專利名稱：：一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，特別涉及一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。具體說(shuō)是以一株含油量高生長(zhǎng)快的原始小球藻為產(chǎn)油藻種，在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)，所得藻油再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今世界日益嚴(yán)峻的環(huán)境污染和能源匱乏問(wèn)題使人類正面臨前所未有的巨大挑戰(zhàn)，為此，人們開(kāi)始從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展的角度考慮，開(kāi)發(fā)可再生的碳中性燃料來(lái)取代傳統(tǒng)的石化燃料。生物柴油就是這樣一種環(huán)境友好的可再生清潔能源。生物柴油指的是動(dòng)、植物或微生物油脂經(jīng)酯化反應(yīng)后得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸烷基單酯，在世界各地特別是歐美地區(qū)有著廣泛的應(yīng)用。但是，高昂的原料價(jià)格，造成生物柴油的生產(chǎn)成本高于傳統(tǒng)的石化柴油，這成為制約生物柴油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸，因此，設(shè)法降低生物柴油的原料成本，是生物柴油產(chǎn)業(yè)突破的主要方向。目前，大豆、油菜、葵花籽等經(jīng)濟(jì)作物是生產(chǎn)生物柴油的主要原料。這種以傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)的生物能源生產(chǎn)方式不僅產(chǎn)量低而且與糧食作物爭(zhēng)奪耕地、淡水、肥料等資源，因此不能滿足生物柴油產(chǎn)業(yè)對(duì)原料油持續(xù)增長(zhǎng)的需求。微藻是一種能進(jìn)行光合作用的微生物。"微藻生物燃料"的概念在很早以前就已提出，但是迄今為止，利用微藻生產(chǎn)生物柴油成本依然高昂，無(wú)法滿足商業(yè)化的要求。主要原因在于自養(yǎng)狀態(tài)下，含油量高的藻種生長(zhǎng)緩慢，而生長(zhǎng)迅速的藻種往往含油量相對(duì)較低。為此，吳慶余課題組以一株淡水綠藻CWore^a/7ro"^6"cc)i^s為材料，率先開(kāi)展了利用異養(yǎng)微藻來(lái)生產(chǎn)生物柴油的研究。在該課題組己經(jīng)發(fā)表的論文(1)MiaoXL，WuQY.2006.Biodieselproductionfromheterotrophicmicroalgaloil.BioresourTechnol97:841-846;(2)XuH，MiaoXL.，WuQY.2006.HighqualitybiodieselproductionfrommicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters.JBiotechnol126:499-507;(3)XiufengLi，HanXu，QingyuWu，2007，Large-scalebiodieselproductionfrommicroalgaGWore^sjOrc^6^力ecoic(sthroughheterotrophiccultivationinbioreactors.BiotechnologyandBioengineering.98(4):764-771.禾口已經(jīng)申請(qǐng)專利CN1699516A、CN1837352A的內(nèi)容顯示，Cprotot/ec^Vas細(xì)胞的單位產(chǎn)量低于16g(干重)/L，含油量低于56%，如此低的微藻細(xì)胞產(chǎn)量和含油量還不能滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。它是在已有研究成果和專利技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高生物反應(yīng)器中C;r^oA^:o/^s的產(chǎn)量和含油量，在保證高含油量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)來(lái)滿足利用異養(yǎng)小球藻細(xì)胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求。本發(fā)明的特征在于篩選含油量高、生長(zhǎng)迅速的小球藻藻株，進(jìn)一步優(yōu)化該藻株異養(yǎng)發(fā)酵的條件，建立向生物反應(yīng)器中流加營(yíng)養(yǎng)物的策略和方法、控制攪拌速率、通氣量等等，最終得到的微藻細(xì)胞密度(單位產(chǎn)量)為108g(干重)/L(以下細(xì)胞密度或濃度均是千重)，細(xì)胞油脂含量為61%，均大大高于我們?cè)缦劝l(fā)表的研究數(shù)據(jù)(最高細(xì)胞密度為15.5g/L，最高含油量55.2%)[1，2，3]。相對(duì)于植物油、動(dòng)物脂肪、餐飲廢油等生物柴油原料，高達(dá)108g/L的細(xì)胞密度和61%的含油量，降低生物柴油的原料成本，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟(jì)、高效途徑。