專利名稱：一種制備含釩肽的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可供食品和藥品加工用的生物性原料的制備方法，特別是含有機(jī)釩的 肽的制備方法；本發(fā)明還涉及按該方法制備的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
釩是人類必需微量元素之一。無(wú)論是無(wú)機(jī)釩、有機(jī)釩，生物轉(zhuǎn)化釩，在安全限量 下，只要能吸收，就能產(chǎn)生醫(yī)療保健作用。生物體對(duì)無(wú)機(jī)釩的吸收率很低，其陽(yáng)離子最大吸收率為10%，陰離子吸收率僅 為O.Ol—O. 1%。同時(shí)，無(wú)機(jī)釩毒副作用大，人體治療有效量是動(dòng)物試驗(yàn)中毒量的 100-1000倍，因此目前已知的無(wú)機(jī)釩不能在臨床應(yīng)用。較之無(wú)機(jī)釩，有機(jī)釩生物活性高，毒性低。而與蛋白質(zhì)自然融合的生物態(tài)釩對(duì)人體沒(méi)有毒性。例如海參是地球上極少數(shù)富集釩的食物之一，其灰分含釩量高達(dá)15%，但不曾有人因食用海參而中毒。 因此，制備生物態(tài)釩供臨床應(yīng)用是一種安全有效的途徑。本申請(qǐng)人的200710302099.0號(hào)專利申請(qǐng)記載了一種制備富釩大豆、富釩花生 等含釩高蛋白食品材料的方法，解決了為人體安全補(bǔ)充釩元素的問(wèn)題。然而，食 物蛋白必須先由胃和小腸內(nèi)的多種酶分解后才能被人體吸收。過(guò)去曾認(rèn)為氨基酸是蛋 白質(zhì)分解后的主要吸收形式。當(dāng)代實(shí)驗(yàn)研究表明，人體對(duì)氮物質(zhì)的吸收存在著氨基酸 吸收和肽吸收兩種相互獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。與氨基酸運(yùn)輸體系相比，肽吸收更迅速，能 耗低，效率高，氨基酸組成更趨于平衡，且各種肽之間轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性和抑制性。而且 肽分子可與包括釩在內(nèi)的金屬離子形成螯合物，具有可溶性，利于機(jī)體吸收。因此，將鈧元素與小肽螯合制作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，是為人體補(bǔ)充釩元素的優(yōu)選形式。在當(dāng)代，雖 然按此機(jī)制制備的多種金屬元素的肽螯合物(SPC)作為第四代微量元素制劑已廣泛 應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)，但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有含釩多肽和含釩小肽產(chǎn)品的記載。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，開(kāi)拓上述技術(shù)領(lǐng)域，提供一種可大規(guī)模生產(chǎn)富釩生物制品的方法，其產(chǎn)品有機(jī)釩含量高，食用安全，吸收率高，生物效價(jià)高。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下原材料的選用可選用任何適合人類食用的、蛋白質(zhì)含量豐富的植物種子或植物 的根、莖、葉作為原材料。其中優(yōu)選大豆、花生及榨出油脂后的大豆粕、花生粕，更優(yōu)選按申請(qǐng)?zhí)枮?00710302099.0的中國(guó)專利申請(qǐng)方法制備的富釩大豆和花生及 其脫脂后的富釩大豆粕和富釩花生粕。在對(duì)所選用的原材料進(jìn)行必要的清洗、除雜等初加工后，按"酸性水溶液洗滌一 蒸煮一添加釩化合物一發(fā)酵一肽與釩酸鹽螯合"工藝步驟進(jìn)行加工。步驟一 洗滌對(duì)所選用的原料先以酸性水溶液沖洗，再用清水沖洗。所用酸性水溶液使用可食 用酸配制，適宜的酸堿度為pH3.0-7.5。所用酸材料的品種會(huì)影響最終產(chǎn)品的風(fēng)味， 因此可根據(jù)需要選用不同品種的食用酸材料配制酸性水溶液。其中，擰檬酸、蘋(píng)果酸、 酒石酸、醋酸都是適用品種。步驟二蒸煮將洗滌后的物料進(jìn)行蒸煮，適宜的蒸煮溫度為100 — 125T:，蒸煮時(shí)間為20 — 60 分鐘。蒸煮后冷卻至室溫備用。作為蒸煮步驟的優(yōu)化方法，在蒸煮前或蒸煮后的物料中添加適量其他食品原料， 用以調(diào)節(jié)最終產(chǎn)品的風(fēng)味。步驟三加釩對(duì)待發(fā)酵物料噴灑釩化合物水溶液。 步驟四發(fā)酵(1) 使用發(fā)酵促進(jìn)劑將大豆肽加水溶解，噴灑于待發(fā)酵物料上，作發(fā)酵促進(jìn)劑。(2) 接種發(fā)酵菌株發(fā)酵使用的發(fā)酵菌可以是任何適于蛋白質(zhì)水解的發(fā)酵菌種，其中優(yōu)選芽胞桿菌CAU208。將發(fā)酵菌株接種于待發(fā)酵物料中，在20 — 4(TC溫度中培 養(yǎng)6 — 72小時(shí)，停止發(fā)酵，滅菌。