 Bird等，科學242:423-426， 1988)。此外，可以使用這些技術在不改 變抗體結合特異性的情況下，將"鼠"抗體改變成"人"抗體。
一旦獲得合適的抗體，即可以通過本領域普通技術人員熟知的許多技 術對其進行分離或純化(見抗體實驗室手冊，Harlow和Lane (編)，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1988)。合適的技術包括狀或蛋白 質親和柱、HPLC或RP-HPLC、在A蛋白或G蛋白柱上純化、或任何這些 技術的組合。
c. 突變的TGF-P結合蛋白
正如本文和如下實施例(例如實施例8和9)中所描述的，與天然TGF-P結合蛋白阻斷特定TGF-P家族成員活性的能力竟爭的TGF-P結合蛋白 修改版本應該會導致骨密度的增加。因此，結合TGF-P家族成員但不抑 制該TGF-P家族成員功能的TGF-P結合蛋白突變體將符合此標準。該突 變版本必須有效地與TGF-P結合蛋白的內源性抑制功能相竟爭。
d. 蛋白質的產生
盡管本文已提供了各種基因(或其部分)，但應該理解，在本發(fā)明的范圍內，對一或多個這些基因的提及包括與這些基因基本相同的這些基 因的衍生物(以及，如果合適的話，包括由這些基因和它們的衍生物編
碼的蛋白質(包括肽和多肽))。正如本文所用的，如果(a)—個核苷^
序列的等位基因變異，或者編碼抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員 結合的分子，(b)核苷酸序列能夠與本發(fā)明的核苷酸序列在中、高或極高 的嚴緊條件下雜交(見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Mannual ), 第 2版,Cold Spring Harbor Laboratory出版社，紐約，1989)，或(c)由于遺傳密碼子的原因，DNA 序列與(a)或(b)中所定義的DNA序列是簡并的，則該核苷酸序列被認為 是"基本相同的"。而且，本文公開的核酸分子包括互補和非互補序列， 前提是該序列在其它方面符合本文提出的標準。在本發(fā)明的范圍內，高 嚴緊性是指標準雜交條件(例如，5xSSPE， 0.5%SDS, 或相當?shù)?條件)。-
使用例如P/C Gene或Intelligenetics軟件包(Intelligenetics， Mountain View, California)的疏水性繪圖功能，或根據Kyte和 Doolittle (分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 157:105-132， 1982)描 述的方法，本文所述核酸分子編碼的蛋白質的結構可以從一級翻譯產物 預測。
本發(fā)明蛋白質可以以酸式鹽或堿式鹽的形式，或以中性形式制備。此 外，單個氨基酸殘基可以通過氧化或還原進行修飾。而且，可以在氨基 酸和核酸序列上進行各種替代、缺失或添加，其凈效應是保持或進一步 增強或降低突變或野生型蛋白的生物學活性。而且，例如由于遺傳密碼 子的筒并性，在編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列中，可以有相當多的 變異。
本文公開的蛋白質的其它衍生物包括該蛋白質與其它蛋白質或多肽的 結合物。這可以通過例如合成其加入可能有利于蛋白質純化或鑒定的N-端或C-端融合蛋白來實現(xiàn)(見美國專利4,851,341;也見Hopp等， Bio/Technology 6:1204, 1988)?；蛘撸梢詷嫿ㄖT如Flag/TGF-p結合蛋白的融合蛋白，以有助于該蛋白質的筌定、表達和分析。
本發(fā)明蛋白質可以采用本文所述的多種技術構建。而且，可以通過合 成含有突變序列的寡核苷酸在特定位置引入突變，而且該寡核苷酸的兩 側具有限制性位點，使得其能夠與該天然序列片段連接。連接之后，所 獲的重組序列編碼具有期望的氨基酸插入、替換或缺失的衍生物。
或者，可以使用寡核苷酸指導的位點特異性(或片段特異性)誘變程 序，提供根據要求的替換、缺失或插入改變了特定密碼子的改變基因。
進行如上所述改變的示例性方法公開于Walder等(基因42:133， 1986); Bauer等(基因37:73, 1985); Craik ( BioTechniques， 1985年1月， 12-19); Smith等(遺傳工程原理和方法(Genetic Engineering: Principles and Methods), Plenum出版社，1981);和Sambrook等(同 上)。還可以通過使用與所期望缺失相鄰的方便限制性內切核酸酶位點， 構建缺失或截短的蛋白質衍生物(例如可溶性細胞外部分)。在限制性消 化后，可以補平突出端、然后重新連接該DNA。進行如上所述改變的典型 方法公開于Sambrook等(分子克隆實驗室指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989)。
在本發(fā)明核酸分子中產生的突變優(yōu)選保持編碼序列的閱讀框。而且這 些突變優(yōu)選不形成能夠雜交產生mRNA 二級結構例如環(huán)或發(fā)夾結構的互補 區(qū)，這些二級結構將對mRNA的翻譯產生不利影響。盡管可以預先決定突 變位點，但并不必預先決定突變本身的性質。例如，為了篩選在指定位 點具有最佳特性的突變，可以在靶密碼子處進行隨機誘變，然后篩選具 有指明生物學活性的表達突變體?；蛘?，可以通過合成如下寡核苷酸在 特定位置引入突變，該寡核苷酸含有突變序列，而且兩翼具有使其能夠 與該天然序列的片段連接的限制性位點。連接后，所獲的重組序列編碼 具有期望的氨基酸插入、替換或缺失的衍生物。
也可以采用PCR誘變技術、化學誘變技術(Drinkwater和Klinedinst, PNAS 83:3402-3406， 1986)、強制核苷酸4fi吳摻入(forced nucleotide misincorportation)(例如Liao和Wise基因88:107-111, 1990)、或 使用隨機誘變處理的寡核苷酸(Horwitz等，基因組(Genome) 3:112-117，1989)來構建編碼本發(fā)明蛋白質的核酸分子。
本發(fā)明還提供通過培養(yǎng)含有能表達上述基因的載體的宿主細胞對上述 基因進行的操作和表達。這些載體或載體結構包括合成的或cDNA來源的， 可操作地與合適的轉錄或翻譯調節(jié)元件連接的，編碼目的蛋白質的核酸 分子。合適的調節(jié)元件可以從各種來源獲得，包括細菌、真菌、病毒、 哺乳動物、昆蟲或植物基因。適合調節(jié)元件的選擇取決于所選擇的宿主 細胞，而且可以容易地由本領域普通技術人員完成。調節(jié)元件的例子包 括轉錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結合序列、轉錄終止子、以及核 糖體結合序列，包括翻譯起始信號。
編碼上述任一種蛋白質的核酸分子可以容易地由許多種原核和真核宿 主細胞表達，這些宿主細胞包括細菌、哺乳動物、酵母或其它真菌、病 毒、昆蟲、或植物細胞。轉化或轉染這些細胞以表達外源DNA的方法是 本領域所熟知的(見例如Itakura等，美國專利4， 704， 362; Hinnen等， 美國國家科學院院刊 75:1929-1933, 1978; Murray等，美國專利 4,801,542; Upshall等，美國專利4,935,349; Hagen等，美國專利 4,784,950; Axel等，美國專利4,399,216; Goeddel等，美國專利 4， 766， 075;和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1989;對于植物細胞，見Czako和Marton, 植物生理學(Plant Physiol. ) 104:1067-1071， 1994;和Paszkowski 等，生物技術(Biotech. ) 24:387-392, 1992)。
適于實施本發(fā)明的細菌宿主細胞包括大腸桿菌(E. coli)、枯草芽 孢桿菌(B. subtilis)，鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimuriu邁)， 和假單胞菌屬(Pseudomonas)、 鏈霉菌屬(str印tomyces)和葡萄球菌屬 (staphylococcus)的各個種，以及本領域普通技術人員熟知的許多其它 細菌種。細菌宿主細胞的代表性例子包括DH5a (Stratagene, Lajolla, California^
細菌表達載體優(yōu)選含有在宿主細胞中起作用的啟動子、 一或多個表型 選擇標記、以及細菌復制原點。典型的啟動子包括p-內酰胺酶(青霉素 酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(見Chang等，自然275:615， 1978)、 T7 RNA聚合酶啟動子(Studier等，酶學方法(Meth. Enzymol. ) 185:60-89, 1990)、 入啟動子(Elvin等，基因87:123-126, 1990)、 trp啟動子(Nichols 和Yanofsky，酶學方法101:155, 1983)和tac啟動子(Russell等， 基因20:231， 1982)。典型的選擇標記包括各種抗生素抗性標記例如卡那 霉素或氨芐青霉素抗性基因。適用于轉化宿主細胞的許多質粒是本領域 所熟知的，包括尤其是pBR322 (見Bolivar等，基因2:95， 1977)， pUC 質粒pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC119(見Messing,酶學方法101:20-77， 1983;和Vieira和Messing,基因19:259-268, 1982 )，和pNH8A、 pNH16a、 p腿8a, 以及Bluescript M13(Stratagene， La Jolla， California)。
適用于實施本發(fā)明的酵母和真菌宿主細胞包括尤其是Saccharomyces pombe、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、 畢赤酵母屬(Pichia) 或克魯維酵母菌屬(kluyveromyces )、以及曲霉屬(Aspergillus)的各 個種(McKnight等，美國專利4,935， 349)。對于酵母和真菌而言，適合 的表達載體包括尤其是用于酵母的YCp50 (ATCC 37419)、和amdS克隆 載體pV3 (Turnbull， Bio/Technology 7:169， 1989)、 YRp7 (Struhl 等，美國國家科學院院刊76:1035-1039， 1978)、 YEpl3 (Broach等， 基因8:121-133， 1979)、 pJDB249和pJDB219 ( Beggs，自然275:104— 108, 1978)，以及它們的衍生物。
用于酵母的優(yōu)選啟動子包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，生 物化學雜志(J. Biol. Chem. ) 255:12073-12080， 1980; Alber和 Kawasaki,分子應用遺傳學雜志(J. Mol. Appl. Genet.) 1:419-434, 1982)或醇脫氫酶基因(Young等，用于產生化學制品的微生物遺傳工程 (Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals X Hollaender 等(編)，第355頁，Plenum,紐約，1982; Ammerer,酶學方法(Meth. Enzymol. ) 101:192-201， 1983)的啟動子。對于真菌載體有用的啟動子 的例子包括那些來源于構巢曲霉(Aspergillus nidulans )糖酵解基因 的啟動子，例如adh3啟動子(McKnight等，EMB0J. 4:2093-2099， 1985)。 該表達單元還可以包括轉錄終止子。適合的終止子的一個例子是adh3終 止子(McKnight等，同上，1985)。如同細菌載體一樣，酵母載體一般也包括選擇標記，其可以是表現(xiàn)顯 性表型的許多基因中的任意一種，條件是對于該顯性表型存在一種能夠 篩選轉化體的表型試驗。優(yōu)選的選擇標記是那些補充宿主細胞的營養(yǎng)缺
陷、提供抗生素抗性或使細胞能夠利用特殊碳源的選擇標記，包括leu2 (Broach等，同上)、ura3( Botstein等，基因8:17， 1979 )或his3( Struhl 等，同上)。另一個適合的選擇標記是賦予酵母細胞氯霉素抗性的cat基因。
用于轉化真菌的技術在文獻中有很好的說明，見例如Beggs (同上)、 Hinnen等(美國國家科學院院刊75:1929-1933， 1978)、 Yelton等(美 國國家科學院院刊81:1740-1747， 1984)和Russell(自然301:167-169, 1983)。宿主細胞的基因型可以含有由表達載體上存在的選擇標記彌補的 遺傳缺陷。對于具體宿主和選擇標記的選擇是本領域熟知的。
轉化酵母的方法也是本領域普通技術人員所熟知的。例如，通過制備 帶有DNA的酵母原生質球(見Hinnen等，美國PNAS 75:1929， 1978) 或通過用堿式鹽(alkaline salts)例如LiCl處理(見Itoh等，細菌 學雜志(J. Bacteriology) 153:163， 1983)，可以容易地實現(xiàn)轉化。真 菌轉化還可以采用聚乙二醇按Cullen等描述的方法(Bio/Technology 5:369, 1987)進行。
病毒載體包括那些含有指導編碼上述目的蛋白質的分離核酸分子表達 的啟動子的病毒載體。在本發(fā)明的范圍中可以使用許多種啟動子，包括 例如諸如MoMLV LTR、 RSV LTR、 Friend MuLV LTR的啟動子、腺病毒啟 動子(0hno等，科學265:781-784， 1994)、新霉素磷酸轉移酶啟動子/ 增強子、細小病毒晚期啟動子(Koering等，人類基因治療(Hum. Gene Ther鄰.)5:457-463， 1994)、皰* TK啟動子、SV40啟動子、金屬硫蛋 白IIa基因增強子/啟動子、巨細胞病毒的立即早期啟動子、和巨細胞病 毒的立即晚期啟動子。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方案中，該啟動子是組 織特異性啟動子(見例如W0 91/02805; EP 0,415， 731;和W0 90/07936 )。 適合的組織特異性啟動子的代表性例子包括神經特異性烯醇化酶啟動 子、血小板來源的生長因子p的啟動子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質啟動子、人al-chimaerin啟動子、突觸蛋白I啟動子和突觸蛋白II啟動子。除了 上述啟動子外，為了靶向病毒、細菌、真菌或寄生物感染的特定細胞或 組織，還可以使用其它的病毒特異性啟動子(例如逆轉錄病毒啟動子， 包括以上提到的逆轉錄病毒啟動子以及其它啟動子如HSV啟動子)，肝炎、 皰滲(例如EBV)、和細菌、真菌或寄生物(例如瘧疾)的特異性啟動子。
適用于實施本發(fā)明的哺乳動物細胞包括尤其是COS、 CHO、 SaOS、骨 肉瘤細胞、KS483、 MG-63、原始成骨細胞、和人或哺乳動物的骨髓基質。 用于實施本發(fā)明的哺乳動物表達載體包括能夠指導克隆基因或cDNA轉錄 的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括病毒啟動子和細胞啟動子。骨特異性啟動 子包括骨唾液酸蛋白(sialo-protein)和骨鈣蛋白啟動子。病毒啟動子 包括巨細胞病毒立即早期啟動子(Boshart等，細胞(Cell) 41:521-530, 1985)、巨細胞病毒立即晚期啟動子、SV40啟動子(Subramani等，分子 細胞生物學(Mol. Cell Biol. ) 1:854-864， 1981)、匿V LTR、 RSV LTR、 金屬硫蛋白-1、腺病毒Ela。細胞啟動子包括小鼠金屬硫蛋白-1啟動子 (Palmiter等，美國專利4， 579， 821 )、小鼠VK啟動子(Bergman等，美 國國家科學院院刊81:7041-7045， 1983; Grant等，核酸研究15:5496， 1987)和小鼠^啟動子(Loh等，細胞33:85-93, 1983)。啟動子的選 擇至少部分地取決于所期望的表達水平或待轉染的受體細胞系。
這些表達栽體還可以含有一套位于啟動子下游以及編碼目的肽或蛋白 質的DNA序列上游的RNA拼接位點。優(yōu)選的RNA拼接位點可以>^病毒 和/或免疫球蛋白基因獲得。在該表達載體中還含有位于目的編碼序列下 游的fJ泉苷酸化信號。適合的fJ^苷酸化信號包括SV40的早期或晚期聚 腺苷酸化信號(Kaufman和Sharp,同上)、腺病毒5 E1B區(qū)的^J泉苷酸 化信號和人生長激素基因終止子(DeNoto等，核酸研究9:3719-3730, 1981)。該表達載體可以包括位于啟動子和RNA拼接位點之間的非編碼病 毒前導序列，例如腺病毒2的三聯(lián)前導序列。優(yōu)選的載體還可以包括增強 子序列例如SV40增強子。表達載體還可以包括編碼腺病毒VA RNAs的序 列。適合的表達載體可以從商業(yè)途徑獲得(例如Stratagene， La Jo 1 la, CaliforniaX含有克隆DNA的載體結構可以通過例如磷酸^5介導的轉染(Wigler 等，細胞14:725, 1978; Corsaro和Pearson,體細胞遺傳學(Somatic Cell Genetics) 7:603， 1981; Graham和Van der Eb,病毒學(Virology) 52:456, 1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J. 1:841-845， 1982)或 DEAE-葡聚糖介導的轉染(Ausubel等(編)當代分子生物學實驗指南 (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons公 司，紐約，1987)導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。為了鑒定穩(wěn)定整合了克隆 DNA的細胞， 一般將選擇標記與目的基因或cDNA —起導入細胞。用于哺 乳動物培養(yǎng)細胞的優(yōu)選選擇標記包括賦予藥物例如新霉素、潮霉素和氨 甲蝶呤抗性的基因。該選擇標記可以是可擴增的選擇標記。優(yōu)選的可擴 增選擇標記是DHFR基因和新霉素抗性基因。選擇標記的綜述見Thilly (哺 乳動物細胞技術(Mammalian Cell Technology), Butterworth Publishers, Stoneham， Massachusetts, 該文獻以參考文獻形式并入本 文)。
在開始表達目的DNA序列之前，使含有適合載體的哺乳動物細胞生 長一段時間，典型地是1-2天。然后應用藥物篩選選擇以穩(wěn)定方式表達 選擇標記的細胞的生長。對于可擴增選擇標記轉染的細胞，可以逐步增 加藥物濃度以選擇增加的克隆序列拷貝數(shù)，由此選擇增加的表達水平。 選擇和篩選以期望形式或以期望水平產生目的蛋白質的表達導入序列的 細胞。然后可以克隆滿足這些標準的細胞，并按比例放大用于生產。