所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻作為制備生物柴油的原料，按照如下步驟進(jìn)行(1)篩選一株含油量高、生長(zhǎng)迅速的小球藻藻株；(2)將篩選到的藻株直接接種至搖瓶中作為一級(jí)種子培養(yǎng)；(3)將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)高密度發(fā)酵；(4)在一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)高密度發(fā)酵過(guò)程中流加營(yíng)養(yǎng)液、條件優(yōu)化和過(guò)程控制至細(xì)胞密度達(dá)到最佳；(5)離心收集小球藻細(xì)胞并干燥；(6)從干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂為原料，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油。所述用于異養(yǎng)高密度發(fā)酵的C/^WW力e"^fes藻株的含油量高，優(yōu)選于20%-61%之間，高含油量的藻株采用離心的方式篩選，在上清液中的藻細(xì)胞密度較小，含油量較高，將這些細(xì)胞接種于瓊脂平板中，劃線分離，形成單個(gè)藻落；為了篩選到生長(zhǎng)速度快的藻株，篩選包括一步從平板中挑取大的、單克隆菌落的步驟，發(fā)酵罐中細(xì)胞密度優(yōu)選于15-108g/L之間；篩選得到到一株生長(zhǎng)速度快、含油量高的藻株CproZJo"eco/c/es077。。本發(fā)明中，一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基都補(bǔ)加含碳水化合物，一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液中補(bǔ)加的碳水化合物包括但不限于葡萄糖以及其他單糖，二糖和多糖等，濃度優(yōu)選于0.01-100g/L之間。這些碳水化合物包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麥淀粉水解物和高粱汁。本發(fā)明中，一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)接種量?jī)?yōu)選于0.01%-50%之間。一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)動(dòng)或攪拌速度優(yōu)選于5-1000轉(zhuǎn)/分之間。一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)溶氧一般保持在5%以上，優(yōu)選20%以上。一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)流加的有機(jī)氮源包括但不限于甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物和玉米漿。本發(fā)明中，一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)pH值優(yōu)選6.0-8.0之間，通過(guò)流加堿性溶液來(lái)降低培養(yǎng)基的酸性，優(yōu)選氫氧化鉀為堿性溶液。一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)溫度控制優(yōu)選20-45"C之間。本發(fā)明中，一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞干重優(yōu)選20-108克/升之間，油脂含量?jī)?yōu)選40%-61%之間。本發(fā)明中涉及的其他對(duì)象、技術(shù)流程、優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)將會(huì)出現(xiàn)在下文的詳細(xì)描述中。本發(fā)明方法涉及的技術(shù)流程詳細(xì)描述如下(1)篩選生長(zhǎng)速率快，含油量髙的藻株優(yōu)選離心率為8000~12000g，30min，4""C對(duì)異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻細(xì)胞進(jìn)行兩次離心。上清中的藻細(xì)胞密度較小，含油量較高。接種該細(xì)胞于瓊脂平板中，劃線分離，經(jīng)過(guò)240至360小時(shí)的培養(yǎng)形成單個(gè)菌落，平板中體積相對(duì)較大的單菌落被分別接種至搖瓶中液體培養(yǎng)，分別考察比較各搖瓶中細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及含油量。從細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及含油量最高的一組培養(yǎng)中得到一株含油量高、生長(zhǎng)速度快的藻株。藻細(xì)胞在瓊脂平板上劃線分離后的培養(yǎng)使用了添加30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方與下一部分種子培養(yǎng)和高密度發(fā)酵培養(yǎng)相同。