(3) 制備含有釩元素的肽類中間產(chǎn)品物料停止發(fā)酵后，清洗，干燥，粉碎， 得粗制的含釩多肽粉；將粗制的含釩多肽粉加水磨漿，除渣，分離去除未水解蛋白， 得液態(tài)富釩多肽；將液態(tài)富釩多肽濃縮，超濾，除去大分子肽，得液態(tài)富釩小肽； 將液態(tài)富釩多肽濃縮，干燥，得固態(tài)富釩多肽；將液態(tài)富釩小肽濃縮，干燥，得固態(tài)富釩小肽。上述工藝步驟二至五所體現(xiàn)的發(fā)酵方法為固態(tài)發(fā)酵法；本發(fā)明還可以使用液態(tài)發(fā) 酵法，其具體工藝步驟為，將洗滌后的物料加水粉碎成漿液后進(jìn)行蒸煮，之后直接添 加釩化合物，攪拌使其溶解，再將大豆肽加入，接種發(fā)酵菌株，在20 — 40。C溫度中 培養(yǎng)6 — 72小時(shí)，停止發(fā)酵，滅菌，干燥，粉碎，得粗制的含釩多肽粉?；?qū)l(fā)酵 后的液態(tài)物料磨漿，除渣，分離去除未水解蛋白，得液態(tài)富釩多肽，進(jìn)一歩作濃 縮、干燥處理，得固態(tài)富釩多肽。步驟五螯合經(jīng)步驟四發(fā)酵所得的任何一種中間產(chǎn)品，包括液態(tài)富釩多肽、固態(tài)富釩多肽、 液態(tài)富釩小肽、固態(tài)富釩小肽以及粗制的含釩多肽粉，均可與釩酸鹽水溶液螯合，制 得含釩量更高的富釩肽制品。其具體工藝方法為，以釩酸鹽溶液與步驟四所得的液態(tài)含肽中間產(chǎn)品混合，調(diào)節(jié) 成釩肽質(zhì)量比為1:2-4的水溶液，加熱，恒溫，攪拌，可得液態(tài)含釩量更高的富釩肽 制品；進(jìn)一步作濃縮、干燥處理，可得固態(tài)含釩量更高的富釩肽制品，包括含釩量 更高的液態(tài)富釩多肽、固態(tài)富釩多肽、液態(tài)富釩小肽、固態(tài)富釩小肽。對(duì)歩驟四所 得的固態(tài)中間產(chǎn)品，則先加水磨漿，再作處理。按本發(fā)明上述方法制備的含釩肽產(chǎn)品，以干重計(jì)算，其中肽含量>60%，釩元素 含量^100mg/kg。可用于制作營(yíng)養(yǎng)食品、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、藥品等。作為上述發(fā)酵工藝的優(yōu)化方法，根據(jù)低等生物具有良好釩富集能力的特性，對(duì)發(fā) 酵菌種在接種前先行誘變選育，在誘變過(guò)程中同時(shí)使用含釩培養(yǎng)基。誘變培育方法為 紫外線誘變或亞硝基胍誘變，或同時(shí)進(jìn)行紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變培育。此方法能 制得高活力富釩發(fā)酵菌種，以提高產(chǎn)品含釩量和含肽量，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成 本。其誘變培養(yǎng)方法如下(l)配制含釩培養(yǎng)基添加適量釩化合物分別配制激活培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、 分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等四種培養(yǎng)基，在不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)使用。① 激活培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、釩化合物、大豆肽和水配制，用于激活被培養(yǎng)微生物的釩耐受特性。② 種子培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、釩化合物、豆粕粉、 大豆肽和水配制，用于馴化被培養(yǎng)微生物的釩富集特性。③ 分離培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、脫脂奶粉、瓊脂、釩化合物、大豆肽和水配制，用于從被培養(yǎng)微生物中分離有應(yīng)用價(jià)值的菌株。④發(fā)酵培養(yǎng)基以豆粕粉、蛋白胨、糖蜜、釩化合物、大豆肽和水配制，用于測(cè) 定菌株的蛋白水解力和釩富集能力。(2) 發(fā)酵菌種誘變方法紫外線誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)單細(xì)胞菌懸液活菌數(shù)至106-1(f個(gè)/ml，液層厚度0. 2-0. 4cm，以紫外線燈照射誘變。亞硝基胍誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)約36小時(shí)，調(diào)節(jié)活菌數(shù)為105-1()8個(gè)/ml，亞硝基胍終質(zhì)量濃度為0. 8-1.2mg/ml， 3(TC水浴處理30min。紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)約36小時(shí)， 調(diào)節(jié)活菌數(shù)為107-109個(gè)/1111，亞硝基胍終質(zhì)量濃度為0.8-1.2mg/ml， 30。