用于轉染哺乳動物細胞的操作是本領域普通技術人員所熟知的。典型 的方法包括磷酸釣介導的轉染、電穿孔、脂轉染、逆轉錄病毒、腺病毒 和原生質體融合介導的轉染(見Sambrook等，同上)。棵載體結構也可 以在注射至哺乳動物(或其它動物)的肌肉中后被肌細胞或其它適合的 細胞攝取。
根據本說明書，本領域已知的許多昆蟲宿主細胞也可以用于本發(fā)明。 例如，Atkinson等(Pestic. Sci. 28:215-224, 1990)綜述了桿狀病 毒作為在昆蟲細胞中表達外源DNA序列的載體的應用。
根據本說明書，本領域已知的許多植物宿主細胞也可以用于本發(fā)明。例如Sinkar等(J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58， 1987)綜述了毛 根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes )作為在植物細胞中表達基因的 栽體的應用。1
在本發(fā)明的相關方面，可以在其生殖細胞和體細胞含有編碼目的蛋白 質的基因，而且該基因可操作地與對于該基因表達有效的啟動子相連的 轉基因動物中，表達本發(fā)明的蛋白質?；蛘?，以類似的方式，可以制備 缺乏目的基因的轉基因動物(例如，"基因敲除"小鼠)?？梢栽诟鞣N非 人類動物，包括小鼠、大鼠、兔、綿羊、狗、山羊和豬中制備這樣的轉 基因動物(見Hammer等，自然315:680-683， 1985; Palmiter等，科學 222:809-814, 1983; Brinster等，美國國家科學院院刊82:4438-4442， 1985; Palmiter和Brinster,細胞41:343-345， 1985，和美國專利 5,175,383、 5,087,571、 4,736,866、 5,387,742、 5,347,075、 5,221,778 和5,175,384)。簡單地說，通過例如微注射，將包括待表達的核酸分子 以及適合定位的表達控制序列的表達載體導入受精卵的原核中。注射DM 的整合通過組織樣品DNA的印跡分析來檢測。優(yōu)選將導入的DNA并入動 物的生殖系中，以便其可以被傳遞給該動物的后代。組織特異性表達可 以通過使用組織特異性啟動子，或通過使用允許轉基因有調節(jié)地表達的 誘導型啟動子例如金屬硫蛋白基因啟動子(Palmiter等4 1983，同上)來 實現(xiàn)。
可以通過尤其是培養(yǎng)適合的宿主和載體系統(tǒng)產生本發(fā)明重組翻譯產 物，分離蛋白質。為了分離目的蛋白質，然后可以通過各種純化程序， 處理該細胞系的上清液,或者當?shù)鞍踪|不分泌到上清液中時處理蛋白質 包涵體或整個細胞。例如，首先可以采用商業(yè)上可獲得的蛋白質濃縮濾 器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，濃縮上清液。濃縮之 后，可以將濃縮物加到適合的純化基質例如與適合支持物結合的抗蛋白 質抗體上?；蛘?，可以使用陰離子或陽離子交換樹脂來純化蛋白質。作 為再一種替代方法，可以使用一或多個反相高效液相色譜層析(RP-HPLC) 步驟來進一步純化該蛋白質。分離本發(fā)明蛋白質的其它方法是本領域技 術人員所熟知的。如果根據SDS-PAGE分析以及之后的考馬斯亮蘭染色，未檢測到其它 (非目的)蛋白質，則在本發(fā)明的范圍中該蛋白質被認為是"分離的"。 在其它實施方案中，該目的蛋白質可以是分離的，以致根據SDS-PAGE分 析以及之后的銀染檢測不到其它(非目的)蛋白質。
3.核酸分子
在本發(fā)明的其它方面，提供能夠抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族 成員結合的核酸分子。例如，在一個實施方案中，提供特異抑制TGF-P 結合蛋白核酸序列表達的反義寡核苷酸分子( 一般見，Hirashima等，RNA 的分子生物學新的前景(Molecular Biology of RNA: New Perspectives) ( M. Inouye和B. S. Dudock編，1987， Academic 出版 社，San Diego，第401頁)；寡核苷酸基因表達的反義抑制物 (Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression) (J. S. Cohen編，1989， MacMillan出版社，倫敦)；Stein和Cheng,科學 261:1004-1012， 1993; W0 95/10607;美國專利5， 359， 051; W0 92/06693; 和EP-A2-612844)。簡單地說，構建這些分子以《吏它們與轉錄的TGF-P 結合蛋白mRNA序列的一個區(qū)域互補，并能夠形成Watson-Crick威基配 對。所導致的雙鏈核酸將干擾該mRNA的隨后加工，由此阻止蛋白質的合 成(見實施例IO)。
在本發(fā)明的其它方面，提供能夠抑制TGF-P結合蛋白結合TGF-P家 族成員的核酶。本文所用的"核酶"旨在包括含有用于特異識別的反義 序列和RNA切割酶活性的RNA分子。該催化鏈可以以高于化學計量的濃 度切割靶RNA中的特異位點。許多種核酶可以用于本發(fā)明范圍中，包括 例如錘頭核酶(如描繪于Forster和Symons,細胞48:211-220， 1987; Haseloff和Gerlach，自然328:596-600， 1988; Walbot和Bruening， 自然334:196， 1988; Haseloff和Gerlach,自然334:585， 1988);發(fā) 夾核酶(例如描迷于Haseloff等，1993年10月19曰公布的美國專利 5,254,678;以及Hempel等，1990年3月26日出版的歐洲專利公開文 本0 360 257);以及基于四膜蟲(Tetrahymena)核糖體RNA的核酶(見Cech等，美國專利4,987,071)。本發(fā)明核酶典型地由RNA構成，但也可 以由DNA、核酸類似物(例如硫代磷酸酯)或它們的嵌合物(例如 DNA/RNA/RNA)構威。
4. 標記(l咖ls)
上文和下文中描述的基因產物和所有的候選分子均可以用各種化合物 標記，這些化合物包括例如熒光分子、毒素和放射性核素。熒光分子的 典型例子包括熒光素、藻膽色素蛋白例如藻紅蛋白、羅丹明、得克薩斯 紅和熒光素酶。毒素的典型例子包括蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、白喉毒 素、霍亂毒素、gelonin、美洲商陸抗病毒蛋白、tritin、志賀菌毒素和 假單胞菌外毒素A。放射性核素的典型例子包括Cu-64、 Ga-67、 Ga-68、 Zr-89、 Ru—97、 Tc-99m、 Rh-105、 Pd—109、 In—111、 1—123、 1—125、 I— 131、 Re—186、 Re—188、 Au—198、 Au—199、 Pb—203、 At—211、 Pb-212和 Bi-212。此外，上述抗體也可以與配體結合對的一個配偶體標記或結合。 代表性例子包括抗生物素蛋白-生物素和核黃素-核黃素結合蛋白。
用以上提及的代表性標記結合或標記本文所述分子的方法可以容易地 由本領域普通技術人員完成(見單端孢菌毒素抗體偶聯(lián)物，美國專利 4， 744， 981;抗體偶聯(lián)物，美國專利5,106,951;焚光物質和標記技術， 美國專利4,018,884;用于診斷和治療的金屬放射性核素標記的蛋白質， 美國專利4,897,255;和用于改良鏊合動力學的金屬放射性核素鏊合的化 合物，美國專利4,988,496;也見Inman，酶學方法(Methods in Enzymology)第34巻，親和技術，酶純化B部分，Jakoby和Wilchek (編)，Academic出版社，紐約，第30頁，1974;也見Wilchek和Bayer, "生物分析應用中的抗生物素蛋白-生物素復合物"，分析生物化學(Anal. Biochem. ) 171:1-32， 1988)。
藥物組合物
如上所述，本發(fā)明還提供各種藥物組合物，其含有一個抑制TGF-P 結合蛋白結合TGF-P家族成員的上述分子，以及藥物學上或生理上可接
66受的載體、賦形劑或稀釋劑。 一般地，此載體在使用劑量和濃度時對于 受體是無毒性的。通常，這些組合物的制備需要該治療劑與如下物質合
并緩沖液、抗氧化劑例如抗壞血酸、低分子量(少于約10個殘基)多 肽、蛋白質、氨基酸、糖&括葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、鏊合劑例如EDTA、 谷胱甘肽、及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽或與非特異性血清白蛋 白混合的鹽是典型的適合稀釋劑。
此外，可以制備用于各種不同途徑給藥的本發(fā)明藥物組合物。而且， 可以將本發(fā)明藥物組合物和提供該藥物組合物使用說明的包裝材料一起 置于容器中。 一般地，該說明包括一個描述該藥劑濃度的明確表述，以 及'在某些實施方案中，還包括對重新構成該藥物組合物可能是必須的賦 形劑成分或稀釋劑(例如水、鹽或PBS)的相對量的描述。
治療方法
技術領域：
本發(fā)明還提供增加骨礦質含量和礦質密度的方法。簡單地說，有許多 病癥會導致骨礦質含量的降低，包括例如疾病、遺傳誘因、導致骨使用 缺乏(例如由于骨折)的事故、導致骨吸收或殺死骨形成細胞的治療、 以及正常老化。通過使用抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的 本文所述分子，可以治療或預防這些病癥。如本文所使用的，應當理解， 如果在選定位置骨礦質含量以統(tǒng)計學顯著的方式(例如超過一倍半的標 準差)獲得增加，則骨礦質含量增加了 。
導致骨礦質含量降低的多種病癥均可以使用本文所述分子治療?；加?這些病癥的患者可以通過使用熟知技術(見例如Harrison氏內科醫(yī)學原 理(Harrison's Principles of Internal Medicine), McGraw-Hill公 司)進行臨床診斷來識別?？梢灾委煹募膊〉拇硇岳影ㄆ渲写嬖?骨的不正常生長或發(fā)育的發(fā)育異常。這些病癥的代表性例子包括軟骨發(fā) 育不全、鎖骨顱骨發(fā)育不良、內生軟骨瘤病、纖維性結構不良、戈謝病、 低磷狗僂病、Marfan病、遺傳性多發(fā)性外生骨疣(multiple hereditary exotoses)、多發(fā)性神經纖維瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、 硬化損害(sclerotic lesions)、骨折、牙周病、假關節(jié)和生膿性骨髓炎(Pyogenic oseomyelitis)。
其它可以治療或預防的病癥包括許多引起骨質減少(即，造成骨礦質 含量或密度比青年時期的峰值骨骼礦質含量低一個以上標準差的病癥) 的原因。這些病癥的代表性例子包括貧血狀態(tài)、類固醇引起的疾病、肝 素造成的疾病、骨髓疾病、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、特發(fā)性骨質 疏松癥、先天性骨質減少或骨質疏松癥、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、 絕經后狀態(tài)、月經稀發(fā)、閉經、妊娠、糖尿病、甲狀腺功能亢進、庫欣 病、肢端月巴大癥、'逸腺功能減退癥、不活動或廢用(immobilization and disuse )、反射交感性營養(yǎng)不良綜合征、短暫性區(qū)域骨質疏松和骨軟化。
在本發(fā)明的一個方面，可以通過給恒溫動物施用治療上有效量的抑制 TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的分子，來增加骨礦質含量或密 度?？梢灾委煹暮銣貏游锏睦影雇苿游锖筒溉閯游?，包括例如馬、 奶牛、豬、綿羊、狗、貓、大鼠和小鼠。治療分子的代表性例子包括核 酶、核酶基因、反義寡核苷酸和抗體(例如人源化抗體)。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于增加骨密度的方法，包括步驟向返 回骨的細胞導入指導抑制TGF-P結合蛋白結合TGF-P家族成員的分子表 達的載體，并給恒溫動物施用該含有載體的細胞。簡單地說，返回骨的 細胞可以直接從患者的骨(例如CD34+、成骨細胞、骨細胞等從骨髓獲得 的細胞)、外周血或培養(yǎng)物獲得。
將指導抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的分子表達的載 體導入細胞中。適合載體的典型例子包括病毒載體例如皰夸病毒載體(例 如美國專利5,288,641)、腺病毒栽體(例如WO 94/26914、 W0 93/9191; Kolls等，PNAS 91(1) :215-219， 1994; Kass-Eisler等，PNAS 90(24) :11498-502, 1993; Guzman等，血液循環(huán)(Circulation) 88 (6) :2832-48， 1993; Guzman等，Cir. Res. 73(6》1202-1207, 1993; Zabner等，細胞75(2) :207-216, 1993; Li等，人類基因治療4(4) :403-409， 1993; Caillaud等，歐洲神經科學雜志(Eur. J. Neurosci.) 5 (10) :1287—1291， 1993; Vincent等，Nat. Genet. 5(2) :130-134， 1993; Jaffe等，Nat. Genet. 1 (5): 372-378， 1992;和Levrero等，基因101 (2) :195-202， 1991)、腺伴隨病毒栽體(WO 95/13365; Flotte等, PNAS 90(22): 10613-10617, 1993)、桿狀病毒載體、細小病毒載似Koering 等，人類基因治療5:457-463, 1994),痘病毒載似Panicali和Paoletti， PNAS 79:4927-4931， 1982;和Ozaki等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2) :653-660, 1993 )、和逆轉錄病毒(例如EP 0,415,731; W0 90/07936; W0 91/0285; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 美國專利5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218)。同樣可以構建含有 混合的不同病毒或非病毒來源的不同元件(例如啟動子、包膜序列 (envelope sequence)等)的病毒載體。在各種實施方案中，病毒載體本 身或含有病毒載體的病毒顆粒均可以用于以下描述的方法和組合物中。
在本發(fā)明的其它實施方案中，可以通過各種技術施用編碼抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的分子的核酸分子本身，這些技術包 括例如施用與聚L-賴氨酸DNA復合物偶聯(lián)的脫唾液酸血清類粘蛋白 (ASOR) (Cristano等，PNAS 92122-92126, 1993)、與滅活腺病毒相連 的DNA(Curiel等，人類基因治療3(2) :147-154， 1992);細胞轉染劑介 導的導入(DMRIE-DOPE, Vical， California);直接DNA注射(Acsadi 等，自然352:815-818, 1991); DNA配體(Wu等，生物化學雜志(J. Biol. Chem. ) 246:16985-16987， 1989);脂轉染(Feigner等，美國國家科學 院院刊84:7413-7417, 1989);脂質似Pickering等，Circ. 89(1) :13-21， 1994;和Wang等，PNAS 84:7851-7855， 1987);微粒轟擊(Williams等， PNAS 88:2726-2730, 1991);和單獨(Vile和Hart,癌癥研究(Cancer Res. ) 53:3860-3864， 1993)或利用PEG-核酸復合物直接遞送編碼該蛋 白質的核酸分子本身。
可以由本發(fā)明載體表達的分子的代表性例子包括核酶和反義分子，它 們每一種均已在上文中作了更為詳細的討論。
可以直接通過使用X射線(例如雙能X射線吸收測量術，或"DEXA")， 或通過從骨更新標志(成骨細胞特異'&喊性磷酸酶、骨鈣蛋白、I型原膠 C，原前肽(PICP)、和總的堿性褲酸酶；見Comier, C. ， Curr. Opin. in Rheu. 7:243, 1995)或骨吸收標志(吡咬啉、脫氧吡咬啉、N-端肽、尿羥脯氨酸、血漿酒石酸(tartate)抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羥賴氨酸；見 Cornier,同上)進行的推導，確定骨礦質含量的增加。還可以從體重或 利用其它方法(見Guinness—Hey， Metab. Bone Dis. and Rel. Res, 5:177-181， 1984)計算骨質的量。
正如本領域技術人員所明了的，給藥的量和頻率當然將取決于諸如所 治療的指征的性質和嚴重程度、期望的反應、患者的情況等等因素。典 型地，本發(fā)明組合物可以通過以上提及的各種技術來施用。
我們提供以下實施例作為說明，而非限制。
實施例 實施例1
硬化性狹窄作圖定位于人類第17號染色體長臂 對人類負責硬化性狹窄(sclerosteosis)的缺陷的遺傳作圖將負責該 疾病的基因定位在人第17號染色體的區(qū)域，該區(qū)域編碼一個新的TGF-P 結合蛋白家族成員。在硬化性狹窄中，與非患病個體相比，患者骨骼骨 表現(xiàn)出在礦質密度方面的實質增加。頭骨也表現(xiàn)出過度生長。硬化性狹 窄患者通常是健康的，盡管他們可能在出生時表現(xiàn)出不同程度的并指 (趾)，并在顱骨中表現(xiàn)出不同程度的顱壓迫和神經壓迫。
將收集自發(fā)生該疾病的24個南非Afrikaaner家族的DNA樣品應用 純合性作圖方法，對硬化性狹窄相關的基因缺陷進行連鎖分析(Sheffield 等，1994，人類分子遺傳學(Human Molecular Genetics) 3:1331-1335， "3號染色體上巴-比綜合征座位的鑒定以及對一種有效的純合性作圖方 法的評價(Idendification of a Bardet-Biedl syndrome locus on chromosone 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping)，，)。該南非Afrikaaner群體在遺傳上是同質的； 該群體是幾個世紀前定居在該地區(qū)的少數(shù)建立者的后裔，自建立之后由 于地理和社會障礙該群體一直是隔離的。除了此Afrikaaner群落外，世 界各地的硬化性狹窄是稀少的，這提示在該建立群體中存在該基因的突 變，而且隨著該群體的增大該基因突變在數(shù)量上也隨之增加。純合性作圖的使用是基于如下假設在來自近親家族和隔離群體的患病個體中，與 隱性突變相鄰的DNA作圖標記很可能是純合的。
選捧一套371個來自常染色體的微衛(wèi)星標記(Research Genetics, 第6套)，用以對來自硬化性狹窄患者樣品的DNA庫進行分型。用于該分 析的DNA樣品來自24個家族中的29名硬化性狹窄患者，59名未患病家 族成員，以及一組來自同一群體的無關對照個體。這些庫由4-6名個體 組成，這些個體或是患病個體、來自近親家族的患病個體、雙親和未患 病同胞，或是無關對照。在無關個體庫中和在大多數(shù)有患病個體或家族 成員的庫中，對所述標記的分析顯示，每一個標記均有幾種等位基因大 小。標記D17S1299顯示是純合性的指示在幾個患病個體庫中均顯示為 一條帶。