倒制平板時(shí)，添加1.5%的瓊脂粉形成固體培養(yǎng)基，平板培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)箱的溫度控制在28士0.5nC。(2)在一級(jí)反應(yīng)器中進(jìn)行藻細(xì)胞種子培養(yǎng)將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶中作種子培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下KH2P040.7g丄-1,K2HP。40.3g丄-',MgS04'7H200.3g丄"，F(xiàn)eS04.7H203mg丄"，甘氨酸0.1g丄"，維生素B1O.Olmg丄"，A5微量元素液lml丄'1。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2MoCV2H20，ZnS04'7H20，和MnCl2'4H20CuS04'5H20等組分。優(yōu)化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄陽(yáng)1，ZnS04.7H200.222g丄"，MnCl2'4H201.81g丄國(guó)1,CuS04'5H200.074g丄"。在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶中的培養(yǎng)條件對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，包括但不限于如葡萄糖濃度、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速、光強(qiáng)等。生長(zhǎng)條件如下將5至50g/L的葡萄糖和1至10g/L市售的酵母提取物分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。其中，采用30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最優(yōu)，在20-45°C的范圍內(nèi)，28T為最佳培養(yǎng)溫度。搖瓶速度，200轉(zhuǎn)/分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最佳。培養(yǎng)過(guò)程中還采用了5ymol.m-2s-1的弱光照射(3)種子細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)高密度發(fā)酵，將經(jīng)過(guò)168小時(shí)培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至二級(jí)生物反應(yīng)器中進(jìn)行過(guò)程控制與優(yōu)化，該步反應(yīng)優(yōu)選在5-11,000L的發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。通過(guò)調(diào)整和控制接種量、底物流加、溶氧、攪拌速率、和溫度、pH值等參數(shù)對(duì)異養(yǎng)小球藻發(fā)酵工藝進(jìn)行了反復(fù)優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，基于溶氧反饋的有機(jī)碳源流加補(bǔ)給對(duì)生物量和脂肪的積累至關(guān)重要。在培養(yǎng)基中分別嘗試流加葡萄糖、果糖、蔗糖，玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉水解物以及高粱汁、含糖廢水等碳水化合物溶液，然后通過(guò)在線監(jiān)測(cè)耗氧量的變化考察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況。發(fā)酵工藝優(yōu)化表明由攪拌速度和通氣量變化引起發(fā)酵液溶氧(DO)波動(dòng)對(duì)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)極為重要。通過(guò)反復(fù)的發(fā)酵條件優(yōu)化和過(guò)程控制實(shí)驗(yàn)，異養(yǎng)小球藻的高密度發(fā)酵條件設(shè)定如下接種量為25%;溫度28±0,5"C;通氣速率180L/h;通過(guò)補(bǔ)加10g/L的KOH，將pH值控制在6.3±0.1的范圍之內(nèi)；通過(guò)補(bǔ)加500g/L的葡萄糖維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在5-18g/L的范圍內(nèi)波動(dòng)；以0.75g/l/h的速度連續(xù)補(bǔ)加有機(jī)氮源(巿售酵母提取物)，培養(yǎng)88小時(shí)以后，通過(guò)逐步提高攪拌速率，使發(fā)酵液中的溶氧飽和度維持在20%以上；在128小時(shí)以后同時(shí)補(bǔ)加氮源和葡萄糖；213小時(shí)時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到108g/L,油含量達(dá)到細(xì)胞干重的61%，終止發(fā)酵。