C水浴處理30min,取亞硝基胍處理后的液層厚度0.2-0.4cm，再行紫外線燈照射誘變。(3) 篩選菌種初篩紫外線誘變后初篩得到正變菌株；亞硝基胍誘變后初篩得到正變菌株。 復(fù)篩將初篩得到的正變菌株，接入100ml/250ml的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36-60h，測(cè)定蛋白質(zhì)水解液的水解度，復(fù)篩，得較穩(wěn)定的正變菌株，在分離培養(yǎng)基里 培養(yǎng)后，測(cè)定分離培養(yǎng)基里的透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出比值大的菌株， 經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)， 一定發(fā)酵周期(36-60h)后測(cè)定發(fā)酵液水 解度，得較穩(wěn)定的正變菌株，分成兩組2次復(fù)篩， 一組進(jìn)行紫外線處理， 一組進(jìn)行亞 硝基胍處理，挑選其中性能良好且穩(wěn)定的菌株同時(shí)進(jìn)行紫外線與亞硝基胍誘變，得穩(wěn) 定性優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，將高產(chǎn)菌株接種到激活培養(yǎng)基上作為第1代，以后每隔5天傳 代1次，共傳10代，將每一代搖瓶發(fā)酵(250ml三角瓶裝液100ml)，測(cè)定發(fā)酵液的 水解度，選定穩(wěn)定性好、高產(chǎn)性好、不發(fā)生突變回復(fù)的菌株為保留菌株，即高活力富 釩發(fā)酵菌株。按上述方法制備的高活力富釩發(fā)酵菌株遺傳性能穩(wěn)定，釩元素含量可達(dá)》 200mg/kg(干重)，比母本菌株水解度提高5-8%，水解力提高35-45%，縮短發(fā)酵周期 10-12小時(shí)，生產(chǎn)成本降低15-25%。按上述方法制備的高活力富釩發(fā)酵菌株遺傳性能穩(wěn)定，釩元素含量可達(dá)》 200mg/kg(干重)，比母本菌株水解度提高5-8%，水解力提高35-45%，縮短發(fā)酵周期 10-12小時(shí)，生產(chǎn)成本降低15-25%。上述發(fā)酵菌誘變選育的工藝流程、時(shí)間參數(shù)、溫度參數(shù)等，可根據(jù)不同的發(fā)酵菌 種進(jìn)行調(diào)整。上述發(fā)酵菌誘變培育法也可替換為原生質(zhì)體融合法或基因工程法，也可用誘變 法、原生質(zhì)體融合法、基因工程法三種方法的任意組合培育應(yīng)用。本發(fā)明采用微生物法發(fā)酵產(chǎn)肽，與目前以大豆為代表的化學(xué)法和酶解法產(chǎn)肽技術(shù) 相比，易于工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)省能源和用水。特別是采用含釩的培養(yǎng)基加紫外線和亞硝 基胍誘變技術(shù)培育高活力富釩發(fā)酵菌種，提高發(fā)酵物料的釩含量，提高蛋白質(zhì)水解率， 再加上用釩化合物與肽鰲合，進(jìn)一步提高肽的釩元素含量。所得富釩多肽可用超濾膜 超濾純化，得高純度富釩小肽，可用于開(kāi)發(fā)肽釩藥物。其中的釩元素能以小肽為載體， 依靠小肽獨(dú)特的吸收體系被機(jī)體吸收，其生物效價(jià)為無(wú)機(jī)鹽類添加劑的2 3倍。特別當(dāng)以富釩大豆或脫脂后的富釩豆粕為原料時(shí)，其中的釩元素的生物活性與大 豆肽的生物活性互補(bǔ)增效，特別適用于預(yù)防或減輕糖尿病并發(fā)癥。同時(shí)因?yàn)樵谖⑸?發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了豐富的蛋白酶，將大豆蛋白分解成多肽，特異性地切斷疏水性多肽 末端的兩種疏水性氨基酸，消除了酶解法制備豆肽的苦味。同時(shí)，大豆經(jīng)微生物發(fā)酵 后，消除了大豆中胰蛋白酶抑制劑、脹氣因子等對(duì)人體有害的成分。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明制備含釩肽的方法所取原材料，可選用任何適合人類食用的、蛋白質(zhì)含量 豐富的植物種子或植物的根、莖、葉作為原材料。其中優(yōu)選大豆、花生及榨出油脂后 的大豆粕、花生粕，更優(yōu)選按申請(qǐng)?zhí)枮?00710302099. 0的中國(guó)專利申請(qǐng)方法制備 的富釩大豆和富釩花生及其脫脂后的富釩大豆粕和富釩花生粕。200710302099.0號(hào)中國(guó)專利申請(qǐng)制備富釩可食植物種子的技術(shù)要點(diǎn)為，將植 物種子作"初次釩化合物、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、種子浸泡培育保質(zhì)劑溶液浸泡一初 次保質(zhì)恒溫恒濕恒氧催育一二次釩化合物、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、種子浸泡培育保質(zhì) 劑溶液浸泡一二次保質(zhì)恒溫恒濕恒氧催育一清洗、干燥"，得2次催育富釩植物 種子。