用D17S1299區(qū)域(17ql2-q21)中的總共19個標記對所有24個硬 化性狹窄家族進行分型。每個家族的患病個體均顯示出在該區(qū)域是純合 的，而且對于核心單元型(core haplotype)這29名個體中的25名是 純合的；他們每一個在D17S1787和D17S930之間都具有相同的等位基因。 其它4名個體的一條染色體與該單元型相匹配，而第二條染色體與之不 匹配 總之，該數(shù)據有力地說明此3兆堿基區(qū)域含有該硬化性狹窄突變。 對此3兆堿基區(qū)域中的大多數(shù)外顯子的序列分析，鑒定了一個定位于新 TGF-P結合蛋白編碼序列中的無義突變(SEQ ID No. 1第117位的C>T 突變導致一個終止密碼子)。該突變表現(xiàn)出是Afrikaaner后裔的硬化性 狹窄患者和攜帶者所獨有的。該基因的本質通過鑒定其內含子中的突變 (內含子的+3位存在A〉T的突變)得到進一步證實，該內含子的突變在 一名單個的患有確診硬化性狹窄的無關患者中導致不正確的mRNA加工。
實施例2
TGF-P結合蛋白基因表達的組織特異性
A.通過RT-PCR分析人類Beer基因的表達
采用商業(yè)途徑可獲得的試劑盒("用于第一鏈cDNA合成的Superscript Preamplification System " ，Life Technologies, Rockville， MD),從以下總RNA樣品制備第一鏈cDNA:人腦、人肝、人 脾、人胸腺、人胎盤、人骨骼肌、人甲狀腺、人腦垂體、人成骨細胞(NHOst, 獲自Clonetics公司，San Diego, CA)、人骨肉瘤細胞系(Saos-2， ATCC弁 HTB-85)、人骨、人骨髓、人軟骨、非洲獼猴骨、釀酒酵母、和人外周血 單核細胞。除了以下樣品是內部制備的之外，所有其它這些RNA樣品均 從商業(yè)途徑(Clontech， Palo Alto, CA)購買人成骨細胞、人骨肉瘤 細胞系、人骨、人軟骨和非洲獼猴骨。這些內部RNA樣品的制備采用了 商業(yè)上可獲得的試劑盒("TRI試劑"，Molecular Research Center公司， Cincinnati, OH)。
在這些樣品和作為對照的人基因組樣品上進行PCR。 Beer的有義寡 核苷酸引物的序列是5'-CCGGAGCTGGAGMCAACAAG-3， (SEQ ID NO: 19)。 Beer的反義寡核普酸引物的序列是5，-GCACTGGCCGGAGCACACC-3， (SEQ ID N0:20)。此外，采用針對人p-肌動蛋白基因的引物進行PCR，作為對照。 P-肌動蛋白的有義寡核苷酸引物具有序列5，-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3， (SEQ ID NO:21)。卩-肌動蛋白的反義寡核 苷酸引物具有序列5，-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3， (SEQ ID NO:22)。 采用標準條件在25ul反應中，以61攝氏度作為退火溫度，進行PCR。用 Beer引物進行32個PCR循環(huán)，而用p-肌動蛋白的引物進行24個PCR循 環(huán)。
擴增之后，每個反應的12ul通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色 進行分析。見圖2A。 B.小鼠胚胎切片的RNA原位雜交
采用廠商的操作指南，將小鼠的全長Beer cDNA ( SEQ ID No. 11) 以反義和有義方向克隆至pCR2. 1載體(Invitrogen， Carlsbad, CA)中。 使用Ambion公司(Austin, TX)提供的體外轉錄試劑，合成35-S-a-GTP 標記的cRNA有義和反義轉錄本。根據Lyons等的操作方法(細胞生物學 雜志(J. Cell Biol. ) 111:2427-2436, 1990),進行原位雜交。
小鼠Beer cRNA探針在發(fā)育中的小鼠胚胎的神經管、肢芽、血管和正在骨化的軟骨中檢測到特異表達信號。圖3的A部分顯示了肢芽(l)的 夕卜胚層頂峰(apical ectodermal ridge) (aer)、 血管(bv)和神經管(nt) 中的表達。B部分顯示了第4腦室(4)中的表達。C部分顯示了下頜骨(ma)、 頸推(cv)、枕骨(oc)、腭(pa)、和血管(bv)中的表達。D部分顯示了肋 骨(r)和心瓣膜(va)中的表達。A部分是10. 5 dpc胚胎的橫切片。B部分 是12. 5 dpc胚胎的縱向切片。C和D部分均是15. 5 dpc胚胎的縱向切 片。
ba二鰓弓、h二心臟、te^端腦(前腦)、b二腦、f二額鼻塊(frontonasal mass)、 g二腸、h二心臟、j,、 li=JJf、 1\1=肺、ot二聽泡、ao二、 sc:脊髓、skm二骨 骼肌、ns二鼻竇、仕=胸腺、to-舌、fl二前肢、di二隔膜
實施例3 重組Beer蛋白的表達和純化 A.在C0S-1細胞中的表達
采用如下PCR寡核苷酸引物擴增編碼人全長Beer蛋白質的DNA序 列5'寡核苷酸引物的序列是5，-MGCTTGGTACCATGC AGCTCCCAC-3， (SEQ ID N0:23)，含有一個Hind III限制性酶位點(粗體)，其后是從推測的氨 基端起始密碼子(ATG)之前的6個堿基對開始的Beer基因的19個核苷 酸 。 3， 寡核苷酸引 物的序列 是 5，-MGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3， (SEQ ID N0:24)，含有一個Hind III限制性酶位點(粗體)，之后是一個反向互 補終止密碼子(CTA),再之后是FLAG表位的反向互補序列(下劃線， Sigma-Aldrich公司，St. Louis, MO),而其側翼是編碼Beer數(shù)基端5 個氨基酸的核苷酸的反向互補序列。將此PCR產物進行TA克斷"Original TA克隆試劑盒"，Invitrogen， Carlsbad, CA)，并通過DNA測序對單個 克隆進行篩選。然后用Hind III消化經序列證實的克隆，并使用商業(yè)上 可獲得的試劑("QIAquick凝膠提取試劑盒"，Qiagen公司，Valencia, CA) 在1. 5%瓊脂糖凝膠上進行純化。然后用T4 DNA連接酶將該片段與經Hind III消化、磷酸酶處理的pcDNA3.1質粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)連接起來。轉化大腸桿菌DH10B,并在含有100ug/ml氨千青霉素的LB平 板上鋪板。使用相應于pcDNA3. 1中T7啟動子/引物位置的5，引物，和相 應于內在BEER序列的反向互補序列，且具有5，-GCACTGGCCGGAG CACACC-3， (SEQ ID N0:25)序列的3，引物，通過基于PCR的篩選，鑒定帶有正 確方向的期望重組體的菌落。克隆片段的序列通過DNA測序證實
采用COS-1細胞(ATCC# CRL-1650)進行轉染。使用商業(yè)上可獲得 的試劑盒，依據廠商提供的操作指導("DEAE-葡聚糖轉染試劑盒"，Sigma Chemical公司，St. Louis, MO), 用50ug表達質粒pcDNA-Beer-Flag 進行轉染。轉染后的最終培養(yǎng)基是含有0. 1%胎牛血清的DMEM (Life Technologies, Rockville， MD)。培養(yǎng)4天后，取出該培養(yǎng)基。通過 SDS-PAGE和Western印跡，使用抗FLAG M2單克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司，St. Louis, M0)，分析重組BEER蛋白的表達。重組BEER蛋白使 用抗FLAG M2親和柱("哺乳動物瞬時表達系統(tǒng)"，Sigma-Aldrich公司， St. Louis, M0)純化。通過SDS-PAGE和Western印跡，使用抗FLAG M2 單克隆抗體，分析親和柱曲線成分。 B.在SF9昆蟲細胞中表達
使用如下引物和標準條件，PCR擴增人Beer基因序列 有義引物5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCMGA ATGAT-3， (SEQ ID NO:26)
反義引物5，-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGT TCTCCAGCTCGGC-3，卿ID NO:27)
所獲cDNA含有帶有兩處修政的Beer編碼區(qū)。N-端分泌信號被去除， 而且FLAG表位尾(Sigma)以符合閱讀框的形式融合到插入片段的C末端。 為了轉移到桿狀病毒表達載體中，使用標準方法添加BamHI和HindIII 克隆位點，并將該基因亞克隆至pMelBac載體(Invitrogen)中。
采用Bac-N-Blue轉染試劑盒(Invitrogen)制備表達Beer蛋白的 重組桿狀病毒，并根據廠商說明書進行純化。
在含有10%胎牛血清的TNM—FH培養(yǎng)基(Invitrogen)中維持SF9細 胞(Invitrogen)。對于蛋白表達，在轉瓶中以大于10的M0I感染SF9培養(yǎng)物。每天采取培養(yǎng)基和細胞樣品，持續(xù)5天，并通過Western印跡 使用抗FLAGM2單克隆抗體(Sigma)或抗Beer兔多克隆抗血清監(jiān)測Beer 的表達。
5天后，通過離心收獲桿狀病毒感染的SF9細胞，并采用高鹽提取 緩沖液(1. 5M NaCl， 50mM Tris pH7. 5)從細胞沉淀中提取細胞相連的 蛋白質。通過離心澄清該提取物(20ml/300ml培養(yǎng)物)，對4升Tris緩 沖鹽(150mM NaCl, 50mM Tris pH7. 5)透析三次，并通過再次離心澄清。 將該高鹽組分施加于Hitrap Heparin (Pharmacia; 5ml柱床體積)，用 服PES緩沖鹽(25mM服PES7. 5， 150mMNaCl )進行大量洗滌，并使用150mM NaCl-1200mM NaCl的梯度洗脫結合的蛋白質。在大約800mM NaCl時觀 察到Beer的洗脫。向含有Beer的組分補加甘油和DTT分別達到10%的甘 油和lmM的DTT，然后在-80"C凍存。
實施例4
抗Beer、 Gremlin和Dan的多克隆抗體的制備和檢測 A. 抗原的制備
使用標準PCR方法和如下寡核苷酸引物擴增人Beer、人Gremlin和 人Dan的DNA序列。 人Beer
有義5，-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3， (SEQ ID NO :28) 反義5，-AGCATMGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3， (SEQ ID NO :29) 人Gremlin
有義5，-GACTTGGATCCGMGGGAAAAAGAAAGGG-3， (SEQ ID NO:30) 反義5，-AGCATMGCTTTTMTCCAAATCGATGGA-3， (SEQ ID NO:31) 人Dan
有義5，—ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCMCMG—3， (SEQ ID NO:32) 反義5，-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3， (SEQ ID NO :33)
在每一種情況中，列出的引物均擴增除去了分泌信號序列的完整編碼 區(qū)。這些擴增序列包括用于亞克隆至細菌表達載體pQE-30 (Qiagen公司，Valencia, CA)的BamHI/Hindlll位點(對于Beer和Gremlin)和 Sacl/Hindlll位點(對于Dan)的限制性位點。pQE-30在該克隆區(qū)域的 5'末端含有一個編碼6xHis尾的序列。用該完整結構轉化大腸桿菌菌抹 M-15/pR印(Qiagen公司)，并且通過測序#單個克隆。按廠商(Qiagen, TheQIAexpression)所述在M-15/pR印中表達蛋白質并對其進行純化(6 x His親和尾結合與S印harose偶聯(lián)的Ni-NTA)。
在6M胍中進行溶解，從大腸桿菌相當大量地回收Beer蛋白，然后 透析g濃度降至2-4M以防治在貯存過程中出現(xiàn)沉淀。用6M胍溶解， 回收更大量的Gremlin和Dan蛋白，經純化后胍濃度為0. 5M。
B. 多克隆抗體的生產和檢測
采用標準操作，在兔和雞宿主中制備分別針對這3種抗原的多克隆抗 體(R&R抗體，Stanwood, WA;家兔免疫和抗血清回收的標準操作；精 編分子生物學實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)第 2版，1992, 11.37—11.41。捐贈者Helen M. Cooper和Yvonne Paterson; 由Strategic Biosolutions (Ramona， CA)制備雞抗血清，)。
通過Western印跡篩選具有活性的家兔抗血清和雞卵的Igy組分。 三個抗體分別通過PAGE分離，并轉移至0. 45um硝酸纖維素膜上(Novex， San Diego, CA)。將該膜剪成條狀，每個條含有大約75ng的抗原。在3% 的印跡級阻斷劑(Blotting Grade Block ) ( Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)中封閉這些條，然后在1 x Tris緩沖鹽(TBS)/0. 02%TWEEN 緩沖液中洗滌3次。將這些條與一抗(免疫前血液、兔抗血清或雞卵IgY 在封閉緩沖液中的1:100 - 1:10， 000稀釋液) 一起孵育1小時，并伴隨 輕柔地滾動。經第二遍用lx TBS/0. 02% TWEEN進行的三次洗滌之后，與 二抗(過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗兔抗體，Amersham Life Science, Piscataway， NJ; 或過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗雞抗體，Jackson I,unoResearch， West Grove, PA)孵育一小時。最后一輪用1>< TBS/0.02% TWEEN進行的三次洗滌之后，用Lumi-Light Western印跡底物(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, 德國)顯色這些條。
C. 抗體的交叉反應性檢測
76按前面部分描述的操作方法，將Beer、 Gremlin或Dan的硝酸纖維 素條帶與它們各自的兔抗血清或雞卵IgY的稀釋液(l:5000和1:10， 000) 以及其余兩種抗原產生的抗血清或雞卵IgY (稀釋液1:1000和1:5000) 一起孵育。增加非匹配抗體的水平，以檢測僅在濃度增加時才可能被觀 察到的這些抗體的低親和結合。對于使用上述操作的所有三個結合事件， 顯色反應的操作和持續(xù)時間是相同的。對于所有測試的抗原，均未觀察 到抗原的交叉反應性。、
實施、例5
Beer與TGF-P超家族蛋白質的相互作用 采用免疫沉淀方法研究Beer與來自TGF-P超家族的不同系統(tǒng)發(fā)生支 的蛋白質的相互作用。從商業(yè)途徑獲得純化的TGFP-1、 2、 TGF
P -3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6和GDNF (R&D system; Minneapolis MN)。 典型的操作步驟如下。部分純化的Beer在HEPES緩沖鹽(25mMHEPES 7. 5， 150mMNaCl)中透析。在300ul IP緩沖液(150mMNaCl， 25mMTrispH7. 5， lmM EDTA, 1. 4mM卩-巰基乙醇，0.5% triton X—100和10%甘油)中進行 免疫沉淀。在存在和不存在500ng FLAG表位標記的Beer時，將30ng重 組人BMP-5蛋白(R&D system)加在15ul FLAG親和基質(Sigma; St. Louis MO)上。4X:孵育這些蛋白質4小時，然后在IP緩沖液(每次洗 滌1ml)中洗滌與親和基質相連的蛋白質。將結合蛋白質從親和基質上洗 脫至60ul lxSDS PAGE樣品緩沖液中。通過SDS PAGE分離這些蛋白質， 并采用抗BMP-5抗血清(Research Diagnostics公司)通過Western印 跡檢測與Beer相連的BMP-5(見圖5)。 Beer配體結合試驗
在lOOul PBS/0.2% BSA中加入FLAG-Beer蛋白質(20ng),然后吸 附至預先用抗FLAG單克隆抗體(Sigma, St. Louis MO)包被、用溶于 PBS的1096BSA封閉的96孔微滴定板的每個孔中。這在室溫進行60分鐘。 去除該蛋白質溶液，并洗滌這些孔以去除未結合蛋白質。向每個孔加入 溶于PBS/0. 2% BSA的BMP-5，濃度范圍從10pM至500nM，然后室溫孵育2小時。去除結合溶液，.并用200ul體積的PBS/0. 2% BSA洗滌該板三次。 然后使用BMP-5抗血清通過ELISA (F.M. Ausubel等(1998)當代分子 生物學實驗指南(Current Protocols in Mol. Biol.)第2巻,11. 2. 1-11.2.22),檢測BMP-5的水平。通過從總結合中減掉非特異結合來計算 特異結合，并通過LIGAND程序(Munson和Podbard，分析生物化學(Anal. Bioche邁)，107，第220-239頁，1980)進行分析。
在該方法的一個變化中，改造Beer并將其表達成人Fc融合蛋白質。 同樣對配體BMP進行政造，并表達成小鼠Fc融合蛋白質。將這些蛋白質 一起孵育，按Mellor等所述的方法采用均一時間分辨熒光檢測 (homogeneous time resolved fluorescence detection) (G. W. Mellor 等，J. of Biomol. Screening, 3(2) 91-99, 1998),進行分析。
實施例6
抑制TGF-P結合蛋白與TGF-P家族成員結合的篩選試驗
重復上述試驗，除了兩處例外。第一，BMP濃度固定在預先確定的Kd 值上。第二，加入固定濃度的候選拮抗劑集合(對于有機小分子集合為 20uM，而在抗體研究中為luM)。結合TGF-P結合蛋白的這些候選分子(拮 抗劑)包括商業(yè)來源的或內部收集的有機化合物，這些有機化合物代表 了各種的化學結構。這些化合物在函SO中制成貯存液，并在標準試驗條 件下以< 1%的終體積加入試驗孔中。與BMP和Beer —起室溫孵育2小時， 去除該溶液并按所描述的方法定量結合的BMP。在沒有化合物或抗體時觀 察到的對BMP結合產生40%#制的試劑被認為是該相互作用的拮抗劑。基 于滴定研究以測定這些試劑的抑制常數(shù)和它們對TGF-P結合蛋白結合親 和性的影響，進一步作為潛在抑制物評價這些試劑。通過使用基于BMP 配體作用的試驗的研究(例如BMP/BMP受體竟爭研究)，還可以進行可比 較的特異性對照試驗，以確立該鑒定拮抗劑的選擇性分布圖。