(4)收集藻細(xì)胞細(xì)胞濃度優(yōu)選20-108g/L，通過(guò)取樣測(cè)定細(xì)胞濃度以后，將藻細(xì)胞從發(fā)酵液中分離出來(lái)。該過(guò)程包括但不限于過(guò)濾和離心工藝。分離得到的藻細(xì)胞干粉或者其他固體形態(tài)。(5)從干燥的藻細(xì)胞中提取油脂從干燥的藻細(xì)胞中提取油脂的方法包括但不限于索式抽提法。采用索式抽提法，以正己垸為標(biāo)準(zhǔn)萃取溶劑，從干藻粉中提取油脂。正己烷反復(fù)淋洗，直至細(xì)胞中不再殘留脂肪，然后減壓去除溶劑。(6)酯化反應(yīng)制備生物柴油從藻細(xì)胞中提取的油脂制備生物柴油可采用酯化反應(yīng)。脂肪酸到脂肪酸酯的轉(zhuǎn)化可通過(guò)強(qiáng)酸，如濃硫酸催化，或酶催化。脂肪酶(TriacylglycerolAcylhydrolase，EC3.1.1.3)在油/水界面催化水解長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯，有效催化酯化和酯交換反應(yīng)。脂肪酶從C朋力'^印.99-725中提取的，催化活力可達(dá)12000Ug人最佳甲酯化條件的組合為pH值7.0，加入2.5倍體積的正己烷溶劑，60%固定化脂肪酶(相對(duì)于油的質(zhì)量，酶活12000Ug—0、10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水，38°C、160rpm恒溫?fù)u床中溫育，醇油摩爾比3:1，分三次加入反應(yīng)體系。用脂肪酶催化生成的脂肪酸甲酯為生物柴油的主要成分。本發(fā)明的有意效果是本方法以篩選含油量高、生長(zhǎng)迅速的小球藻藻株，進(jìn)一步優(yōu)化該藻株異養(yǎng)發(fā)酵的條件，采用向生物反應(yīng)器中流加營(yíng)養(yǎng)物的方式、控制攪拌速率、通氣量等等，最終得到的微藻細(xì)胞密度(單位產(chǎn)量)為108g(干重)/L，細(xì)胞油脂含量為61%的高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻細(xì)胞，降低生物柴油的原料成本，滿足利用異養(yǎng)小球藻細(xì)胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟(jì)、高效途徑。定義除非特別說(shuō)明，本文中涉及的名詞定義如下.-生物柴油從可再生生物脂質(zhì)資源，如植物油或動(dòng)物脂中得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸烷基單酯。"生物"表示相對(duì)于石油基柴油來(lái)言，它是一種可再生的生物資源;"柴油"指的是它可用于柴油發(fā)動(dòng)機(jī)或像柴油一樣作為燃料使用。烷基單酯/單酯一般是指化學(xué)組成為脂肪酸酯的生物柴油。例如，脂肪酸烷基單酯生物柴油是由油酸，亞油酸，硬脂酸，棕櫚油酸以及其他脂肪酸等成份組成的。藻類指一類水生的光合作用生物，包括單細(xì)胞藻和多細(xì)胞大型藻類如海帶、紫菜等。藻類曾一度被劃歸為植物，但由于它缺乏根、莖、葉和胚胎等植物特征，因此目前被單獨(dú)分為一類。微藻個(gè)體非常微小的藻類，一般指需借助于顯微鏡才能觀察和識(shí)別的單細(xì)胞水生藻。異養(yǎng)生物體以有機(jī)化合物作為碳源和氮源的營(yíng)養(yǎng)方式。轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)通過(guò)引入含有羥基的化合物，使烷氧基發(fā)生交換的反應(yīng)。長(zhǎng)鏈脂肪酸烷基單酯/脂肪酸甲酯甲醇和脂肪酸加成并脫去一分子水生成的一類有機(jī)化合物。生物反應(yīng)器是一種用于生物細(xì)胞培養(yǎng)或涉及生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程并具有適當(dāng)環(huán)境條件的容器或設(shè)備(包括培養(yǎng)瓶、恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶和發(fā)酵罐等)。異養(yǎng)培養(yǎng)/發(fā)酵微生物細(xì)胞在耗氧條件下利用葡萄糖或其他有機(jī)碳源生長(zhǎng)的過(guò)程。酵母發(fā)酵在厭氧條件下利用酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精的過(guò)程。燃料乙醇以微生物發(fā)酵得到的酒精為原料制備的一種生物燃料。油/脂肪一類具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的天然碳?xì)浠衔铩Ｔ诒景l(fā)明中，指的是脂肪酸及其衍生物，包括甘油單酯、二酯、三酯、磷脂以及其他的脂溶性甾醇類物質(zhì)(如膽固醇等)尼羅紅是一種親脂的熒光染料，在富含脂肪的環(huán)境中能發(fā)出金黃色熒光。熱解在缺氧條件下，有機(jī)質(zhì)高溫化學(xué)降解的過(guò)程。單菌落/藻落在瓊脂平板上由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂堆積形成的菌落或藻落。恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶是一種溫度、濕度等環(huán)境條件可控，供微生物生長(zhǎng)或進(jìn)行其他生化反應(yīng)的設(shè)備。