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的生產(chǎn)釩肽的工藝作進(jìn)一步敘述。實(shí)施例1 按200710302099. 0號(hào)中國(guó)專利申請(qǐng)方法制備富釩大豆 (1)用450mg原釩酸鈉、10g赤霉素、10g溴酸鉀加水100升，配制初次浸 泡液。將大豆洗凈，按l: 3 (W/V)的比例投入初次浸泡液中，16 — 37。C之間調(diào) 節(jié)恒溫，浸泡8—15小時(shí)后，將大豆與浸泡液分離，得初次浸泡大豆。分離收集的浸泡液可留存另用。(2) 將初次浸泡大豆均勻噴灑種子保質(zhì)劑0. 1%溴酸鉀水溶液，置于16 —37°C 溫度、相對(duì)濕度60 — 95%、 300-1000 M3 / (t h)送風(fēng)量恒氧催育裝置內(nèi)催育 8—10小時(shí)，得初次催育大豆。(3) 在初次浸泡余液中添加150g原釩酸鈉、5g赤霉素、5g溴酸鉀、加水 至100升，配制二次浸泡液。將初次催育大豆投入二次浸泡液中，16 — 38。C恒溫 浸泡培育1一3小時(shí)，將浸泡液分離，得二次浸泡大豆。(4) 將二次浸泡大豆按50-100ml/kg用量均勻噴灑保質(zhì)培養(yǎng)液，置于溫度 為16 — 38。C、相對(duì)濕度為55 — 95%、空氣交換量為300-1000 M3 / (t h)的恒 氧下催育1.5_8. 5小時(shí)，得二次催育大豆。(5) 將二次催育大豆用1一7%檸檬酸水溶液和清水沖洗，冷凍干燥得外觀 完整的富釩大豆，用其他干燥法得種皮爆裂的富釩大豆。本實(shí)施例用于大豆加工的方法也可用于花生、小豆等多種植物種子，得相應(yīng) 的富釩植物種子材料。實(shí)施例2誘變法培育高活力富釩發(fā)酵菌種1. 菌種選擇選用任何適宜于蛋白質(zhì)水解且可食用的微生物，例如芽胞桿菌、華根霉菌、雅致 放射毛霉菌、紅曲霉菌、黑曲霉菌、雅致放射毛霉菌、枯草桿菌、納豆菌、放線菌、 短小芽孢桿菌、宇佐美曲霉菌變異株、肉桂色曲霉菌、米曲霉菌、啤酒酵母、保加 利亞乳酸桿菌等。其中優(yōu)選芽胞桿菌CAU208。2. 培養(yǎng)基的配制添加釩化合物分別配制激活培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等四 種培養(yǎng)基在不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)使用。① 激活培養(yǎng)基用于激活被培養(yǎng)微生物的釩耐受特性，其用料和配比為，蛋白胨 0. 25_0. 75%、葡萄糖0. 25_0. 75%、酵母膏0. 25 — 0. 75%、磷酸二氫鉀0. 25 — 0. 75%、 瓊脂1-1.5%、釩化合物0. 002-0. 006%、大豆肽1 —6°/0，加水至1000ml。② 種子培養(yǎng)基用于馴化被培養(yǎng)微生物的釩富集特性，其用料和配比為，蛋白胨 0. 25 — 0. 75%、葡萄糖0. 25 — 0. 75%、酵母膏0. 25 — 0. 75%、磷酸二氫鉀0. 25—0. 75%、 豆粕粉0. 1-0. 2%、釩化合物0. 002-0. 006%、大豆月太1一6%，加水至1000ml。③ 分離培養(yǎng)基用于從被培養(yǎng)微生物中分離有應(yīng)用價(jià)值的菌株，其用料和配比為，蛋白胨0. 25—0. 75%、葡萄糖0. 25 —0. 75%、酵母膏0. 25 —0. 75%、磷酸二氧鉀0. 25 —0. 75%、脫脂奶粉0. 3-1. 0%、釩化合物0. 002-0. 006%、大豆肽1一6%，加水至1000ml。④發(fā)酵培養(yǎng)基用于測(cè)定有應(yīng)用價(jià)值菌株的發(fā)酵活力和釩富集能力，其用料和配比為，豆粕粉10%、蛋白胨0.25 — 0. 75%、糖蜜O. 77%、釩化合物0. 002-0. 006%、大 豆月太1_6%，加水至1000ml。各培養(yǎng)基的配方成分和用量比例可根據(jù)不同發(fā)酵菌種的誘變選育進(jìn)行調(diào)整。3.誘變方法可以使用紫外線誘變法，也可以使用亞硝基胍誘變法，而優(yōu)選紫外線與亞硝基胍 復(fù)合誘變法。(1) 紫外線誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)約36h，調(diào)節(jié)單細(xì)胞菌懸液活菌數(shù)至106-10，/ml，液層厚度0. 2-0. 4cm，使用15W-30W紫外線燈在20cm- 30cm 距離照射0. 5-4min。(2) 亞硝基胍誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36h，調(diào)節(jié)菌懸液活菌數(shù) 為105-10s個(gè)/ml，把配好的亞硝基胍溶液加到培養(yǎng)基里，亞硝基胍終質(zhì)量濃度為 0. 8-1. 2mg/ml， 25-35。