專利名稱：：一種與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：聚羥基脂肪酸酯(PHA)是由羥基脂肪酸單體組成的一種線性聚酯，通常是原核微生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的情況下，作為碳源和能源儲備物而合成的高聚物。目前，由于石油的持續(xù)漲價以及石油塑料帶來的白色污染問題，環(huán)境友好型材料得到了越來越多的關(guān)注。PHA作為一種可再生的生物可降解材料，它既具有與傳統(tǒng)的石油來源的塑料如聚乙烯、聚丙烯相類似的物化性質(zhì)，而且還具有一般化學(xué)高分子沒有的性質(zhì)，如生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性等特殊性質(zhì),因而具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已知的PHA應(yīng)用領(lǐng)域包括可生物降解的包裝材料、薄膜、容器等包裝材料，以及手術(shù)縫合線、藥物釋放載體、聚合物支架等醫(yī)用材料。當(dāng)今PHA的工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用細(xì)菌生產(chǎn)PHB(聚羥基丁酸酯)和PHBV(聚羥基丁酸羥基戊酸酯)。PHB是PHA家族中最簡單、研究最透徹的成員。盡管其性質(zhì)類似于熱塑性塑料，但PHB具有易碎、熱穩(wěn)定性不高、可塑性和機(jī)械性能較差等缺點，因而限制了它的廣泛應(yīng)用。與PHB相比，聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)由于3-羥基戊酸(3-HV)單體的摻入，其性能有很大改進(jìn)，因此有著更加廣泛的應(yīng)用前景。但是，用細(xì)菌來生產(chǎn)PHBV需要添加昂貴的丙酸、戊酸等底物來提供3-HV單體，而且高濃度的底物會影響菌體的生長。因此，用細(xì)菌作為工程菌來生產(chǎn)PHBV仍面臨產(chǎn)量低成本高等問題。由于這些局限性，尋求更佳的PHA生產(chǎn)菌株已經(jīng)成為眾多科研工作者的研究方向。極端嗜鹽古菌作為PHA的生產(chǎn)菌株有其獨特的優(yōu)點可以利用低廉的淀粉作為碳源；培養(yǎng)基中的高鹽環(huán)境可以簡化高壓滅菌甚至省略滅菌；菌體在水溶液中非常容易裂解，可以簡化PHA的提取過程；從而大大降低PHA的生產(chǎn)成本。特別是有些極端嗜鹽古菌(如Z/a/o/era;cme&temme/)可以在不添加底物的情況下，利用廢糖蜜等工業(yè)副產(chǎn)物來合成大量的PHBV，而且其性能要優(yōu)于細(xì)菌來源的PHBV，因此極端嗜鹽古菌有望成為PHBV的生產(chǎn)菌株。目前國際上對極端嗜鹽古菌中PHA的研究工作還主要集中在發(fā)酵工藝的研究上，而對PHA合酶功能的研究還十分有限。PHA合酶是PHA合成過程中的關(guān)鍵酶，它的不同種類和性質(zhì)決定了微生物合成的PHA的多樣性。在細(xì)菌中，PHA合酶得到了廣泛的研究，按照合酶聚合單體的長度，它可分為聚合短鏈單體(長度3-5個碳原子)和聚合中長鏈單體(長度大于6個碳原子)的兩類。細(xì)菌中已經(jīng)獲得的PHA合酶的缺失突變株大大促進(jìn)了PHA合酶基因的克隆和功能的鑒定，目前己克隆了50多種細(xì)菌PHA合酶基因。因此，大力開展極端嗜鹽古菌各種PHA合酶(如PHBV合酶)的研究，對于嗜鹽古菌PHA的生物工程開發(fā)具有極其重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蛋白，該蛋白是與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶。本發(fā)明提供的與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶，名稱為phaECHf，來源于極端嗜鹽古菌i/fl/o/eraxme&妙ra"e/CGMCC1.2087，是由由亞基1和亞基2構(gòu)成所述亞基1名稱為PhaEHf，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的多肽；所述亞基2名稱為PhaCHf，是如下(c)或(d)的多肽(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(d)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(c)衍生的多肽。該酶phaECHf可用于體外合成聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV及其衍生物，為了使該酶或其中的任一亞基分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在所述酶或其中的任一亞基蛋白質(zhì)的N端連接上信號肽序列。為了使上述亞基1或亞基2中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)或序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>FLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)或(d)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)或(d)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3自5'末端第580-1128位核苷酸或序列表中序列3自5'末端第1125-2603位核苷酸所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述蛋白的編碼基因具體可為如下l)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列3中自5'末端第580-2603位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述步驟4)中的基因最好與l)或2)中所述基因有95%以上的同源性。所述嚴(yán)格條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。序列表中序列3所示的DNA分子由2799個核苷酸組成，其中，第1-579位核苷酸序列為基因的啟動子及其上游序列，第580-1128位核苷酸序列為上述l)中所述的亞基的編碼序列，第1125-2603位核苷酸序列為上述2)中所述的亞基的編碼序列。序列表中序列3是由2799個脫氧核苷酸組成；其中，自5'端第538-579位核苷酸序列為所述極端嗜鹽古菌與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)酶的編碼基因的啟動子區(qū)域，序列第548-557位核苷酸序列為啟動子核心序列；自5'端第580-1128位核苷酸序列為上述1)中所述亞基的編碼序列，自5'端第580-582位核苷酸序列為其起始密碼子，自5'端第1126-1128位核苷酸序列為其終止密碼子，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；自5'端第1125-2603位核苷酸序列為上述2)中6所述亞基的編碼序列，自5'端第1125-1127位核苷酸序列為其起始密碼子，自5'端第2601-2603位核苷酸序列為其終止密碼子，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。