有機(jī)碳是一族來(lái)自于有機(jī)體的含碳化合物(如蔗糖、脂肪等)，它區(qū)別于C02等無(wú)機(jī)碳源。有機(jī)氮是指來(lái)自于有機(jī)體的含氮化合物，如蛋白質(zhì)、尿素等。高梁禾本科蜀黍?qū)僖荒晟叽蟛荼局参?。甜高梁蔗糖含量一般?0%以上的高粱品種。木薯一種根部富含淀粉的灌木狀多年生作物。索式抽提器是一種半自動(dòng)的溶劑萃取裝置，在本發(fā)明中用于從藻細(xì)胞中分離油脂。熱值單位質(zhì)量的燃料完全燃燒所釋放的熱量。單糖不能被進(jìn)一步水解，分子式一般為CnH2n0n的碳水化合物，如葡萄糖、果糖、木糖等。二糖由兩個(gè)單糖單元構(gòu)成的碳水化合物。多糖由兩個(gè)以上的單糖單元構(gòu)成的碳水化合物。水解物經(jīng)水解反應(yīng)得到的化合物，在本發(fā)明中，一般指纖維素、淀粉或其他多糖物質(zhì)經(jīng)水解后得到的單糖或短鏈寡糖混合物。圖1為利用異養(yǎng)小球藻進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法及步驟。圖2為在5L生物反應(yīng)器中異養(yǎng)微藻高密度發(fā)酵的細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗曲線。圖3為熒光顯微鏡下尼羅紅染色細(xì)胞熒光強(qiáng)度測(cè)定相對(duì)油脂含量。圖4為轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中隨反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物組成變化。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。它是在已有研究成果和專利技術(shù)的基礎(chǔ)上，按照?qǐng)D1所示的利用異養(yǎng)小球藻進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法及步驟，進(jìn)一步提高生物反應(yīng)器中C./^o幻Meco^/es的產(chǎn)量和含油量，利用高密度培養(yǎng)技術(shù)，篩選含油量高、生長(zhǎng)迅速的小球藻藻株C/ro"We②ic/Mw07/。匸此菌種不是新的菌種，利用現(xiàn)有菌種培養(yǎng)得到，因此不需要保存)。在保證高含油量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)來(lái)滿足利用異養(yǎng)小球藻細(xì)胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求。下面列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例原始小球藻(GWorW^3;ro""ecoic^)出發(fā)藻株購(gòu)自美國(guó)Texas大學(xué)藻種中心，自1990年起，清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系微藻生物能源實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)該藻種用于生物能源的研究，其基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下-KH2P040.7g/L，K2HP040.3g/L，MgS04'7H200.3g/L，F(xiàn)eS04-7H203mg/L，甘氨酸0.1g/L，維生素B^.01mg/L，A5微量元素液lml/L。其中A5微量元素液包含H3B03，Na2Mo(V2H20，ZnSCV7H20，和MnCl2-4H20,CuS04.5H20等組分。優(yōu)化的A5微量元素液包含H3B032.86g丄"，Na2Mo04.2H200.039g丄'1，ZnS04'7H200.222g丄-1,MnCl2'4H201.81g丄—'，CuSO,5H200.074g丄"。通過(guò)步驟l中所描述的定向篩選技術(shù)，得到一株生長(zhǎng)迅速、含油量高的藻株Cjarotoz^ecoic/ess/。77。。與出發(fā)藻株相比,C;zrotot力eccu'ofe51s/(9Z/(密度低，色澤金黃，最大生物量可達(dá)108克/升(如圖2所示)，含油量高達(dá)61%。相比之下，在我們過(guò)去已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)中，出發(fā)藻株的最高細(xì)胞密度為15.5克/升，最高含油量為55.2%。表1顯示了以C/^o力ot力ecojWes邵(W。高密度發(fā)酵制備的生物柴油與原初出發(fā)藻株一般發(fā)酵制備的生物柴油在成分與含量上的差別。將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500ml搖瓶中作一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分。在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入30g/L的葡萄糖和4g/L市售的酵母提取物。培養(yǎng)至168小時(shí)(細(xì)胞密度約為15g/L)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期。