C水浴處理25-35min。(3) 紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36h，調(diào)節(jié) 菌懸液活菌數(shù)為107-109個(gè)/1111，亞硝基胍終質(zhì)量濃度為0.8-1.2mg/ml， 25-35。C水浴 處理25-35min,亞硝基胍處理后的液層厚度為0. 2-0. 4cm，進(jìn)行紫外線誘變，使用 15W-30W紫外線燈在20cm-30cm距離照射0. 5-4min。(4) 篩選菌種初篩紫外線誘變后，初篩得到正變菌株；亞硝基胍誘變后，初篩得到正變菌株。 復(fù)篩將初篩得到的正變菌株，接入100ml/250ml的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36-60h，測(cè)定蛋白質(zhì)水解液的水解度，復(fù)篩，得到較穩(wěn)定的正變菌株，置分離培養(yǎng)基 里培養(yǎng)36-60h后，測(cè)定分離培養(yǎng)基里的透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出比值 大的菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)基菌培養(yǎng)后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)， 一定發(fā)酵周期后(36-60h) 測(cè)定發(fā)酵液水解度，得較穩(wěn)定的正變菌株，分成兩組2次復(fù)篩， 一組進(jìn)行紫外線誘變， 一組進(jìn)行亞硝基胍誘變，得性能良好且穩(wěn)定的菌株，再將此菌株同時(shí)進(jìn)行紫外線與亞 硝基胍誘變，得穩(wěn)定性優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，將高產(chǎn)菌株接種到激活培養(yǎng)基上作為第1 代，以后每隔5天傳代1次，共傳10代，將每一代搖瓶發(fā)酵(250ml三角瓶裝液100ml)， 測(cè)定發(fā)酵液的水解度，選定穩(wěn)定性好、高產(chǎn)性好、不發(fā)生突變回復(fù)的菌株為保留菌株，即為高活力富釩發(fā)酵菌種。實(shí)施例3固態(tài)發(fā)酵法制備富含有機(jī)釩和大豆肽的豆粉以普通大豆作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩大豆作原料，先用1 — 7% 檸檬酸或其他可食用酸配制的pH為3. 0-7. 5的酸性水溶液洗滌，然后用清水沖洗， 瀝干，每千克噴灑10-50%釩化合物水溶液50-500ml，攪拌均勻。100—125。C蒸30 — 60分鐘，冷卻至室溫，噴灑大豆肽，將按實(shí)施例2方法選育培養(yǎng)的高效富釩發(fā)酵菌 株按1一10%接種量接種于經(jīng)蒸煮冷卻后的物料中，在20 — 40'C溫度中培養(yǎng)，按送風(fēng) 量1000-3000M3 / (t h)換氣，每16小時(shí)翻料一次，經(jīng)10 — 72小時(shí)在豆粒松軟后 停止發(fā)酵。用2%檸檬酸水清洗豆粒，6(TC溫度烘干，粉碎，所得粉末釩元素含量》 100mg/kg，其氮物質(zhì)中的水溶性蛋白》70%，多肽》55%，為富含有機(jī)釩和大豆肽的 豆粉，可直接添加調(diào)味劑兌水飲用，也可以作為富釩食品、營(yíng)養(yǎng)品的釩元素添加劑。實(shí)施例4固態(tài)發(fā)酵法制備富含有機(jī)釩的多肽小豆粉以普通小豆作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩小豆作原料，按實(shí)施例2的 工藝方法加工制作。實(shí)施例5液態(tài)發(fā)酵法制備富釩大豆多肽液、富釩大豆多肽粉以及富釩大豆小肽 液、富釩大豆小肽粉以普通大豆作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩大豆作原料，先用1一7% 檸檬酸或其他可食用酸配制的pH為3. 0-7. 5的酸性水溶液洗滌，然后用清水沖洗， 100—125。C蒸30 — 60分鐘，1份熟豆加5份0. 001-0. 006%正釩酸鈉的水溶液，磨漿； 漿液泵入發(fā)酵罐，加熱到IO(TC保持30分鐘，冷卻降溫到40°C，按10-60mg / L用量 添加大豆肽，按5%接種量接種按實(shí)施例2方法選育培養(yǎng)的富釩枯草桿菌和富釩乳酸 桿菌的混合菌種，其中富釩枯草桿菌和富釩乳酸桿菌質(zhì)量比為1 : 0. 1 0.3;接種后 37 — 39'C保溫發(fā)酵6小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程保持每升料液中活菌不少于2億個(gè)；發(fā)酵后料液 破乳分為三層，上兩層為液態(tài)，底層為固液混合態(tài)，最上層為油脂；分離油脂；除去 油脂的料液進(jìn)行漿渣分離，所得液體為含有少量低聚糖的富釩大豆多肽液，渣子為低 聚糖和纖維素；取0. 5-lmo1正釩酸鈉水溶液和1. 