實施例7對TGF- P結合蛋白的骨基質定位的抑制 使用修改的Nicolas方法(Nicolas, V. Calcif Tissue Int. 57:206， 1995)，評價對骨基質(羥基磷灰石)定位的抑制。簡單地說，按Nicolas (同上)所述方法制備125I標記的TGF-P結合蛋白。向配有聚丙烯濾膜 (Polyfiltroninc， Weymouth MA)的96孔微滴定板的每個孔中加入羥 基磷灰石。將TGF-P結合蛋白加入含有0.2%白蛋白的PBS緩沖液中。用 該緩沖液洗滌含有基質的孔三次。使用0. 3M NaOH洗脫吸附的TGF-P結 合蛋白，并進行定量。
通過TGF-P結合蛋白與測試分子的孵育，以及將該混合物施加到上 述基質上，進行抑制物的鑒定。用含有0.2%白蛋白的PBS緩沖液洗滌該 基質三次。使用0. 3M NaOH洗脫吸附的TGF-P結合蛋白，并進行定量。 在沒有化合物或抗體的情況下觀察到對TGF-P結合蛋白結合的40%抑制 的試劑被認為是骨定位抑制劑。通過劑量反應研究測定這些抑制劑的抑 制常數(shù)和它們對TGF-P結合蛋白結合親和性的影響，進一步表征這些抑 制劑。
實施例8 TGF-P結合蛋白突變體的構建
A. 資變
pBluescript SK中的全長TGF-P結合蛋白cDNA充當誘變模板。簡 單地說，使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs， Beverly, MA) 和適合的引物(見以上提供的討論)通過聚合酶鏈式反應產生該DNA片 段。在廠商提供的緩沖液中，使用57C退火溫度，進行該聚合酶鏈式反 應23個循環(huán)。然后將產物暴露于兩個限制性酶，并在使用瓊脂糖凝膠電 泳分離后，將其連接回通過酶消化去除了對應序列的pRBP4-503中。通 過DNA測序驗證該突變體的完整性。
B. 突變TGF-P結合蛋白的哺乳動物細胞表達和分離
將該突變TGF-P結合蛋白cDNA轉移至實施例3所述的pcDNA3.1哺 乳動物表達載體中。在驗證序列后，用所獲結構轉染COS-1細胞，并按
79實施例3所述純化分泌的蛋白質。
實施例9 動物模型-I 超量表達Beer基因的轉基因小鼠的產生 使用從CITB小鼠基因組DNA文庫(由Research Genetics, Huntsville AL獲得)分離的~ 200千堿基(kb) BAC克隆15G5,確定小鼠Beer基因 的全部序列以及其5，和3，側翼區(qū)。將含有該完整基因體以及 17 kb的5， 側翼序列和 20 kb的3，側翼序列的41kb Sail片段亞克隆至S叩erCosI 粘粒栽體(Stratagene, La Jolla, CA)的BamHI位點，并在大腸桿菌 菌抹DH10B中增殖。然后從該粘粒結構，采用常規(guī)手段，凝膠純化含有 完整小鼠Beer基因以及分別長17kb和14kb的5，和3，側翼序列的35kb Mlul-Avill限制性片段(序列號6),用于微注射小鼠受精卵(DNX轉基 因；美國專利4,873,191)。以5-30%的活產幼崽頻率獲得其中克隆DNA 片段隨機整合在基因組中的建立者動物(founder animal )。通過從少量 小鼠組織例如尾尖提取基因組DNA,并進行Southern印跡分析，驗證該 轉基因的存在。DNA的提取采用如下操作程序在含有200mMNaCl， lOOmM Tris pH8. 5, 5mM EDTA， 0. 2% SDS和0. 5mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液 中，55t:過夜消化組織。第二天，該DNA用酚/氯仿(50:50)抽提一次， 用氯仿/異戊醇(24:l)抽提一次，然后用乙醇進行沉淀。重懸在TE(10mM Tris pH7. 5， ImM EDTA)中后，每份8-10ug DNA樣品用限制性內切酶例 如EcoRI消化，然后進行凝膠電泳并將其轉移至帶電荷的尼龍膜例如 HyBondN+ (Amersham， Arlington Heights, IU上。然后用放射性標記 的DNA片段雜交該所獲得的濾膜，該放射性標記DNA片段來源于小鼠Beer 基因座位并且既能識別來自內源性基因座位的片段又能識別來自轉基因 的具有不同大小的片段。將建立者動物與非轉基因小鼠進行配種，產生 足夠數(shù)量的轉基因和非轉基因后代，并在其中測定Beer基因超量表達的 影響。對于這些研究，對各種年齡的動物(例如，1天、3周、6周、4 個月)進行多種不同的設計用來查明總的骨骼形成、骨礦質密度、骨礦質含量、破骨細胞和成骨細胞活性、軟骨內骨化程度、軟骨形成等的試
驗。轉基因的轉錄活性可以通過如下步驟進行測定從不同組織中提取 RNA，并采用RT-PCR進行分析，該分析利用了轉基因來源的小鼠品系 (129Sv/J)和用于DNA微注射的小鼠品系[(C57BL5/JxS幾/J)F2]之間的 單核苷酸多態(tài)性。
動物模型-II 通過同源重組破壞小鼠的Beer基因
在胚胎干(ES)細胞中進行的同源重組可以用以失活小鼠的內源性 Beer基因，并隨之產生帶有功能缺失突變的動物。將報告基因例如大腸 桿菌的p-半乳糖苷酶基因通過基因工程插入導向載體，使其表達可以受 到內源性Beer基因啟動子和翻譯起始信號的控制。以此方式，可以在帶 有定向等位基因的動物中，測定Beer基因表達的空間和時間模式。
首先通過將磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子驅動的可藥物篩選的新霉 素抗性基因(neo)盒從pGT-N29 (New England Biolabs， Beverly, MA) 克隆至克隆載體pSP72 (Promega， Madson， WI)中，構建該導向載體。 使用PCR，給該PGKneo盒的側翼加上噬菌體Pl loxP位點，該位點是P1 Cre 重組酶的識別位點(Hoess等，美國PNAS, 79:3398， 1982)。這就允許 之后在被打耙的ES細胞或ES細胞來源的動物中除去該neo抗性標記(美 國專利4,959,317)。該PCR引物由loxP的34個核苷酸(ntd)序列，與 PGKneo盒的5，和3'末端互補的15-25ntd,以及用于克隆至pSP72的限制 性酶識別位點(有義引物中為BamHI，反義引物中為EcoRI)組成。有義 引物的序列是5，-MTCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3， (SEQ ID N0:34);反義引物的序列是5，-AATCTGMTTCCACCGGTGTTMTTAAATMCTTCGTAT
AATGTATGCTATACGMGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3， (SEQ ID NO :35)。
下一步是將含有該大腸桿菌p-半乳糖苷酶基因和SV40 苷酸化信 號的3. 6kb Xho1-HindIII片段從pSVp (Clontech， Palo Alto， CA)克 隆至pSP72-PGKneo質粒中。通過從BAC克隆15G5擴增一個2. 4kb的片段產生小鼠Beer基因座位的同源"短臂"。該片段的3，末端與Beer基因 的翻譯起始位點相符，并且在此PCR中使用的反義引物還包括與P-半乳 糖苷酶基因的5，末端互補的30ntd，以致該基因的編碼區(qū)可以按符合閱讀 框的形式與Beer起始位點融合。用于將該"短臂"引入pSP72-(5gal-PGKneo 質粒的方法是，在p-gal基因上游的一個位點將此質粒線性化，然后用 該片段和此"短臂"PCR產物進行共轉化，篩選該PCR產物通過同源重組 整合在其中的質粒。用于該"短臂"擴增的有義引物包括與pSV70載體 互補的30ntd，從而允許該重組事件發(fā)生。該有義引物的序列是5，-ATTTAGGTGACACTATAG
AACTCGAGCAGCTGMGCTTMCCACATGGTGGCTCACAACCAT-3，鵬ID NO :36),
反 義 引 物 的 序 列 是 5，-AACGACGGCCAGTG
AATCCGTMTCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3， ( SEQ ID NO :37)。
使用引入稀有限制性酶切割位點SgrAI、 Fsel、 Ascl和Pacl的引物，
通過從BAC克隆15G5擴增一個6. lkb的片段產生Beer基因座位的"長
臂"。具體地，該有義引物的序列是 5，-ATTACCACCGGT
GACACCCGCTTCCTGACAG-3， (SEQ ID NO:38);該反義引物的序列是5，-ATTACTTMTTAAACATG0CGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTMTT—
3， (SEQ ID N0:39)。作為一個中間步驟，將所獲PCR產物克隆至TA載 體(Invitrogen， Carlsbad, CA)中。
該小鼠Beer基因導向結構還包括第二個選擇標記，單純皰務病毒I型 胸苷激酶基因(HSVTK)，該基因處于勞斯肉瘤病毒長末端重復元件(RSVLTR) 的控制下。該基因的表達使得哺乳動物細胞對^~[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥 嘌#感(并且不能存活)，因此這是一個篩去新霉素抗性的細胞的方便方 法，在新霉素抗性細胞中該結構是通過非同源重組事件發(fā)生務^的(美國專 利5,464,764)。使用允許隨后將片段克隆至"長臂"-TA栽體質粒的Fsel 和Ascl位點中的引物，從pPS1337擴增該RSVLTR-HSVTK盒。對于該PCR， 有義引物的序列是5，-ATTACGGCCGGCCGCMAGGMTTCMGATCTGA-3， (SEQ ID N0:40);反義引物的序列是5，-ATTACGGCGCGCCCC TCACAGGCCGCACCCAGCT-3， 卿ID NO:41)。構建該導向載體的最后一步涉及，將含有"長臂"和RSVLTR-HSVTK 基因的8.8 kb SgrAI-Ascl片段克隆至pSP72-"短臂"-pgal-PGKneo 質粒的SgrAI和Ascl位點中。通過Ascl或Pacl消化，線性化該導向載 體，然后通過電穿孔將其導入ES細胞中。
實施例10 反義介導的Beer失活 以重疊形式制備具有17個核苷酸的反義寡核苷酸，方式是第一個寡 核苷酸的5，末端與Beer轉錄本的翻譯起始AUG重疊，然后相繼的寡核苷 酸的5，末端在相對Beer AUG的5'方向上前移5個核苷酸( 一直到50個 核苷酸之外)。使用了相同的堿基組成設計和制備相應的對照寡核苷酸， 但其序列被重新分布以抑制其與編碼mRNA的任何有效雜交。通過陽離子 脂質遞送(P. L. Feigner,美國國家科學院院刊84:7413， 1987),將試 劑遞送至測試細胞系統(tǒng)中。在lOOul減少血清培養(yǎng)基(Opti-MEM 1減少 血清培養(yǎng)基；Life Technologies, Gaithersburg MD)中加入2ug反義 寡核香酸，并將其與(6ul)脂轉染試劑(Lipofectin reagent) (Life Technologies, Gaithersburg MD)在此lOOul減少血清培養(yǎng)基中混合。 混合這些物質，室溫下30分鐘使其形成復合物，并將該混合物加到預先 接種的MC3T3E21或KS483細胞中。培養(yǎng)這些細胞，并回收mRNA。使用 RT-PCR以及Beer特異性引物監(jiān)測Beer的mRNA。此外，將分開的實驗 孔收集起來，并通過實施例4所述的Western印跡方法鑒定蛋白質的水 平。收獲細胞，將其重懸在裂解緩沖液(50mM Tris pH 7. 5, 20mM NaCl， ImM EDTA， 1% SDS)中，并收集可溶性蛋白質。將該物質加到10_20%的 梯度變性SDS PAGE上。把分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上并按以上 所述使用抗體試劑進行Western印跡。平行地，向同樣的培養(yǎng)物加入對 照寡核苷酸，并重復實驗操作。如果使用反義寡核苷酸進行的該處理與 拼湊的對照寡核苷酸相比導致mRNA或蛋白質水平50%的變化，則Beer mRNA 或蛋白質水平的降低被認為是有意義的。該方法使得能夠選擇性地失活 基因以及在隨后的組織培養(yǎng)模型中出現(xiàn)礦化結表型特征。序列
SEO ID No. 1:人Beer cDNA(完螯編碼區(qū)加5'和3'UTRs)
TCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGC
CTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCAC CGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGT TGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACA
AATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGC
GAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAG
AGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCA GGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACT
ACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTT
GTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAGSEQ ID No. 2:人BEER蛋白質(全序列)
MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAE NGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIG RGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGTEAARP()KGRKPRPRARSAKANQAELENAY
SEQ ID No. 3:含有硬化性狹窄無義突變的人Beer cDNA
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
CAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC TAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGG
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAA AATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTmTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTC
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTT
AATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAG
ACAATGAATCATGACCGAAAG
SEQ ID No. 4:從硬化性狹窄(Scleroeteosis)獲得的截短人Beer蛋白質
MOLPLALCLVCLLVHTAFRVVEG*
SEO ID No. 5:編碼蛋白質變體的人Beer cDNA (V10I)
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACT
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTA
CAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGC
AATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGT
TTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACAT ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTT AATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAG ACAATGAATCATGACCGAAAG
SEQ ID No. 6:人Beer蛋白質變體(V10I)
MQLPLALCLICLLVHTAFRWEGQGWQAFKNDATEIIRELGEYPEPPPELENNKTMNRAE NGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP醒G RGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY
SEQ ID No. 7:編碼蛋白質變體的人Beer cDNA (P3朋)
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACT
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTAT
CAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAA
TAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGG<formula>formula see original document page 88</formula>DFGPEAARPQKGRKPRPRARGAKANOAELENAY SEOIDNo. 11:小鼠Beer oDNA(僅有編碼區(qū))
AAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAG SEO ID No. 12:小鼠Beer蛋白質(全序列)
MQPSLAPCLICLLVHAAFCAVEGQGWQAFRNDATEVIPGLGEYPEPPPENNQTMNRAENG GRPPHHPYDAKDVSEYSCRELHYTRFLTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRV KWWRPNGPDFRCIPDRYRA()RVGLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHN(3SELKDF GPETARPQKGRKPRPGARGAKANQAELENAY
SEQ ID No. 13:大鼠Beer cDNA (完整編碼區(qū)加上5' UTR)
AGAACGCCTACTAGSEQ ID No. M:大鼠Beer蛋白質(全序列)
MQLSLAPCLACLLVHAAFVAVESQGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAE NGGRPPHHPYDTKDVSEYSCRELHYTRFVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP畫G RVKWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELK DFGPETARPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAY
SEQ ID No. 15:牛Baer cDNA (部份編碼序列)
SEQ ID No. 16:牛Baer蛋白質(部分序列一缺信號序列和末尾的6個殘基)
NDATEIIPELGEYPEPLPELNNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDASEYSCRELHFTRYVTD
GPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLP薩GRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVOLLCPGG
AAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPEAARPQTGRKLRPRARGTKASRA
SEQ IDNo. 17:用以制備小鼠Beer轉基因的Mlu卜Avill限制性片段
CGCGTTTTGGTGAGCAGCAATATTGCGCTTCGATGAGCCTTGGCGTTGAGATTGATACCT
GATCCGCCTTGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCT
AAGCGGTCAAACATGAGAATTCGCGGCCGCATAATACGACTCACTATAGGGATCGACGCC
TACCACGTTCTCTTAACAGGTGGCTGGGCTGTCTCTTGGCCGCGCGTCATGTGACAGCTG
AGATAAAAGTTGGCATGATCCACATTGCAGGAAGATCCACGTTGGGTnrCATGAATGTG
ATGGCTGAGGGGCTGTAAGGATCTTTCAATGTCTTACATGTGTGTTTCCTGTCCTGCACC TAGGACCTGCTGCCTAGCCTGCAGCAGAGCCAGAGGGGTTTCACATGATTAGTCTCAGAC ACTTGGGGGCAGGTTGCATGTACTGCATCGCTTATTTCCATACGGAGCACCTACTATGTG TCAAACACCATATGGTGTTCACTCTTCAGAACGGTGGTGGTCATCATGGTGCATTTGCTG
GGGCTTCCGGCACATCCTCTCAGGCCAGTGAGGGAGTCTGTGTGAGCTGCACTTTCCAAT
TAAATTTGGATGTTGTGAGGGGAAAGCGAAGGGCCTCTTTGACCATTCAGTCAAGGTACC TTCTAACTCCCATCGTATTGGGGGGCTACTCTAGTGCTAGACATTGCAGAGAGCCTCAGA
AAGCATCAGGCTCTGCCAACAGAACACTCTTTAACACTCAGGCCCTTTAACACTCAGGAC
GGCACAGGACGATATAAGTGGCTTGCTTAAGCTTGTCTGCATGGTAAATGGCAGGGCTGG<formula>formula see original document page 92</formula>GCACTCATGTGAACCAGGCATGCACACTCGGGCTTATCACACACATAATTTGAAAGAGAG
GTGTGATGAGATTTTTCCTGACAGTGACCTTTGGCCTCTCCCTCCCCCACTTCCCTTCTT
TAAAAAATACTTATCCATTTATTTATTTTTATGTGCACGTGTGTGTGCCTGCATGAGTTC ATGTGTGCCACGTGTGTGCGGGAACCCTTGGAGGCCACAAGGGGGCATCTGATCCCCTGG
ACTTGAATCTAAAGCAAGCACTTTTAACTGCTGAGGCAGCTCTCAGTACCCTTCTTCATTTACATGGTTTCATGTTTTGTTCAAGACTGAAGGATAACATTCATACAGAGAAGGTCTGGG
CTGGAGAGATGGCACTGACTGCTCTTCCAGAGGTCCGGAGTTCAATTCCCAGCAACCACA
GCTACAGTGTACTCACATAAAATAAATAAATCTTTAAAACACACACACACACACAATTAC
ACCACTGTTCAGGCTTCTAACAACCTGGTTTACTTGGGCCTCTnrCTGCTCTGTGGAGC CACACATTTGTGTGCCTCATACACGTTCTTTCTAGTAAGTTGCATATTACTCTGCGTTTT
GGGGATGTCAGAGTATTGTGAACAGGGGACAGTTCTTTTCTTCAATCATGTGGGTTCCAG TATTCTTTTTTTTTCCCCTGAGGTGGGGGCTTGTTCCATAGCCCAAACTGGCTTTGCACT
TGAAGGGATGACTGGACTGGACATGAGCGTGGAAGCCAGAGAACAGCTTCAGTCTAATGC TCTCCCAACTGAGCTATTTCGGTTTGCCAGAGAACAACTTACAGAAAGTTCTCAGTGCCA TGTGGATTCGGGGTTGGAGTTCAACTCATCAGCTTGACATTGGCTCCTCTACCCACTGAG CCTTCTCACTACTCTCTACCTAGATCATTAATTCTTTTTTAAAAAGACTTATTAGGGGGC
TCCCAGCATGCCATTGCTGGGCAGTAGGGGGCGCAGGTGTTCAACGTGAGTAGCTGTTGC CAGTTTTCCGCGGTGGAGAACCTCTTGACACCCTGCTGTCCCTGGTCATTCTGGGTGGGT
CCCACAGCCTCTTTTGCAGAGGTCTGACTGGGAGGGCCCTGGCAGCCATGTTTAGGAAAC
CCACGAGCCTGGTAAAGGAACTATGCAAACACAGGCCCTGACCTCCCCATGTCTGTTCC丁
TCCCAGAGGCTATCTTGATTCTTTGGAATGTTTAAAGTGTGCCTTGCCAGAGAGCTTACG
ATTACAAACAAACAAACAAACAAACAAACAAAGGACCTCCATTTGGAGAATTGCAAGGAT
GTTGCTATTCTAAGAATAATTAGGAGGAGGAACCTAGCCAATTGCAGCTCATGTCCGTGG GTGTGTGCACGGGTGCATATGTTGGAAGGGGTGCCTGTCCCCTTGGGGACAGAAGGAAAATGGAGAGAGAGAGAGCAAAGAAAGAAACAGCCTTTAAAAGAACTTTCTAAGGGTGGTTTT
ATATCAGGGATTTTTGTTGAATATTTCAAATTCAGCTTTAAGTGTAAGACTCAGCAGTGT TCATGGTTAAGGTAAGGAACATGCCTTTTCCAGAGCTGCTGCAAGAGGCAGGAGAAGCAG
GGCTGGTCATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTmTTmTTGGCCCAGAATGAAGTGACCAT
TAGGTTTTGGATTTTGGGCTTTGGTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTG
CATGACTTTGAGCCATCTCCAGAGAAGGAAGTGAAAATTGTGGCTCCCCAGTCGATTGGG
AGATTCCTGGCTTTCCATTAGGGCTGAAAGTACAACGGTTCTTGGTTGGCTTTGCCTCGT
TAACGCACTCTAAAGTTGTAACCAAAATAAATGTCTTACATTACAAAGACGTCTGTTTTG TGTTTCCTTTTGTGTGTTTGGGCTTTTTATGTGTGCTTTATAACTGCTGTGGTGGTGCTG
CAGTACAGCATTTTTCTAACATTTAAAAATAATCACCTAGGGGCTGGAGAGAGGGTTCCAGCAAGAGGATGGCGAGTTTGAAGGTATCTGGGGCTGTACAGCAAGACCGTCGTCCCCAAA
ACGAGATATGATGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACAGCTACAGTGTACTTACATATAA
CATGGGCCGAGGAGGGTCCAGAGAGATAGGCTGGTAAGCTCAGTTTCTCTGTATACCCTT
AGAGATAGATCACCCCCAACAATGGCCACAGCTGGTTTTGTCTGCCCCGAAGGAAACTGA
CGCCACAGATGGACCGGCCACTTACAAGTCGAGGCAGGTGGCAGAGCCTTGCAGAAGCTC
CTCCCTGTGGCATGGCCCTCCTGCTACTGCAGGCTGAGCATTGGATTTCTTTGTGCTTAG AGGACCCAGAGCTGTTTGTGATACCATAAGAGGCTGGGGAGATGATATGGTAAGAGTGCTTTGGCCGCAAGAAGCCTGGCCAGGGAAGGAACTGCCTTTGGCACACCAGCCTATAAGTCA
GGAATTTGGTCAAGCTGGATTCCGCCTTCTGTAGAAGCCCCACTTGTTTCCTTTGTTAAG
CACCTGGGAGGTGCCAGCAGCAATTTGGAAGTTTACTGAGCTTGAGAAGTCTTGGGAGGG
CTTCAGAGGTTTGTGTGGGTGGCTAGCCTCTGCTACATCAGGGCAGGGACACATTTGCCT
GGCTCCTGAGATAAAGTCACCTGGGAGTAAGAAGAGCTGAGACTGGAAGCTGGTTTGATC CAGATGCAAGGCAACCCTAGATTGGGTTTGGGTGGGAACCTGAAGCCAGGAGGAATCCCT TTAGTTCCCCCTTGCCCAGGGTCTGCTCAATGAGCCCAGAGGGTTAGCATTAAAAGAACA
CAGGTGGCACCACTTGCCCTGAGCTTGCACCCTGACCCCAGCTTTGCCTCATTCCTGAGG
CTGGGATTnTTTTTTCCTTTTATGTCATATTGATCCTGACACCATGGAACTTTTGGAGGGCAAGCAGCCCAGCCCTGCCTTTGGGGCAAGTTCTTTTCTCAGCCTGGACCTGTGATAAT GAGGGGGTTGGACGCGCCGCCTTTGGTCGCTTTCAAGTCTAATGAATTCTTATCCCTACC
CTACTCCTTCCACCCAAATGTAAAGCCTGCGTGGGCTAGATAGGGTTTCTGACCCTGACC TGGCCACTGAGTGTGATGTTGGGCTACGTGGTTCTCTTrTGGTACGGTCTTCTTTGTAAA
GTCATATTGTAAAGGGATTTTCTACACAACAGTTTAAGGTCGTTGGAGGAAACTGGGCTT
GCACATGGAGGGGGGGGTAGGGGGGTTGGGGCTGGTGAGTTTGGCGAACTTTCCATGTGA GACTCATCCACAAAGACTGAAAGCCGCGTTTTTTTTTTTAAGAGTTCAGTGACATATTTAGGCATTGTTAATAAAGACAATGAATCTCGAGCAGGAGGCTGTGGTCTTGTTTTGTCAACC
TCCTCTCTCTTGTAAAGCCCCACCCCACTATTTGATTCCCAATTCTAGATCTTCCCTTGT CAAAGCCAAGTACAATTGAGGACCAGTTCATCATTGGGCCAAGCTTTTTCAAAATGTGAA
AGGGGTGTGAAAGCAAGATGATTGGGAGTTCGAGGCCAATCTTGGCTATGAGGCCCTGTC TCAACCTCTCCTCCCTCCCTCCAGGGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTTGATTTGAAACTG
GCTTCCATCTTGATTTGTGTATGTGCACACTGGGGGTTGAACCTGGGCCTTTGTACCTGC CGGGCAAGCTCTCTACTGCTCTAAACCCAGCCCTCACTGGCTTTCTGTTTCAACTCCCAA TGAATTCCCCTAAATGAATTATCAATATCATGTCTTTGAAAAATACCATTGAGTGCTGCT GGTGTCCCTGTGGTTCCAGATTCCAGGAAGGACTTTTCAGGGAATCCAGGCATCCTGAAG
TCCACCATCCTTTAGCATGCCCTTGTATTCCCATCACATGCCAGGGATGAGGGGCATCAG
GGTCAGGTTAGAGTTTATTTATGGAAAGTTATATTCTACCTCCATGGGGTCTACAAGGCT
AGAGCCACAGGGTCCCCACTCTCTTTGAAATGACTTGGACTTGTTGCAGGGAAGACAGAG
CCTGTATAAACCCTCTTCCACAGGTTCCCTGAAAGGAGCCCACATTCCCCAACCCTGTCT CCTGACCACTGAGGATGAGAGCACTTGGGCCTTCCCCATTCTTGGAGTGCACCCTGGTTT
TTCTTGTTTTGTTTGTGATTTAATTTAGGTGTATGAGTGCTTTTGCTTGAATATATGCCTGCTAAAGAGACAGGAGACAAAGGAGAGTTTCTTTTAGTCAATAGGACCATGAATGTTCCT
TTTCCCTGAGCAGTCAGGCCAGTCCAAAGCCCTTCAATTTAGCTTTCATAAGGAACACCC CTTTTGTTGGGTGGAGGTAGCACTTGCCTTGAATCCCAGCATTAAGAAGGCAGAGACAGT
CAAAAACGAACAAACAGAAAAACAAGCCAGAGTGTTTGTCCCCGTATTTTATTAATCATA
AGCAAGGAGTATGTGGTGCATAGCAAACGAGGAAGTTTGCACAGAACAACACTGTGTGTA TCCACAGACCCCTCCCCCCTTTTAACATGGGCATCTCTCATTGGCCTGGAGCTTGCCAAC
GGATTCTACTTTCTATTAAAGTATTTCTATTAAATCAATGAGCCCCTGCCCCTGCACTCA
ATACATGGAACCTGGTGTACATGTTATCTGCATGGGGTTTGCATTGCAATGGCTCTTCAG
TCACATTCTCTGTATGCCTAGCAGGGCAGTATTGGAGACTGAGACTTGACTTGTGTGTCC ATATGATTCCTCCTTTTCCTACAGTCATCTGGGGCTCCTGAGCTTCGTCCTTGTCCAAGA
GATCTGAATGTGGTCCAGCCCTAGTTTCCTTCCAGTTGCTGGGATAAAGCACCCTGACCA AAGCTACTnTTTGTTTGTTTGTTTTGGTTTGGnTTGTTTGGTTTTTCGAGGCAGGGTT
GGCCCAAAGCTACTT丁AAGAGAGAGAGAGGAATGTATAAGTATTATAATTCCAGGTTATA GTTCATTGCTGTAGAATTGGAGTCTTCATATTCCAGGTAATCTCCCACAGACATGCCACA
CAAATCTACAAGAAATAGTGACAGTCACAGTCTCTAACGTTTTGGGCATGAGTCTGAAGT
CTTTGGGATTTGAGATGGTCTTTTGCAGAGCTCCTAATGGCTACATGGAGAGAGGGGGCC
CTAGCAAGAAGGCCTTCCCTGGATCACCCACCACCTTGCACCTCCAGAACTCAGAGCCAA<formula>formula see original document page 101</formula>ACTAGCCTCAGGTAGTTAACCACCGAAAATGAACCAAGGCAGTTCTAATACAAAACCACT
TACTGGGCCTCAGGGGCAGAGACAGGTGGAGCCCTGGAGTTTGAATTCCAGGTTCTGTGA CTGGCCAACACACAGCCATCTCTGCACATCTGTAGTTGCAAGCCTTTTGCACTAAGTTTG
CTCTAATCTCTTGATTTCCTCCCTCTGTCTGTTTCCTTCCTCTTGCTGGGGCCCAGTGGA
GGGGGAAGCTGTCGGCCCAGTGACTTTTTCCCCTTTCTCTTTTTCTTAGAAACCAGTCTC
CCCCGCCCTGTCAATCTGGCTAAGTAAGACAAGTCAAATTTAAAAGGGAACGTTTTTCTA
CTCTGCCAGCCCCGGTGCCTTTTCCTTTCGGAAAGGAGACCCGGAGGTAAAACGAAGTTG CCAACTTTTGATGATGGTGTGCGCCGGGTGACTCTTTAAAATGTCATCCATACCTGGGAT
CTCCTTAGTCTCCTGGCTACGCTCTTGTCACCCCCACTAAGGCTTCAACTTCTTCTATTT CTTCATCTTGACTCCTCTGTACTTTGCATGCCTTTTCCAGCAAAGGCTTTTCTTTAAATC TCCGTCATTCATAAACTCCCTCTAAATTTCTTCCCCTGCCCTTTTCTTTCTCTCTAGGGA
TTTCCCTCCTGAATCTACCACCTTCTTTCTCCCTTCTCCTGACCTCTAATGTCTTGGTCA AACGATTACAAGGAAGCCAATGAAATTAGCAGTTTGGGGTACCTCAGAGTCAGCAGGGGA
TGGTGGTGCTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTGTGTGTGATAGTTACTGTCAAAAGTAATTCTATTTATACACCCTTATACATGGTATTGCTTTTGTTG GAGACTCTAAAATCCAGATTATGTATTTAAAAAAAAATTCCCCAGTCCTTAAAAGGTGAA
GTTTAGGGAGGTGGGGATTTGTGGTGTGGAGACAGGCAGCCTCAAGGATGCTTTTCAACA
ACGTGTGC
SEO ID No. 18:人Beer基因組序列(該基因有2個外顯子，位于第161-427位 和第3186-5219位)
tagaggagaa gtctttgggg agggtttgct ctgagcacac ccctttccct ccctccgggg 60
ctgagggaaa catgggacca gccctgcccc agcctgtcct cattggctgg catgaagcag 120
agaggggctt taaaaaggcg' accgtgtctc ggctggagac cagagcctgt gctactggaa 180
ggtggcgtgc cctcctctgg ctggtaccat gcagctccca ctggccctgt gtctcgtctg 240
cctgctggta cacacagcct tccgtgtagt ggagggccag gggtggcagg cgttcaagaa 300
tgatgccacg gaaatcatcc ccgagctcgg agagtacccc gagcctccac cggagctgga 360