培養(yǎng)過(guò)程中還釆用了5umol.m-2s-l的弱光照射。在一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)高密度發(fā)酵過(guò)程中，在恒溫振蕩培養(yǎng)搖瓶中考察了不同培養(yǎng)條件如葡萄糖濃度、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速等對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。生長(zhǎng)條件優(yōu)化過(guò)程如下將濃度為5，10，15,20，25，30，35，40，45，50g/L的葡萄糖和濃度為l，2，3，4，5，6，7，8，9,10g/L的市售酵母提取物分別加入到上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為20、25、28、30、33、35、4CTC，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行考察培養(yǎng)，其中優(yōu)選后，采用在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30gZL葡萄糖和4g/L市售酵母提取物，培養(yǎng)溫度為28。C，搖瓶速度為200轉(zhuǎn)/分時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)最佳。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞被接種至發(fā)酵罐中繼續(xù)進(jìn)行二級(jí)高密度培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)在5L攪拌式生物反應(yīng)器(MINITORS，瑞士)中進(jìn)行，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原始小球藻細(xì)胞接種至加入30g/L葡萄糖和4g/L市售酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為25%(V/V)。高密度培養(yǎng)條件如下28±0.5"C，通氣速率跪/h，pH值6.3±0.1，在線監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐中的溶氧變化，一旦溶氧低于飽和度的20%以下時(shí)，通過(guò)逐步提高攪拌速率，同時(shí)連續(xù)添加葡萄糖，葡萄糖濃度控制在5-18g/L范圍內(nèi)，使發(fā)酵液中的溶氧飽和度維持在20%以上，在128小時(shí)以后同時(shí)補(bǔ)加市售酵母提取物和葡萄糖，補(bǔ)加氮源速度為0.75g/l/h，通過(guò)在5L發(fā)酵罐中采用補(bǔ)料流加和過(guò)程控制的方式建立高密度培養(yǎng)策略，同時(shí)監(jiān)控發(fā)酵罐中葡萄糖、甘氨酸、磷濃度以及pH值和溶氧的變化(如圖3所示)。發(fā)酵完成后，從發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，并真空干燥。高密度發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞密度通過(guò)定時(shí)測(cè)定光密度值(0D54。n)來(lái)估算。005.,。與細(xì)胞干重的線性關(guān)系可以用以下公式表示y=0.4155x,(R2二0.9933，P<0.05)，其中y表示細(xì)胞密度(克/升)，x表示540nm處光密度值。發(fā)酵完成后，發(fā)酵液于4"C以10000轉(zhuǎn)/分的速度離心2分鐘，收集沉淀，真空干燥，稱重，共得到108克/升的干藻粉。采用索式抽提法，利用半自動(dòng)的溶劑萃取裝置一索式抽提器，以正己烷為標(biāo)準(zhǔn)萃取溶劑，從干藻粉中提取油脂。在索式抽提器中，用正己烷反復(fù)淋洗細(xì)胞，直至細(xì)胞中不再殘留脂肪。異養(yǎng)藻油脂的分子量計(jì)算公式如下分子量(M)=56.1X1000X3/(SV-AV)，式中SV(SaponificationValue)代表微藻油脂的皂化值，AV(AcidValue)代表微藻油脂的酸值，計(jì)算得到的微藻油脂的分子量是無(wú)量綱數(shù)值。經(jīng)過(guò)溶劑減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾后對(duì)索式抽提法獲得的油脂干燥后進(jìn)行稱中，以油脂凈中除以細(xì)胞干重，得細(xì)胞千重的油脂含量為61%(wV)。酯化反應(yīng)由來(lái)源于Ca/7力'^g邵.效-7M的脂肪酶催化完成，醇油摩爾比3:1，反應(yīng)在180轉(zhuǎn)/分的恒溫?fù)u床中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，混合反應(yīng)體系分成上下兩層，分離位于上層的生物柴油，并置于5CTC的溫水中淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑，得到純凈的生物柴油。