5-3mo1富釩大豆肽液螯合，濃縮， 得釩含量更高的富釩大豆多肽液，將富釩大豆多肽液干燥則得富釩大豆多肽粉，用于 制備富釩營(yíng)養(yǎng)食品，也可用作制備各種富釩食品的配方成分。將上述富釩大豆多肽液用超濾膜和納米濾膜濾除大分子肽，得精制富釩大豆小肽 液，再取0. 5-lmol正釩酸鈉水溶液和1. 5-3mo1富釩大豆小液螯合，得含釩量更高的作濃縮、干燥，則得富釩大豆小肽粉，用于制備富釩營(yíng)養(yǎng)食品、 藥品，也可用作制備各種富釩食品的配方組分。實(shí)施例6液態(tài)發(fā)酵法制備富釩花生多肽液、富釩花生多肽粉以及富釩花生小肽 液、富釩花生小肽粉以普通花生作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩花生作原料，按實(shí)施例5的 工藝方法加工制作。實(shí)施例7以大豆粕制備富釩大豆多肽液、富釩大豆多肽粉以及富釩大豆小肽 液、富釩大豆小肽粉以普通大豆榨取油脂后的粕作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩大豆榨取油 脂后的粕作原料，取1份大豆粕，用1一7%檸檬酸或其他可食用酸配制的pH為 3.0-7.5的酸性水溶液洗滌，然后用清水沖洗，瀝干，加15 — 20份0.001-0. 006%偏 釩酸銨水溶液混合，100—125t:蒸煮滅菌20 — 60分鐘，冷卻至25 — 28。C，按5-30mg /L用量添加大豆肽，攪拌均勻，按10%接種量加入按實(shí)施例2方法誘變培育的黑曲 霉菌，也可使用未經(jīng)誘變培育的發(fā)酵菌種，25 — 28t:發(fā)酵72小時(shí)；發(fā)酵全過(guò)程通入 無(wú)菌壓縮空氣，并不斷攪拌，保持p服.5-7.0，如酸堿度異常則用HCL或Ca(0H)2進(jìn) 行調(diào)節(jié)。發(fā)酵后進(jìn)行漿渣分離，取上清液為富釩大豆多肽液，其肽含量可達(dá)60%。 取0. 5-lmo1偏釩酸銨水溶液和2-3mo1富釩大豆多肽液螯合，得釩含量更高的富釩大 豆多肽液，再經(jīng)濃縮干燥得富釩大豆多肽粉，用于制備富釩營(yíng)養(yǎng)食品。上述液態(tài)富釩大豆多肽，用超濾膜和納米濾膜除去大分子肽，則得富釩大豆小肽， 再取0. 5-lmol正釩酸鈉水溶液和1. 5-3mo1富釩大豆小肽液螯合，得含釩量更高的富 釩大豆小肽液；將富釩大豆小肽液濃縮，干燥，得富釩大豆小肽粉。實(shí)施例8以花生粕制備富釩花生多肽液、富釩花生多肽粉以及富釩花生小肽液、 富釩花生小肽粉以普通花生搾取油脂后的粕作原料，或以按實(shí)施例1方法制備的富釩花生榨取油 脂后的粕作原料，按實(shí)施例7的工藝方法加工制作。 實(shí)施例9誘變培育富釩啤酒酵母菌選擇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen RCEF1013)按 實(shí)施例2的方法進(jìn)行誘變培育。其中，所使用的培養(yǎng)基，將其配方和配比調(diào)整為， ①激活培養(yǎng)基用料和配比為，0. OOl—0.006%偏釩酸銨，1一3%葡萄糖，1—3% 瓊脂，0. 5_1.5%酵母粉，0.5 — 1. 5%蛋白胨，大豆肽1一6%。② 種子培養(yǎng)基用料和配比為，0.001—0.006%偏釩酸銨，0.8 — 1.2%葡萄糖， 0.4—0. 6%蛋白胨，0. 2 — 0. 3%酵母粉，15—25。/。llBX麥芽汁，大豆肽1一6%，加水 至1000ml。③ 分離培養(yǎng)基用料和配比為，0.001-0. 006%偏釩酸銨，0. 8 — 1.2%葡萄糖， 0.4—0.6%蛋白胨，15-25。/。llBX麥芽汁，大豆肽1一6%，加水至1000ml。④ 發(fā)酵培養(yǎng)基用料和配比為，O.OOl—O. 006%偏釩酸銨，0.8 — 1.2%葡萄糖， 0.2—0. 4%酵母粉，0.4—0. 6%蛋白胨，15-25%11BX麥芽汁，大豆肽1 —6%，加水 至1000ml。按本實(shí)施例方法誘變培育得高活力富釩啤酒酵母，其釩元素含量^ 800mg/kg(干重)，將干燥得富釩啤酒酵母粉，可直接用于制備富釩營(yíng)養(yǎng)食品，也可 作為制備各種富釩食品的配方成分。實(shí)施例10以富釩大豆為基本原料，添加其他食品原料，制備用于調(diào)制豆醬的 富釩多肽選用按實(shí)施例1方法制備的富釩大豆15kg，粉碎成粗粉，加熱水67.5kg，攪拌 均勻在1. 471 X 103 Pa壓力下蒸熟30min;以面粉4. 2kg、食鹽5. 6kg、水16kg，混合攪勻后常壓蒸熟，制備調(diào)味劑I ;以面粉1.8kg，加水調(diào)至20。 B6,加0.2X氯化鈣調(diào)節(jié)pH至6.2，加入a—淀粉 酶3% (每克原料加入a—淀粉酶5U)液化，液化完畢10(TC滅菌，冷卻至6(TC，加 入按實(shí)施例2方法培育的富釩黑曲霉菌(AS3.324) 7X發(fā)酵3h，降溫至30。C，接種 按實(shí)施例2方法培育的富釩酒精酵母5%，常溫發(fā)酵3d，制得調(diào)味劑II;將原料、調(diào)味劑I、調(diào)味劑II混勻，打碎冷卻至5(TC以下，按0.2-0. 