gaacaacaag accatgaacc gggcggagaa cggagggcgg cctccccacc acccctttga 420
gaccaaaggt atggggtgga ggag卿att cttagtaaaa gatcctgggg aggtttt卿 480
103aacttctctt tgggaggctt ggaagactgg ggtagaccca gtgaagattg ctggcctctg 540 ccagcactgg tcgaggaaca gtcttgcctg gaggtggggg aagaatggct cgctggtgca 600 gccttcaaat tcaggtgcag aggcatgagg caacagacgc仁ggtgagagc ccagggcagg 660 gaggacgctg gggtggtgag ggtatggcat cagggcatca gaacaggctc aggggctcag 720 aaaagaaaag gtttcaaaga atctcctcct: gggaatatag gagccacgtc cagctgctgg 780 taccactggg aagggaacaa ggtaagggag cctcccatcc acagaacagc acctgtgggg 840 caccggacac tctatgctgg仁ggtggctgt ccccaccaca cagacccaca tcatggaatc 900 cccaggaggt gaacccccag ctcgaagggg aagaaacagg ttccaggcac tcagtaactt 960 ggtagtgaga agagctgagg tgtgaacctg gtttgatcca actgcetagat agccctggtg 1020 tgtggggggg tgtgggggac agatctccac aaagcagtgg ggaggaaggc ca'gagaggca 1080 cccctgcagt gtgcattgcc catggcctgc ccagggagct ggcacttgaa ggaatgggag 114 0 ttttcggcac ag仁tttagcc cctgacatgg gtgcagctga gtccaggccc tggaggggag.1200 agcagcatcc tctgtgcagg agtagggaca tctgtcctca gcagccaccc cagtcccaac 1260 cttgcctcat tdcaggggag ggagaaggaa gaggaaccct gggttcctgg tcaggcctgc 1320 acagagaagc ccaggtgaca gtgtgcatct ggctctataa ttggcaggaa tcctgaggcc 1380 atgggggcgt ctgaaatgac acttcagact aagagcttcc ctgtcctctg gccattatcc 1440 aggtggcaga gaagtccact gcccaggctc ctggacccca gccctccccg cctcacaacc 1500 tgttgggact atggggtgct aaaaagggca actgcatggg aggccagcca ggaccctccg 1560tcttcaaaat ggaggacaag ggcgcctccc cccacagctc cccttctagg caaggtcagc 1620
tgggctccag cgactgcctg aagggctgta aggaacccaa acacaaaatg tccaccttgc 1680
tggactccca cgagaggcca cagcccctga ggaagccaca tgctcaaaac aaag仁catga 1740
tctgcagagg aagtgcctgg cctaggggcg ctattctcga aaagccgcaa aatgccccct 1800
tccctgggca aatgcccccc tgaccacaca caca仁tccag ccctgcagag gtgaggatgc 1860 aaaccagccc acagaccaga aagcagcccc agacgatggc agtggccaca tctcccctgc 1920 tgtgcttgct cttcagagtg ggggtggggg gtggccttc匕ctgtcccctc tctggtttgg 1980 仁cttaagact a仁ttttcatt ctttcttgtc acattggaac tatccccatg aaacctttgg 2040 gggtggactg gtactcacac gacgaccagc tatttaaaaa gctcccaccc atctaagtcc 2100 accataggag acatggtcaa ggtgtgtgca ggggatcagg ccaggcctcg gagcccaatc 2160 tctgcctgcc cagggagtat caccatgagg cgcccattca gataacacsg aacaagaaat 2220 gtgcccagca gagagccagg tcaatgtttg tggcagctga acctgtaggt tttgggtcag 2280 agctcagggc ccctatggta ggaaagtaac gacagtaaaa agcagccctc agctccatcc 2340
cccagcccag cctcccatgg atgctcgaac gcagagcctc cactcttgcc ggagccaaaa 2400
ggtgctggga ccccagggaa gtggagtccg gagatgcagc ccagcct仁tt gggcaagttc 2460
ttttctctgg ctgggcctca gtattctcat tgataatgag ggggttggac acactgcctt 2520
tgattccttt caagtctaan gaattcctgt cctgatcacc tccccttcag tccctcgcct 2580
ccacagcagc tgccctgatt tattaccttc aattaacctc tactcctttc tccatcccct 2640gtccacccct cccaagtggc tggaaaagga atttgggaga agccagagcc aggcagaagg 2700
tgtgctgagt acttaccctg cccaggccag ggaccctgcg gcacaagtgt ggcttaaatc 2760
ataagaagac cccagaagag aaa仁gataat aataatacat aacagccgac gctttcagc仁 2820
atatgtgcca aatggtattt tctgcattgc gtgtgtaatg gattaactcg caatgcttgg 2880
ggcggcccat tttgcagaca ggaagaagag agaggttaag gaacttgccc aagatgacac 2940
ctgcagtgag cgatggagcc ctggtgtttg aaccccagca gtcatttggc tccgagggga 3 000 cagggtgcgc aggagagctt tccaccagct ctagagcatc tgggaccttc ctgcaataga 3060 tgttcagggg caaaagcctc tggagacagg cttggcaaaa gcagggctgg ggtggagaga 3120 gacgggccgg tccagggcag gggtggccag gcgggcggcc accctcacgc gcgcctctct 318 0 ccacagacgt gtccgagcac agctgccgcg agct:gcactt cacccgctac gtgaccgatg 3240 ggccgtgccg cagcgccaag ccggtcaccg agctggtgtg ctccggccag tgcggcccgg 3300 cgcgcctgct gcccaacgcc atcggccgcg gcaagtggtg gcgacctagt gggcccgact 3360 tasgctgcat ccccgaccgc taccgcgcgc agcgcgtgca gctgctgtgt cccggtggtg 3420
aggcgccgcg cgcgcgcaag gtgcgcctgg tggcctcgtg caagtgcaag cgcctcaccc 3480
gcttccacaa ccagtcggag ctcaaggact tcgggaccga ggccgctcgg ccgcagaagg 3540
gccggaagcc gcggccccgc gcccggagcg ccaaagccaa ccaggccgag ctggagaacg 36 00
cctactagag cccgcccgcg cccctcccca ccggcgggcg ccccggccct gaacccgcgc 3660
cccacatttc tgtcctctgc gcgtggtttg attgtttata tttcattgta aatgcctgca 3720<formula>formula see original document page 107</formula><formula>formula see original document page 108</formula>ctggcataga caacacaaag ccaagtacaa ttcaggacca gc仁cacagga aacttcatct 594 0 仁cttcgaagt gtggatttga tgcctcctgg gtagaaatgt aggatcttca aaagtgggcc 6000 agcctcctgc acttctctca aagtctcgcc tccccaaggt gtcttaatag tgctggatgc 6060 tagctgagtt agcatc仁tca gatgaagagt aaccctaaag ttactcttca gttgccctaa 6120 ggtgggatgg tcaactggaa agctttaaat taagtccagc ctacctt:ggg. ggaacccacc 6180 cccacaaaga aagctgaggt ccctcctga仁gacttgtcag tttaactacc aa仁aacccac 6240 t仁gaattaat catcatcatc aagtctttga taggtgtgag tgggtatcag tggccggtcc 6300 cttcctgggg ctccagcccc cgaggaggcc tcagtgagcc cctgcagaaa atccatgcat 6360 ca仁gagtgtc tcagggccca gaatatgaga gcaggtagga aacagagaca tcttccatcc 6420 ctgagaggca gtgcggtcca gtgggtgggg acacgggctc tgggtcaggt 仁tgtgttgtt 6480 tgtttgt仁tg ttttgagaca gagtctcgct cta仁tgccca ggctggagtg cagtgtcaca 6540 atctcggctt actgcasic仁t ctgcct仁ccc ggattcaagt gattctcctg cctcagcctc 6600 cagagtagct gggattacag gtgcgtgcca ccacgcctgg ctaatttttg tatttttgat 6660 agagacgggg tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa ctcttgacct caagtgatct 6720 gcctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccaca cccagcccca 6780 ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg ttaaatgttt tgcccacagc 6840 catacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900 acatgggcaa taaccaggtc acactgttt仁gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960agtaatttgc tctgtggagg gga仁gaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 702 0 tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggc:ttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080 caaagactgc aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga atccaccatt cctcaacatg 714 0 仁accgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agcaatgtcc 7200 aaacctaggg tctgctttct gggacctgaa gatacaggat ggatcagccc aggctgcaat 7260 cccattacca cgagggggaa aaaaacc仁ga aggctaaatt gtaggtcggg ttagaggtta 7320 仁ttatggaaa gttatattct acctacatgg gg仁ctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380 gaacaaacaa cagacctagc tgggaggggc agcattttgt tgtagggggc ggggcacatg 744 0 ttctgggggt acagccagac tcagggcttg tattaatagt ctgagagtaa gacagacaga 7500 ggga仁agaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560 tctctcacac acacacacag acacacacac acgctctgta ggggtctact tatgctccas 7620 gtacaaatca ggccacattt acacaaggag gtaaaggaaa agaacgttgg aggagccaca 7680 ggaccccaaa attccctgtt ttccttgaat caggcaggac ttacgcagct gggagggtgg 7740 agagcctgca gaagccacct gcgagtaagc caagttcaga gtcacagaca ccaaaagctg 7800 gtgccatgtc ccacacccgc ccacctccca cctgctcctt gacacagccc tgtgctccac 7860 aacccggctc ccagatcatt gattatagct ctggggcctg caccgtcctt cctgccacat 7920 ccccacccca ttcttggaac ctgccctctg tcttctccct tgtccaaggg caggcaaggg 7980 ctcagctatt gggcagcttt gaccaacagc tgaggc仁cct tttgtggctg gagatgcagg 8040aggcagggga atattcctct tagtcaatgc gaccatgtgc ctggtttgcc cagggtggtc 8100 tcgtttacac ctgtaggcca agcgtaatta ttaacagctc ccacttc仁ac tctaaaaaat 8160
gacccaatct gggcagtaaa ttatatggtg cccatgctat: taagagctgc aact仁gctgg 8220
gcgtggtggc tcacacctgt aatcccagta ctt:tgggacg tcaaggcggg tggatcacct 8280 gaggtcacga gttagagact ggcctggcca gcatggcaaa accccatctt tactaaaaat 8340
acaaaaatta gcaaggcatg gtggcatgca cc仁gtaatcc caggtactcg ggaggctgag 8400 acaggagaat ggcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg 8460 ccctccagcc ctggcaacag agcaagac仁t catctcaaaa gaaaaaggat actgtcaatc 8520 actgcaggaa gaacccaggt aatgaatgag gagaagagag gggctgagtc accatagtgg 8580 cagcaccgac tcctgcagga aaggcgagac actgggtcat gggtactgaa gggtgccctg 864 0 aatgacgttc tgctttagag accgaacctg agccctgaaa gtgcatgcct gttcatgggt 8700 gagagactaa attcatcatt ccttggcagg tactgaatcc tttcttacgg ctgccctcca 8760 atgcccaatt tccctacaat tgtctggggt gcctaagctt ctgcccacca agagggccag 8820 agctggcagc gagcagctgc aggtaggaga gataggtacc cataagggag gtgggaaaga 8880 gagatggaag gagaggggtg cagagcacac acctcccctg cctgacaact tcctgagggc 8940 tggtcatgcc agcagattta aggcggaggc aggggagatg gggcgggaga ggaagtgaaa 9000
aaggagaggg tggggatgga gaggaagaga gggtgatcat tcattcattc cattgc仁act 9060
gactggatgc cagctgtgag ccaggcacca ccctagctct gggcatgtgg ttgtaatctt 9120
111ggagcctcat ggagctcaca gggagtgctg gcaaggagat ggataatgga cggataacaa 9180
ataaacattt agtacaatgt ccgggaatgg aaagttctcg aaagaaaaat aaagctggtg 9240
agcatataga cagccctgaa ggcggccagg ccaggcattt ctgaggaggt ggcatttgag 9300
c 9301
從前面的描述，應該理解，盡管為了說明的目的本文描述了本發(fā)明的 具體實施方案，但可以進行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范疇。因 此，本發(fā)明僅受附及權利要求的限制。序列表
<110> Brun)cow, Mary E. Galas, David J. Kovacevich, Brian Mulligan, John T. Paeper, Bryan W. Van Ness, Jeffrey Winkler, David G.