為了考察不同操作條件對(duì)生物柴油產(chǎn)率的影響，使反應(yīng)產(chǎn)物滿足美國(guó)生物柴油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(ASTM6751)中對(duì)甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等含量的要求，我們對(duì)各種操作變量進(jìn)行了分析。這些變量包括反應(yīng)體系中脂肪酶的用量、甲醇用量、甲醇流加速度、脂肪含量、有機(jī)溶劑用量、水含量等參數(shù)以及pH值和反應(yīng)時(shí)間等。通過(guò)利用氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)可分析體系中甘油三酯、二酯、一酯、甲醇和甘油等的含量(如圖4所示)，據(jù)此可計(jì)算從油脂到脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率。采用DSQGC(Thermo,USA，VARIANVF-5ms毛細(xì)管柱30M*0.25麗)氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀進(jìn)行分析。流速設(shè)定為10mlmin—1。升溫程序先升溫到70。C，保持2min;然后以10°Cmin—1的速度將溫度上升到300°C，保持20min。注射口溫度250°C，分流比為30:1。在上述條件下，經(jīng)過(guò)213小時(shí)的高密度培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到108克/升，油含量為細(xì)胞干重的61%。在12小時(shí)的酯化反應(yīng)過(guò)程中，98.15%的微藻油脂轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(生物柴油)，生物柴油的產(chǎn)率為64.66克Z升。共檢測(cè)到9種脂肪酸甲酯，其中含量最高的是油酸甲酯、亞油酸甲酯和棕櫚酸甲酯，其含量占全部生物柴油的80%以上。主要結(jié)果如表l所示。表l利用異養(yǎng)小球藻制備的生物柴油的組成成分與含量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，該方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻作為制備生物柴油的原料，具體步驟包括(1)篩選一株生長(zhǎng)速率快，含油量高的小球藻藻株；(2)將篩選得到的藻株接種至含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶或小型生物反應(yīng)器中進(jìn)行種子培養(yǎng)，還添加碳水化合物和有機(jī)氮源為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)；(3)將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至含有營(yíng)養(yǎng)液的發(fā)酵罐或其他生物反應(yīng)器中進(jìn)行藻細(xì)胞高密度發(fā)酵即二級(jí)培養(yǎng)，發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中細(xì)胞密度介于15-120g/L之間；(4)在一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)高密度發(fā)酵過(guò)程中，向發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中流加營(yíng)養(yǎng)液并通過(guò)其他條件控制至細(xì)胞密度達(dá)到最佳；(5)離心收集小球藻細(xì)胞并干燥；(6)從干藻粉中抽提藻油；(7)以所得油脂為原料，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)制備生物柴油。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述篩選一株生長(zhǎng)速率快，含油量高的小球藻藻株，還包括使C.prato^ecoW^油脂含量達(dá)到細(xì)胞干重61%的異養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)；由于高含油量的藻株密度小，離心后仍懸浮于上清液中，而平板中，體積大的單菌落具有較快的生長(zhǎng)速率，因此，篩選得到的藻株是由離心取上清和篩選大的單菌落的方式得到的，所得藻株被命名為C.prato^eco/(5fe07川。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，將篩選得到的藻株C.prato^ecoW^0770接種至含有碳水化合物濃度為0.01-100g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的搖瓶或小型生物反應(yīng)器中作種子培養(yǎng)，按接種量為0.01%-50%，搖瓶轉(zhuǎn)動(dòng)或攪拌速度為5-1000轉(zhuǎn)/分，溶氧保持在5%20%或20%以上；在恒溫、攪拌培養(yǎng)搖瓶或小型生物反應(yīng)器中間歇或連續(xù)補(bǔ)加入濃度為550g/L的碳水化合物和110g/L的有機(jī)氮源，通過(guò)流加堿性溶液來(lái)降低培養(yǎng)基的酸性，使pH值為6-8，溫度控制在20-45。