8%接種米 曲霉菌(滬釀UE328)，攪拌均勻，水浴發(fā)酵15天。適宜的發(fā)酵溫度為，前期5天 43-47°C，中期5天48-50。C，后期5天52-55。C。期間隔天翻料一次；將上述發(fā)酵物料按0.001-0. 006%用量添加偏釩酸鈉，按1-3%用量添加大豆肽， 充分?jǐn)嚢?，低溫發(fā)酵一個(gè)月，使釩離子與漿液中的大豆多肽螯合，滅菌，得釩元素含 量》60mg/kg的漿液，用于調(diào)制豆醬。實(shí)施例11以富釩大豆粕制備用于調(diào)制醬油的富釩多肽選用按實(shí)施例1方法制備的富釩大豆搾取油脂后的粕100kg，與輔料小麥40kg、 麩皮10kg混合，粉碎，加3倍量33-35%鹽酸水溶液95"恒溫浸泡15天，加碳酸鈉 中和至pH7左右，冷卻至34 — 4(TC左右(冬季為38 — 4(TC，夏季為34 — 36。C，春秋季為35 — 37。C)，按0.2-0.5%接種米曲霉菌(滬釀UE336-2) ， 50'C恒溫發(fā)酵8天， 接著降溫到40—45°C，按0. 001-0. 006%用量添加正釩酸鈉，按1_6%用量添加大豆肽， 40—45。C恒溫后熟15天，再接著降溫到33。C左右恒溫發(fā)酵15 — 20天，使釩離子與 漿液中的大豆多肽螯合，固液分離，將液體加熱至8(TC維持10min滅菌，加適量山 梨醇防腐，再加0. 3增味劑％增鮮，添加甲殼素?cái)嚢槿コ恋?得釩元素含量》80mg/L 大豆多肽液，用于調(diào)制醬油。
權(quán)利要求
1.一種制備含釩的肽的方法，該含釩的肽可直接食用，也可用作制備食品添加劑或藥品的材料，其特征在于，選用適合人類食用的、蛋白質(zhì)含量豐富的植物種子或植物的根、莖、葉作為原材料，或以榨出油脂后的大豆粕、花生粕為原材料，按“酸性水溶液洗滌-蒸煮-添加釩化合物-發(fā)酵-肽與釩酸鹽螯合”工藝步驟進(jìn)行加工，其中，洗滌用酸性水溶液使用可食用酸配制，酸堿度為pH3.0-7.5；蒸煮溫度為100-125℃，蒸煮時(shí)間為20-60分鐘；以噴灑釩化合物水溶液方式向待發(fā)酵物料添加釩化合物；將大豆肽加水溶解，噴灑于待發(fā)酵物料上，作發(fā)酵促進(jìn)劑；接種發(fā)酵菌后在20-40℃溫度中培養(yǎng)6-72小時(shí)，滅菌，清洗，干燥，粉碎，得粗制的含釩多肽粉；將含釩多肽粉加水磨漿，除渣，分離去除未水解蛋白，得富釩多肽液；將富釩多肽液濃縮，干燥，粉碎，得富釩多肽粉；將富釩多肽液濃縮，超濾，除去大分子肽，得富釩小肽液；將富釩小肽液濃縮，干燥，粉碎，得富釩小肽粉；將發(fā)酵后所得的任何一種含釩的肽類中間產(chǎn)品，液態(tài)的直接應(yīng)用，固態(tài)的則先加水磨漿后應(yīng)用，分別與釩酸鹽溶液混合，調(diào)節(jié)成釩肽質(zhì)量比為1∶2-4的水溶液，加熱，恒溫，攪拌，完成螯合，得含釩量更高的液態(tài)富釩肽制品；將液態(tài)含釩量更高的富釩肽制品進(jìn)一步作濃縮、干燥處理，得固態(tài)含釩量更高的富釩肽制品，包括液態(tài)富釩多肽、固態(tài)富釩多肽、液態(tài)富釩小肽、固態(tài)富釩小肽。
2. 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，作原材料使用的適合人類食用的、 蛋白質(zhì)含量豐富的植物種子為大豆或花生。
3. 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，作原材料使用的適合人類食用的、 蛋白質(zhì)含量豐富的植物種子為，對(duì)大豆或花生作"初次釩化合物、植物生長(zhǎng)促 進(jìn)劑、種子浸泡培育保質(zhì)劑溶液浸泡一初次保質(zhì)恒溫恒濕恒氧催育一二次釩化 合物、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、種子浸泡培育保質(zhì)劑溶液浸泡一二次保質(zhì)恒溫恒濕恒 氧催育一清洗、干燥"處理，所得的2次催育富釩大豆或富釩花生。
4. 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，用于洗滌原料的酸性水溶液配制 所用可食用酸的品種為檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、醋酸之一種。
5. 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在蒸煮前或蒸煮后的物料中添加 其他食品原料，用以調(diào)節(jié)最終產(chǎn)品的風(fēng)味。
6. 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，物料發(fā)酵過(guò)程使用液態(tài)發(fā)酵法， 其具體工藝步驟為，將洗滌后的物料加水粉碎成漿液后進(jìn)行蒸煮，之后添加釩化 合物，攪拌使其溶解，再將大豆肽加入，接種發(fā)酵菌株，在20—4(TC溫度中培養(yǎng) 6—72小時(shí)，停止發(fā)酵，滅菌，干燥，粉碎，得粗制的含釩多肽粉；或?qū)l(fā)酵后 的液態(tài)物料磨漿，除渣，分離去除未水解蛋白，得液態(tài)富釩多肽，進(jìn)一步作濃 縮、干燥處理，得固態(tài)富釩多肽。