<120>增加骨礦化的組合物和方法
<130> 240083.508
<140> US
<141> 1999-11-24
<160> 41
<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
<210> 1 <211> 2301 <212> DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>
agagcctgtgctectggaaggtggcgtgccctcctctggctggtaccatgcagctcccac60
tggccctgtgtctcgtctgcctgctggtacacacagccttccgtgtagtggagggccagg120
ggtggcaggcgttcaagaatgatgccacggaaatcatccccgagctcggagagtaccccg180
agcctccaccggagctggagccatgaaccgggcggagascggagggcggc240
CtCCCC3CC3cccctttgagaccaaagacgtgtccgagtacagctgccgcgagctgcact300
tcacccgctacgtgaccgatgggccgtgccgcagcgccaagccggtcaccgagctggtgt360gctccggccagtgcggcccggcgcgcctgctgcccaacgcca仁cggccgcggcasgtggt420
ggcgacctagtgggcccgacttccgctgcatccccgaccgctaccgcgcgcagcgcgtgc480
agctgctgtgtcccggtggtgaggcgccgcgcgcgcgcaaggtgcgcctggtggcctcgt540
gcasgtgcaagcgcctcacccgcttccacaaccagtcggagctcaaggacttcgggaccg600
aggccgctcggccgcagaagggccggaagccgcggccccgcgcccggagcgccaaagcca"0
3cc3ggccg3gctggagaacgcctac亡agagcccgcccgcgcccctccccaccggcgggc720
gccccggccctgaacccgcgccccacatttctgtcctctgcgcgtggtttgattgt仁tat780
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atcccgggcgccggcsaggcccccctcagcccgccagctg3ggggtccc3cggggcsggg900
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ttgctggtcccacttcagaggaggcagaaatggaagcat:tttcaccgccc1020
agggagcggtgtgggagtggggactggttaagaaagttggataagattcc1080
cccttgcscctcgctgcccatcagaaagcctgaggcgtgcccagagcacaagactggggg1140
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aagagtctatttatggctgacatatttacggctgacaaac1500
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ccctccatctcaaagaaa仁attggggtagaaaaggagagggtccgagggt1620
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tcttacatgtgatggcatatttgggggaaaaactacaag仁1920
gctgtacatatgctgagaaactgcagagcataatagctgctctttttgaa1980
3atcatttccagacaacctcttactttctgtgtagtttttaattgttaaa2040
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ttccacgtggg3cttgtcc3agtagtggtttttaaagagt2160
atttattttctcacttaagttatttatgcaaaagtttttcttgtagagaatgacaatgtt2220
aatattgctttatgaa仁taacagtctgttcttccagagtccagagacattgttaataaag2280
acaatgaatcg2301
<210> 2 <211> 213<212> PRT <213:>人
<400> 2 Met Gin Levi Pro
Ala Phe
Ala Thr
Glu Leu
50
Pro Pro
65
Arg Glu
Ala Lys
Arg Leu
Gly Pro 130 Gin Leu 145
Leu Val
Ser Glu
Arg Lys
Leu Glu 210
Arg Val
20 Glu lie 35
Glu Asn His His
!Leu His
Pro Val 100 Leu Pro 115
Asp Phe
Leu Ala 5
Val Glu
lie Pro
Asn Lys
Pro Phe
70 Phe Thr 85
Thr Glu Asn Ala
Leu Cys
Gly Gin
Glu Leu
Thr Met 55
Glu Thr
Arg Tyr Leu Val
Leu Val
10 Gly Trp
25
Gly Glu
Asn Arg
!Lys Asp
Val Thr
90 Cys Ser 105
Arg Gly
Cys L eu Leu Val His Thr 15
Gin Ala Phe
Tyr Pro Glu 45
Ala Glu Asn 60
Val Ser Glu
75
Asp Gly Pro Gly Gin Cys
lie Gly 120
Arg Cys 工le Pro Asp Arg 135
Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro ISO
Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu 165 170 Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala
180 185 Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala 195 200 205
Asn Ala Tyr
Lys
30 Pro
Asn
Asp
Pro Pro
Gly Gly Arg Tyr Ssr
Lys Trp Trp 125
Tyr Arg Ala
140 Arg Ala Arg 155
Thr Arg Phe Ala Arg Pro Lys Ala Asn
Cys
Gly 110 Arg
95 Pro
Cys 80 Ser
Ala
Pro Ser
Gin Arg Val
Lys Val Arg 160 Asn Gin 175
Lys Gly
His Gin Gin
Ala Glu
:210> 3 :211> 2301 c212> DNA<formula>formula see original document page 116</formula>aatcatttccttsctttctgtgtagttttt2040
tttaaac3g3agcacatgacatatgaaagcctgcaggactggtcgtttttttggcaattc2100
ttccacgtgggacttgtccacaagaa仁gaaagtagtggtttttaaagagt2160
3tttattttctcacttaagtt3tttatgcaaaagtttttcttgtagagaatgacaatgtt2220
cagtctgttcttccagagtccagagacattg仁taataaag2280
g2301
<210> 4 <211> 23 <212> PRT <213>人
Met
<400> Gln !Leu
4
Pro
Leu
Ala Phe Arg Val Val 20
Ala Leu Cys Leu Val Cys 10
Glu Gly
Leu Leu Val His Thr 15
<210> 5 <211> 2301 <212> DNA <213>人
<400> 5
agagcctgtgctactggaaggtggcgtgccctcctctggctggtaccatgcagctcccac60
tggccctgtgtctcatctgcctgctggtacccgtgtagtggagggccagg120
ggtggcsggcgttcaagaatgatgccacggaaatcatccgcgagctcggagag仁accccg180
agcctccaccggagctggagccatgaaccgggcggagaacggagggcggc240
CtCCCC3CC3cccctttgagtgtccgagtacagctgccgcgagctgcact300
tcacccgctacgtgsiccgatgggccgtgccgcagcgccaagccggtcaccgagctggtgt360
gctccggccagtgcggcccggcgcgcctgctgcccaacgccatcggccgcggcaagtggt420
ggcgacctagtgggcccgacttccgctgcatccccgaccgctaccgcgcgcagcgcgtgc480
agctgctgtgtcccggtggtgaggcgccgcgcgcgcgcaaggtgcgcctggtggcctcgt540
gcaagtgcaagcgcctcacccgcttccacaaccagtcggagctcaaggacttcgggaccg600
aggccgctcggccgcagaagggccggaagccgcggccccgcgcccggagcgccsaagcca660
accaggccgagctggagaacgcc仁actagagcccgcccgcgcccctccccaccggcgggc720
117gccccggccctgaacccgcgccccacatttctgtcctctgcgcgtggt亡tgattgtttat780
atttcattgt3a3tgcctgcaacccagggc3gggggc仁gagaccttccaggccctgagga840
atcccgggcgccggcaaggcccccc仁cagcccgccagctgaggggtcccacggggcaggg900
gagggaattgagagtcacagacactgagcc3cgc3gccccgcctctggggccgcctacct960
ttgctggtcccacttcagaggaggcagaaatggaagcattttcaccgccctggggt仁tta1020
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cccttgcacctcgctgcccatcagaaagcctgaggcgtgcccagagcacaagactggggg1140
caactgtagatgtggtttctagtcctggctctgccsct 33cttgctgtgt1200
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cagaggtgag3gagagagagagaaagagagagaatgaatgcagttgcattgattcagtgc1380
caaggtcacttccagaattcagagttgtgatgctctcttctgacagccaa1440
aagagtctatttatggctgacatatttacggctgacaaac1500
tcctggaagaagctstgctgcttcccagcctggcttccccggatgtttggcteicctccac1560
ccctccatctacattatccattggggtagagtccgagggt1620
ggtgggagggcatccgcccc33cttccca3agagcagcatccctcccccg1680
atgttttaaagtcaccttccgaagagaagtgaaaggttcaaggacactgg1740
ccttgcaggcccgagggsgcagccatcacaaactcacagaccsgcacatcccttttgaga1800
caccgccttctgcccaccactdacggacacatttctgcctagaaaacagcttcttactgcI860
tcttacatgtgatggcatatcttacactaattgggggaaaaactacaagt1920
gctgtacatatgctgagaasctgcagagcataatagctgctctttt仁gaa1980
3atC3tttCCageicaacctcttactttctgtgtagttttt2040
tttaaacagaagcacatgacatatgaaagcctgcaggactggtcgtttttttggcaattc2100
仁tccacgtgggacttgtccacaagaatgaaagtagtggtttttaaagagttaagttacat2160
3ttt3ttttCtcsct:taagttatttatgcaaaagtttttcttgtagagaa2220
tatgaattaaceigtctgttcttccagsigtccagagacattgttaataaag2280
3C33tg3atCatgaccgaaag2301
<210> 6
<211> 213
<212> PRT <213>人
<400> 6
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu lie Cys Leu Leu Val His Thr 15 10 15Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp
Ala Thr
Glu
Pro
65
Arg
Leu
50
Pro
Glu
35
Glu
20 lie
lie
Asn Asn
His His Pro
Glu Leu His
Ala Lys Pro
Arg Leu
Gly
Gin 145 Leu
Pro 130 Leu
Leu
115 Asp
Val 100 Pro
Phe
85
Thr
Arg
Lys
Phe
70
Thr
Glu
Thr 55 Glu
Leu 40
Met
Thr Lys Asp
Arg Tyr Val
25
Gly Glu Tyr Pro
Asn Arg Ala Glu 60 Ser
Glu Leu Val
Asn Ala lie
Phe Arg Cys
ljeu Cys Pro
Val Ala Ser
Ser Glu Leu
Arg Lys
Lieu
Glu 210
Pro 195 Asn
Lys 180 Arg
Cys 165 Asp
Gly 150 Lys
工le 135 Gly
Gly
120 Pro
Cys 105 Arg
Thr 90 Ser
Val
75 Asp
Asp Arg Tyr
Glu Ala Pro
Cys Gly Pro Arg Ala
Lys Arg
Thr
Arg 200
Glu 185
Ser
!>eu 170 Ala
Arg 155 Thr
Arg 140 Ala
Arg Ala Lys Ala
Ala
Glu
45
Asn
Gly Gin Cys Gly Lys Trp
Trp
125 Ala
30 Pro
Pro Pro
Gly Gly Arg
Glu Tyr Ser
Gly Pro Cys
Gly 110 Arg
Arg
95
Pro
Cys
80
Ser
Ma
Pro Ser
Gin Arg Val Arg Lys Val
Phe His
Pro
Asn 205
Gin Gin
Asn 175 Lys
Arg 160 Gin
Gly
Ala Glu
<210:
<212: <213:
Ala Tyr
7
2301
DNA
人
<400> 7
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tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120
ggtggcaggc g仁tcaagaat gatgccacgg aaatcatccg cgagctcgga gagtaccccg 180agcctccaccggagctggagccatg33ccgggcggagaacggagggcggc240
CtCCCC3CC3cccctt仁gagaccaaagacgtgtccgagtacagctgccgcgagctgcact300
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的cccagggcagggggctgagaccttccaggccctgagga840
atcccgggcgccggcei6iggcccccctcagcccgccsgctgaggggtcccacggggcaggg900
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tatgaattaacagtctg仁tcttccagagtccagagacattgttaataaag2280
atgaccgaaag2301<formula>formula see original document page 121</formula><210> 9 <211> 642 <212> DNA
<213> Cercopithecus pygerythrus
<400> 9
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aatggagggcggcctccccaCC3CCCCtttgagaccaaagacgtgtccgagtacagctgc240
cgagagctgcacttc3cccgctacgtgaccgatgggccgtgccgcagcgccaagccagtc300
accgsgttggtgtgctccggccagtgcggcccggcacgcctgctgcccaacgccatcggc360
cgcggcaagcggtggcgcccgagtgggcccgact仁ccgctgcatccccgaccgctaccgc420
gcgcagcgtg亡gcagctgctg仁gtcccggtgg亡gccgcgccgcgcgcgcgcsaggtgcgc480
ctggtggcctcgtgcaagtgcaagcgcctc3cccgcttcc3C33CC3gtCggagctcaag54 0
gacttcggtcccgaggccgctcggccgcagaagggccggaagccgcggccccgcgcccgg600
ggggccaaagccaatcaggccgagctggag3acgcct3ct642
<210> 10 <211> 213 <212> PRT
<213.> Cercopithecus pygery仁hrus
<400> Met Gin JLeu
Ala Phe Arg
Ala Thr Glu 35
Glu L>eu Glu 50
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10 Pro
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Leu Ala 5
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70 Phe Thr
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Leu Gly Glu 40
Met Asn Arg Thr Lys Asp Tyr Val Thr
85 90
Cys Leu Leu Val His Ala 15
Gin Ala Phe' Lys Asn Asp 30
Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 45
Ala Glu Asn Gly Gly Arg 60
Val Ser Glu Tyr Ser Cys 75 80 Asp Gly Pro Cys Arg Ser 95<formula>formula see original document page 123</formula><211> <212> <213>
<400> Met Gin Pro
Ala Phe Cys
211 PRT
臺灣鼷鼠
Ala Thr
Glu Asn
50 His His 65
JLeu His
Glu
35
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12 Ser
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5 Val
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Ala Pro Cys Leu 工le Cys Leu Leu Val His Ala
Glu Gly Gin Gly
Gin Thr Met
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Asp Phe 130 L eu Cys 145
Ala Ser
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Asn Ala 210
115 Arg
Glu 100 Ala
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85
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Lys
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Gly
25
Gly
10
Trp
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Asp
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Gly Pro
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Gly 105 Lys
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Gin
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Tyr Arg
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Gly Ala Arg
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Ala
Gin Ala Phe
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Glu Tyr Ser
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Ser
Ala 110 Asn
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80
Lys
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Gly Pro
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Arg Leu
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<210> 13 <211> 674
124<formula>formula see original document page 125</formula>Arg Leu
Leu 115 Asp
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Leu Val Ala Ser
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Leu Cys Pro
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Arg Pro Arg
Arg Lys
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Asn 205
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15 532 DNA Bos
torus
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15
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<210> 16 <211> 176 <212> PRT <213> Bos torusAsn
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Glu Leu
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Asn Asn Lys Thr
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Arg Leu Leu
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Glu Leu Ala lie