C之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述種子細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至二級(jí)發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度發(fā)酵與過(guò)程控制，其接種量介于總體積的0.01%-50%之間，向發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中流加營(yíng)養(yǎng)液的方法還包括間歇或連續(xù)流加操作，發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中原有營(yíng)養(yǎng)液或添加營(yíng)養(yǎng)液含有的碳水化合物包括葡萄糖或其他單糖、二糖或多糖，碳水化合物來(lái)源包括葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、小麥淀粉水解物和高粱汁；碳水化合物濃度控制在0.01-100克/升之間；發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中原有的營(yíng)養(yǎng)液或添加的營(yíng)養(yǎng)液含有的有機(jī)氮源包括甘氨酸、酵母粉、市售酵母提取物或玉米漿；高密度發(fā)酵方法還包括攪拌操作和通氣，攪拌速率控制在5-1000轉(zhuǎn)/分之間，通氣操作保持培養(yǎng)基中溶氧(DO)值保持在5%20%或20%以上；所述高密度發(fā)酵方法還包括向發(fā)酵罐中流加堿液用以維持體系pH值在6.0-8.0之間，堿液包括氫氧化鉀及其他強(qiáng)堿性化合物；發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵的溫度控制在20-45'C之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述酯化反應(yīng)制備生物柴油，首先采用索式抽提法，以正己烷或氯仿為標(biāo)準(zhǔn)萃取溶劑，從發(fā)酵液中分離收集的小球藻細(xì)胞干粉中提取藻粉油脂，然后以酯交換反應(yīng)在藻粉油脂中加入醇油摩爾比26:1的甲醇，分三次加入反應(yīng)體系，在脂肪酶TriacylglycerolAcylhydrolase,EC3丄1.3的有效催化酯化作用下，加熱至30。C90。C，160rpm恒溫?fù)u床中溫育，反應(yīng)生成的產(chǎn)物，經(jīng)石油醚及水洗滌，離心取有機(jī)相，將有機(jī)溶劑蒸發(fā)、干燥后獲得生物柴油，并分離出副產(chǎn)品甘油。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)和高密度發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液含有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下KH2P040.7g丄"，K2HP040.3g丄"，MgS04-7H200.3g丄—1,FeS04'7H203mg丄.1，甘氨酸O.lg丄"，維生素BlO.Olmg丄-1，A5微量元素液lml丄"；其中A5微量元素液的組成為H3B032.86g丄"，Na2Mo04'2H200.039g丄-1,ZnS04-7H200.222g丄隱1,MnCl2-4H201.81g丄"，CuS04'5H200.074g丄1.全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了屬于可再生生物能源領(lǐng)域的一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法。該方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻為原料，主要通過(guò)高生長(zhǎng)速率與高油脂含量藻種的篩選、直接接種至搖瓶中作為一級(jí)種子培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行條件優(yōu)化與過(guò)程控制，并流加含有碳水化合物的培養(yǎng)液為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，使達(dá)到108g/L、油脂含量達(dá)到61％的高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻細(xì)胞，經(jīng)過(guò)分離、收集并干燥、抽提藻油，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油；本發(fā)明降低生物柴油的原料成本，滿足利用異養(yǎng)小球藻細(xì)胞生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用要求，使本技術(shù)成為一條生物柴油原料油脂制備的經(jīng)濟(jì)、高效途徑。文檔編號(hào)C12P7/64GK101230364SQ20081010087公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日發(fā)明者吳慶余,周文廣,偉熊申請(qǐng)人:清華大學(xué)