7. 按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵步驟所使用的發(fā)酵菌是任何 適宜于水解蛋白質(zhì)且可食用的微生物。
8. 按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，發(fā)酵步驟所使用的發(fā)酵菌是芽胞 桿菌CAU208。
9. 按權(quán)利要求l、 7或8所述的方法，其特征在于，發(fā)酵步驟所使用的發(fā)酵 菌種為經(jīng)過(guò)紫外線誘變或亞硝基胍誘變，或經(jīng)過(guò)紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變培育 的高活力菌種，其誘變培養(yǎng)方法為(1) 配制含釩培養(yǎng)基以釩化合物分別配制激活培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等四種培養(yǎng)基① 激活培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、瓊脂、釩化合物、 大豆肽和水配制；② 種子培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、釩化合物、豆粕 粉、大豆肽和水配制；③ 分離培養(yǎng)基以蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀、脫脂奶粉、瓊脂、 釩化合物、大豆肽和水配制；④ 發(fā)酵培養(yǎng)基以豆粕粉、蛋白胨、糖蜜、釩化合物、大豆肽和水配制；(2) 發(fā)酵菌種誘變紫外線誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，以紫外線燈照射誘變； 亞硝基胍誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后加入亞硝基胍誘變； 紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變菌種經(jīng)激活培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，先加入亞硝基胍，再行紫外線燈照射誘變； (3)篩選菌種經(jīng)紫外線誘變，或亞硝基胍誘變，或紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變后的發(fā)酵菌 中初篩得到正變菌株；將初篩所得正變菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定蛋白質(zhì) 水解液的水解度，復(fù)篩，得較穩(wěn)定的正變菌株；進(jìn)一步在分離培養(yǎng)基里培養(yǎng)后， 測(cè)定分離培養(yǎng)基里的透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出比值大的菌株，經(jīng)種 子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)， 一定發(fā)酵周期后測(cè)定發(fā)酵液水解度，得較 穩(wěn)定的正變菌株，分成兩組2次復(fù)篩， 一組進(jìn)行紫外線處理， 一組進(jìn)行亞硝基胍 處理，挑選其中性能良好且穩(wěn)定的菌株同時(shí)進(jìn)行紫外線與亞硝基胍誘變，得穩(wěn)定 性優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，將高產(chǎn)菌株接種到激活培養(yǎng)基上作為第1代，以后每隔5天 傳代1次，共傳10代，將每一代搖瓶發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的水解度，選定穩(wěn)定性好、 高產(chǎn)性好、不發(fā)生突變回復(fù)的菌株保留，即高活力富釩發(fā)酵菌株。
10.按權(quán)利要求1 4和6 9任一權(quán)利要求所述方法制備的產(chǎn)品，其特征在 于，以干重計(jì)，其中肽含量在60%以上，釩元素含量在100mg/kg以上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備含釩的肽的方法，它是以蛋白質(zhì)含量豐富的材料，經(jīng)酸性水溶液洗滌后蒸煮，與釩酸鹽混合，以大豆小肽為發(fā)酵促進(jìn)劑，將發(fā)酵菌株接種于經(jīng)蒸煮的原材料中，在20-40℃溫度中發(fā)酵6-72小時(shí)，清洗，干燥，超微粉碎得富釩多肽粉，除去大分子肽，得液態(tài)富釩小肽，加釩酸鹽螯合，得小肽含量在60％以上、釩元素含量在100mg/kg以上的富釩小肽。
文檔編號(hào)A23J3/16GK101250575SQ20081010151
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者盧廣榮 申請(qǐng)人:秋生堂生物科技(北京)有限公司