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Val Cys
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Arg Lys Leu
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Gly Gly 120 Lys Cys 135
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Gly Glu
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Asp Ala
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Gly Lys Arg Tyr Pro Arg
Lys Arg
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Arg Ala Arg Gly Thr Lys
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Ser Glu Tyr 45
Gly Pro Cys Gin Cys Gly
Trp Trp Arg
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Arg Ala Gin
110 Ala Arg Lys 125
Arg Phe His Arg Pro Gin Ala Ser Arg
Pro
Gly
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Pro
80
Pro
Arg
Val
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Ala
170 175
<210》17 <211> 35828 <212> DNA <213>臺灣鼷鼠
<220:>
<22^其它特征
<222> (1)…(35828)
<223> n = A,T,C or G
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130<formula>formula see original document page 131</formula>gtgtatgcacatgtgccacatgtgtacagatactatggaggccagaagaggccatggccg8700
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<220>
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<223> PGR引物<400> 21
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<220>
<223> PGR引物 <400> 24
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<223> PCR引物 <400> 36
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<220>
<223> PGR弓l物 <400> 37
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權利要求
1. 分離的核酸分子，所述核酸分子選自(a)含有選自SEQ ID NOs1、5、9、11、13和15的核苷酸序列，或其互補序列的分離核酸分子；(b)分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含與編碼含有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸具有至少90％一致性的序列，其中所述蛋白質能降低骨礦質含量；(c)分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含與編碼含有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸具有至少95％一致性的序列，其中所述蛋白質能降低骨礦質含量；(d)包含與SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互補序列具有至少95％一致性的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子編碼能降低骨礦質含量的蛋白質；(e)包含與SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互補序列具有至少90％一致性的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子編碼能降低骨礦質含量的蛋白質；(f)包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的分離的核酸分子；(g)包含SEQ ID NO1所示多核苷酸序列第48-689位核苷酸或者其互補序列的分離的核酸分子；(h)與SEQ ID NO1第48-689位核苷酸或其互補序列具有至少90％一致性的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼能降低骨礦質含量的蛋白質；(i)與SEQ ID NO1第48-689位核苷酸或其互補序列具有至少95％一致性的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼能降低骨礦質含量的蛋白質；和(j)能夠與(a)-(i)的核酸分子在高嚴緊條件下雜交的分離的核酸分子，所述高嚴緊條件包括在55-60℃下5×SSPE、5×Denhardt氏液和0.5％ SDS，其中所述分離的核酸分子編碼能降低骨礦質含量的蛋白質。
2. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO: 2之^J^^列的 蛋白質。
3. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO. 6之M酸序列的蛋 白質。
4. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO. 10之M酸序列的 蛋白質。
5. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO. 12之M酸序列的 蛋白質。
6. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO. 14之M^f列的 蛋白質。
7. 分離的核酸分子，其編碼含有SEQ ID NO. 16之M酸序列的 蛋白質。
8. 含有可操作地與根據權利要求1-7之任意一項的核酸分子相連 接的啟動子的表達栽體。
9. 根據權利要求8的表達栽體，其中所述啟動子選自CMV I-E啟 動子、SV40早期啟動子和MuLV LTR。
10. 根據權利要求8的表達載體，其中所述啟動子是組織特異性啟 動子。
11. 制備TGF-P結合蛋白的方法，包括在足以產生所述蛋白質的時間和條件下，培養(yǎng)含有根據權利要求8的栽體的細胞。
12. 根據權利要求11的方法，進一步包括純化所述蛋白質的步驟。
13. 包含根據權利要求1-7之任意一項的核酸分子的病毒栽體。
14. 根據權利要求13的病毒載體，其中所述載體選自單純皰滲病 毒栽體、腺病毒栽體、腺病毒伴隨病毒載體和逆轉錄病毒載體。
15. 帶有根據權利要求8 - 10、 13和14之任意一項的載體的宿主 細胞。
16. 根據權利要求15的宿主細胞，其中所述細胞選自人細胞、狗 細胞、猴細胞、大鼠細胞和小鼠細胞。
17. 包含保持改變骨礦質含量的能力的多肽的分離的蛋白質，所述 多肽選自(a )權利要求1-7任一項的核酸分子編碼的M酸序列； (b) SEQIDN0:2、 6、 10、 12、 14和16中任何一個所示的氨基酸 序列；(c )與SEQ ID NO: 2所示序列具有至少90%—致性的>#^酸序列； (d )與SEQ ID NO: 2所示序列具有至少95 %—致性的^酸序列； (e) SEQ ID N0:2所示^酸序列；和 (f ) SEQ ID NO: 1第48 - 689位核苷酸編碼的^酸序列。
18. 分離的多肽，其包含SEQ ID NO: 2之蛋白質的長至少50個氨 基酸的片段。
19. 分離的多肽，其包含SEQ ID NO: 6之蛋白質的長至少50個氨基酸的片段。
20. 分離的多肽，其包含SEQ ID N0: IO之蛋白質的長至少50個氨基酸的片段。
21. 分離的多肽，其包含SEQ ID N0: 12之蛋白質的長至少50個氨基酸的片段。
22. 分離的多肽，其包含SEQ ID N0: 14之蛋白質的長至少50個氨基酸的片段。
23. 分離的多肽，其包含SEQ ID N0: 16之蛋白質的長至少50個氨基酸的片段。
24. 分離的多肽，其包含SEQ ID N0:2之蛋白質的長至少IOO個氨基酸的片段。
25. 權利要求17 - 24任一項的多肽或蛋白質，其包含可檢測標記。
26. 與根據權利要求17 一 25之任意一項的蛋白質特異結合的分離的抗體。
27. 與SEQ ID NO: 2所示的蛋白質特異結合的分離的抗體。
28. 與由SEQ ID N0:2第25-213位氨基酸組成的多肽特異結合的分離的抗體。
29. 權利要求20 - 27任一項的抗體，其中所述抗體或片段以大于或者等于106 Nf1的Ka與SEQ ID NO: 2的多肽結合。
30. 包含權利要求20 - 27任一項的抗體或片段的多肽，其中所述多肽以大于或者等于106 M^的Ka與SEQ ID NO: 2的多肽結合。
31. 權利要求29的抗體，其具有大于或者等于107 M"1的Ka。
32. 根據權利要求25-31任一項的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
33. 根據權利要求25-31任一項的抗體，其中所述抗體包含抗體片段。
34. 根據權利要求32的抗體，其中所述單克隆抗體選自鼠單克隆抗體、人單克隆抗體和人源化單克隆抗體。
35. 根據權利要求32的抗體，其中所述抗體選自F(ab， )2、 F(ab)2、Fab' 、 Fab和Fv。
36. 與根據SEQ ID NO: 2的蛋白質特異結合的抗體。
37. 根據權利要求36的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
38. 根據權利要求36的抗體，其中所述抗體包含抗體片段。
39. 根據權利要求37的抗體，其中所述單克隆抗體選自鼠單克隆抗體、人單克隆抗體和人源化單克隆抗體。
40. 根據權利要求36的抗體，其中所述抗體選自F(ab， )2、 F(ab)2、Fab， 、 Fab和Fv。
41. 權利要求25 - 40之任意一項的抗體，其能夠增加骨密度或骨礦化。
42. 權利要求25 - 41之任意一項的抗體用于制造增加骨礦化的藥物的用途。
43. 權利要求42的用途，其中所述藥物用于治療骨質減少。
44. 權利要求43的用途，其中所述骨質減少是由貧血狀態(tài)、類固醇、肝素、骨髓疾病、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、特發(fā)性骨質疏松癥、先天性骨質減少或骨質疏松癥、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、絕經后狀態(tài)、月經稀發(fā)、閉經、妊娠、糖尿病、甲狀腺功能亢進、庫欣病、肢端肥大癥、性腺功能減退癥、不活動或廢用、反射交感性營養(yǎng)不良綜合征、短暫性區(qū)域骨質疏松或者骨軟化引起的。
45. 權利要求42的用途，其中所述藥物用于治療骨折。
46. 權利要求42的用途，其中所述藥物用于治療骨質疏松癥。
47. 權利要求42的用途，其中所述藥物用于治療與骨異常生長或發(fā)育有關的發(fā)育異常。
48. 權利要求25 - 40任一項的抗體或者多肽用于制備和另一種骨吸收抑制物共同給藥的藥物的用途。
49. 權利要求48的用途，其中骨吸收抑制物選自降鉀素、雌激素、二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三苯氧胺。
50. 產生根據權利要求32的抗體的雜交瘤。
51. 產生根據權利要求37的抗體的雜交瘤。
52. 藥物組合物，包含根據權利要求20 - 40任一項的抗體，和可藥用載體或稀釋劑，并任選包含骨吸收抑制物。
53. 能抑制SEQ ID NO: 2、 6、 8、 10、 12、 14或16任何一個的活性的有機分子用于制造增加恒溫動物骨礦質含量的藥物的用途。
54. 權利要求53的用途，其中所述分子選自抗體、抗體片段、核酸、多肽和肽。
55. 骨吸收抑制物在制備用于與抑制SEQ IDN0:2、 6、 8、 10、 12、14或16任何一個的活性的試劑共同給藥的藥物中的用途。
56. 權利要求55的用途，其中骨吸收抑制物選自降鉀素、雌激素、二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三苯氧胺。
57. 融合蛋白質，其包含第一多肽片段和第二多肽片段，其中第一多肽片段含有根據權利要求l-7之任意一項的核酸分子所編碼的蛋白，第二多肽片段含有異源蛋白。
58. 根據權利要求57的融合蛋白質，其中所述第二多肽片段含有多個陰離子M酸殘基。
59. 能夠與根據SEQ ID N0:1、 5、 7、 8、 11、 13或15的核酸分子或其互補物在高嚴緊條件下雜交的分離的寡核苷酸，其中所述條件包括在55-60'C下5xSSPE、 5xDenhardt氏液和0， 5%SDS中過夜進行雜交。
60. 能夠與和SEQ ID N0:1、 5、 7、 8、 11、 13或15的核酸分子或 其互補物完全互補的RM在高嚴緊條件下雜交的分離的寡核苷酸，其中 所述條件包括在55-60i:下5xSSPE、 5xDenhardt氏液和0. 5%SDS中過夜 進行雜交。
61. 根據權利要求59或60的分離的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 長至少20個核苷酸。
62. 根據權利要求61的分離的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長至 少30個核苷酸。
63. 根據權利要求62的分離的寡核普酸，其中所述寡核苷酸長至 少50個核苷酸。
64. 根據權利要求63的分離的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長至 少50 - 100個核苷酸。
65. 權利要求55或60的寡核苷酸用于制造增加骨礦化的藥物的用途。
66. 權利要求65的用途，其中所述藥物用于治療骨質減少。
67. 權利要求65的用途，其中所述骨質減少是由貧血狀態(tài)、類固 醇、肝素、骨髓疾病、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、特發(fā)性骨質疏松 癥、先天性骨質減少或骨質疏松癥、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、絕經 后狀態(tài)、月經稀發(fā)、閉經、妊娠、糖尿病、曱狀腺功能亢進、庫欣病、 肢端肥大癥、性腺功能減退癥、不活動或廢用、反射交感性營養(yǎng)不良綜 合征、短暫性區(qū)域骨質疏松或者骨軟化引起的。
68. 權利要求66的用途，其中所述藥物用于治療骨質疏松癥。
69. 權利要求66的用途，其中所述藥物用于治療骨折。
70. 權利要求66的用途，其中所述藥物用于治療與骨異常生長或 發(fā)育有關的發(fā)育異常。
71. 權利要求59或60的寡核苷酸用于制備和骨吸收抑制物共同給 藥的藥物的用途。
72. 權利要求71的用途，其中骨吸收抑制物選自降鈞素、雌激素、 二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三苯氧胺。
73. 藥物組合物，包含根據權利要求59或60的寡核苷酸，和可藥 用載體或稀釋劑。
74. 引物對，其是下列引物對之一(i) SEQ ID NO:19和20的引物;(ii) SEQ ID NO:23和24的引物;(iii) SEQ ID NO:26和27的引物；和 Uv) SEQ ID NO:28和29的引物。
75. 包含反義序列的核酶，所述反義序列特異識別和切割包含和 SEQIDN0:1、 5、 7、 8、 11、 13或15任何一個的核酸分子或其互補物完 全互補的核酸分子的RNA。
76. 根據權利要求75的核酶，其中所述核酶由核糖核酸組成。
77. 根據權利要求76的核酶，其中所述核糖核酸的一或多個是2， -O-甲基核糖核酸。
78. 根據權利要求75的核酶，其中所述核酶由脫氧核糖核酸和核 糖核酸的混合物構成。
79. 根據權利要求75的核酶，其中所述核酶由具有硫代磷酸酯鍵 的核酸構成。
80. 含有編碼根據權利要求75之核酶或根據權利要求59或60之 寡核苷酸的核酸序列的核酸分子。
81. 根據權利要求80的核酸分子，其中該核^A DNA或cDNA。
82. 根據權利要求80或81的核酸分子，其處于轉錄該核酸分子的 啟動子的控制之下。
83. 權利要求80的核酸分子用于制造增加骨礦質含量的藥物的用途。
84. 權利要求81的用途，其中所述藥物用于治療骨質減少。
85. 權利要求84的用途，其中所述骨質減少是由貧血狀態(tài)、類固 醇、肝素、骨髓疾病、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、特發(fā)性骨質疏松 癥、先天性骨質減少或骨質疏松癥、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、絕經 后狀態(tài)、月經稀發(fā)、閉經、妊娠、糖尿病、甲狀腺功能亢進、庫欣病、 肢端肥大癥、性腺功能減退癥、不活動或廢用、反射交感性營養(yǎng)不良綜 合征、短暫性區(qū)域骨質疏松或者骨軟化引起的。
86. 權利要求83的用途，其中所述藥物用于治療骨質疏松癥。
87. 權利要求83的用途，其中所述藥物用于治療骨折。
88. 權利要求83的用途，其中所述藥物用于治療與骨異常生長或 發(fā)育有關的發(fā)育異常。
89. 權利要求80的核酸分子用于制備和骨吸收抑制物共同給藥的 藥物的用途。
90. 權利要求89的用途，其中骨吸收抑制物選自降鉀素、雌激素、 二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三苯氧胺。
91. 藥物組合物，包含根據權利要求80的核酸分子，和可藥用載 體或稀釋劑。
92. 含有根據權利要求75的核酶的宿主細胞。
93. 含有根據權利要求80 - 82任意一項的核酸分子的載體。
94. 根據權利要求93的載體，其中該栽體是質粒、病毒、逆轉錄 轉座子或粘粒。
95. 根據權利要求94的栽體，其中所述病毒選自逆轉錄病毒、腺 病毒和腺伴隨病毒。
96. 含有根據權利要求93 - 95之任意一項的載體的宿主細胞。
97. 根據權利要求96的宿主細胞，其中所述宿主細胞被所述栽體 穩(wěn)定轉化。
98. 根據權利要求96或97的宿主細胞，其中該宿主細胞是人細胞。
99. 體外制備核酶的方法，包括提供處于啟動子轉錄控制之下的編 碼根據權利要求75之核酶的DNA，以及轉錄該DNA以產生該核酶。
100. 根據權利要求99的方法，進一步包括純化該核酶。
101. 檢測編碼能降低骨礦質含量的多肽的核酸分子的方法，包括 在高嚴緊條件下雜交權利要求1-7之任意一項的分離的核酸分子，并檢 測所述核酸分子和所述分離的核酸分子的雜交，其中所述條件包括在 55-60。C下5xSSPE、 5xDenhardt氏液和0. 5%SDS中過夜進行雜交。
102. 根據權利要求101的方法，其中所述分離的核酸分子是標記的。
103. 根據權利要求101或102的方法，其中所述分離的核酸分子 結合在固相支持物上。
104. 檢測能降低骨礦質含量的多肽的方法，包括將根據權利要求 26 — 40之任意一項的抗體在足以允許所述抗體與所述多肽結合的條件和 時間下孵育，并檢測所述結合。
105. 檢測權利要求17的多肽與抗體的結合的方法，包括將抗體和 所述多肽在足以允許所述抗體與所述多肽結合的條件和時間下孵育，并 檢測所述結合。
106. 根據權利要求104或者105的方法，其中所述抗體結合在固 相支持物上。
107. 根據權利要求104或者105的方法，其中所述抗體是標記的。
108. 根據權利要求107的方法，其中所述抗體是用選自酶、熒光 蛋白和放射性同位素的標記物標記的。
109. 轉基因動物，其生殖細胞和體細胞含有編碼能降低骨礦質含 量的蛋白質的根據權利要求1 - 7任一項的核酸分子，其中所述核酸分子 可操作地與對于該基因表達有效的啟動子相連，該基因是在胚胎階段導 入該動物或該動物祖先的，M是所述動物并非人類。
110. 權利要求109的轉基因動物，其中能降低骨礦質含量的蛋白 質是從根據權利要求8 - 10任一項的載體表達的。
111. 權利要求109或110的轉基因動物，其中能降低骨礦質含量 的蛋白質包含SEQ ID NO: 2、 6、 10、 12、 14或16的蛋白質。
112. 轉基因敲除動物，包括其生殖細胞和體細胞中編碼能降低骨 礦質含量的蛋白質的內源性核酸分子的至少一個等位基因被破壞的動 物，所述內源性核酸分子選自(a) 包含SEQ ID N0s: 1、 5、 9、 11、 13或15的核酸分子；和(b) 在高嚴緊條件下與(a)的核酸分子特異雜交的核酸分子，所述 條件包括在55-60匸下在5xSSPE、 5xDenhardt氏液和0. 5%SDS中過夜雜 交，其中與不帶有所述破壞的動物相比，所述破壞阻止了從所述等位基 因轉錄信使RNA， a是該動物并非人類。
113. 權利要求112的轉基因動物，其中所述破壞是核酸缺失、替 代或插入。
114. 權利要求110-113的轉基因動物，其中所述轉基因動物選自小鼠、大鼠、和狗。
115. 確定候選分子是否能夠增加骨礦質含量的方法，包括確定 候選分子是否抑制權利要求26的蛋白質與骨或其類似物的結合。
116. 根據權利要求115的方法，其中所述骨類似物是羥基磷灰石。
117. 用于檢測SOST基因表達的試劑盒，其包含含有核酸分子的容 器，其中所述核酸分子選自(a)含有SEQ ID NO: 1、 5、 7、 9、 11、 13 或15的核苷酸序列的核酸分子；(b)含有(a)的核普酸序列的互補序列 的核酸分子；和(c)核酸分子，其是(a)或(b)的長至少50個核苷 酸的片段。
118. 用于檢測SEQ ID NO: 2的沒有信號序列的成熟蛋白質的試劑 盒，包含含有根據權利要求26 — 40之任意一項的抗體的容器。
119. 反義寡核苷酸，其含有與根據SEQ ID NOs. 1、 5、 7、 9、 11、 13或15，或其互補序列的核酸分子雜交的核酸分子，而且其中所述寡核 苷酸抑制根據權利要求17 - 25之任意一項的蛋白質的表達。
120. 根據權利要求119的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長15 個核苷酸。
121. 根據權利要求119的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長20 個核普酸。
122. 根據權利要求119的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長50 個核苷酸。
123. 根據權利要求119 一 122的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 含有一或多種核酸類似物。
124. 根據權利要求119 - 122的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 含有一或多種核糖核酸。
125. 根據權利要求119 - 122的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 含有一或多種脫氧核糖核酸。
126. 根據權利要求119 - 122的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸 序列含有一個或多個修飾的共價鍵。
127. 根據權利要求126的反義寡核苷酸，其中所述修飾的共價鍵 選自硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、膦酸甲酯鍵、亞甲基(甲基亞胺基) 鍵、嗎啉代鍵、酰胺鍵、聚酰胺鍵、短鏈烷基糖間鏈、環(huán)烷基糖間鏈、 短鏈雜原子糖間鏈、和雜環(huán)糖間鏈。
128. 抑制細胞中編碼能降低骨礦質含量的多肽的信使RNA轉錄的 方法，所述方法包括破壞與根據權利要求1-7任意一項的核酸分子雜交 的內源性核酸分子的至少一個等位基因，其中所述破壞阻止所述等位基 因轉錄信使RNA。
129. 根據權利要求128的方法，其中所述破壞是核酸的缺失、替 4戈或插入。
130. 根據權利要求128的方法，其中所述細胞選自小鼠細胞、大 鼠細胞和狗細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的TGF-β結合蛋白類型或家族。還公開了用于篩選增加骨礦化的分子的試驗方法和利用這些分子的方法。
文檔編號C12P21/02GK101469329SQ20081009923
公開日2009年7月1日 申請日期1999年11月24日 優(yōu)先權日1998年11月27日
發(fā)明者B·W·佩珀, B·科瓦斯維克, D·G·溫克勒, D·J·格拉斯, J·T·默利甘, J·范尼斯, M·E·布倫科 申請人:達爾文發(fā)現(xiàn)有限公司