含有上述任一所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體可為在載體pWL102的多克隆位點插入序列表中序列3自5'端第411-2687位脫氧核苷酸所示的DNA分子得到的重組載體。所述重組菌是通過將上述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的。所述宿主菌是極端嗜鹽古菌//fl/o/eraxme^Yem2"e/，優(yōu)選為極端嗜鹽古菌i/a/o/^raxmWtorflwe/CGMCC1.2087。本發(fā)明的另一個目的是提供一種過量表達(dá)與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶的方法。本發(fā)明所提供的過量表達(dá)與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶的方法，是發(fā)酵上述重組菌得到過量表達(dá)的與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶。本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高極端嗜鹽古菌聚羥基丁酸戊酸共聚酯產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所提供的提高極端嗜鹽古菌聚羥基丁酸戊酸共聚酯產(chǎn)量的方法，是利用上述過量表達(dá)聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)酶的極端嗜鹽古菌，生產(chǎn)聚羥基丁酸戊酸共聚酯。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組極端嗜鹽古菌，該重組菌可以用于驗證其它極端嗜鹽古菌的與PHA合成相關(guān)的酶的基因功能。本發(fā)明所提供的重組極端嗜鹽古菌，是滅活極端嗜鹽古菌//"/o/era;cme必emme/CGMCC1.2087中的上述蛋白(即與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶)的編碼基因得到的重組菌。所述重組極端嗜鹽古菌具體可按照如下方法得到利用同源重組缺失極端嗜鹽古菌Z/a/o/erax/we^^ra"e/CGMCC1.2087的基因組中的序列表序列3的自5'端第543-2056位核苷酸序列或其部分序列。本發(fā)明所提供的極端嗜鹽古菌中與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶及其編碼基因，能夠用于通過基因工程提高嗜鹽古菌的聚羥基丁酸戊酸共聚酯及其衍生物的合成效率，使聚羥基丁酸戊酸共聚酯產(chǎn)量提高，適合于工業(yè)生產(chǎn)。圖1為整合載體pLHC的構(gòu)建示意圖。圖2為PCR驗證缺失p/zaECHf基因的突變菌Z/a/o/eraxme<i/^ra"e/PHBV-1的瓊脂糖電泳圖。其中，泳道l為未經(jīng)任何處理的Z/a/o/eraxmeW^7Yme/CGMCC1.2087野生型菌株的PCR結(jié)果；泳道2為//^五CH連因的雙交換菌株Z/a/o/eraxme必emwe/PHBV-1的PCR結(jié)果；泳道3為質(zhì)粒pLHC的PCR結(jié)果。圖3為菌株積累聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的氣相色譜檢測結(jié)果。其中，A為極端嗜鹽古菌i/a/o/eraxme^Yem"e/CGMCC1.2087野生菌產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果;B為缺失i/^五CHf基因的突變菌i/a/o/era;cme^/wra"e/PHBV-1的結(jié)果；C為導(dǎo)入空載體pWL102的菌F"/o/eraxmec//femme/z'PHBV-l/pWL102的結(jié)果；D為導(dǎo)入p/2a￡CHf基因的菌//a/o/era:cme&temme/PHBV-l/ECHf的結(jié)果(圖中顯示3HB和3HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實施例1、極端嗜鹽古菌i/a/o/eraxmectoemwe/CGMCC1.2087中與聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)合成相關(guān)的酶(PhaECHf)及其編碼基因(p/za五CHf)的獲得根據(jù)已知的極端嗜鹽古菌Wa/oan:w/flma&woWw/ATCC4309的PHA合酶PhaC亞基的保守氨基酸序列(GenBank號YP—137339)，設(shè)計了一對同源引物P1/P2，引物序列如下P1:5'CTCATCGTTTACGCGCTCATCAAC3'P2:5'GGCCTCCGGCGGGATGAGGTGGTC3'以極端嗜鹽古菌Z/a/o/eraxwe&torfl"e/CGMCC1.2087的基因組DNA為模板，用引物對P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約700bp長度的PCR產(chǎn)物。上述PCR擴(kuò)增程序為:94。C3min預(yù)變性；然后94。C45s、56。C45s、72。C60s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min。擴(kuò)增體系均為25iuL。將該P(yáng)CR擴(kuò)增片段連接到pUCm-T載體(上海生工)上進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明引物對P1和P2擴(kuò)增得到了723bp的序列，其序列如序列表中序列3的自5'端第1338-2060位核苷酸序列所示。在此序列的基礎(chǔ)上，采用熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)擴(kuò)增其5，和3，側(cè)的序列以7/a/o/eraxmW"erra朋/CGMCC1.2087的基因組DNA為模板；PCR引物如下，其中ADl-3為隨機(jī)簡并引物，分別與dpl-3和upl-3擴(kuò)增已知序列的3，及5，側(cè)翼序列；TAIL-PCR擴(kuò)增程序按照文獻(xiàn)(PlantJ.8:457-63.)中所述進(jìn)行。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(美國Promega公司)上進(jìn)行測序，結(jié)果分別得到了1400bp(5'側(cè))和800bp(3'側(cè))左右大小的片段。AD1:5，NGTCGASWGANAWGAA3'AD2:5，AGWGNAGWANCAWAGG3，AD3:5，NTCGASTWTSGWGTT3，dpi:5，TACGTCCGGTTGTTCGAG3，dp2:5，GCAGTTCTTGGAGGACGT3，dp3:5，CCAGATTGTCGGGGAGTA3，upl:5，CCATGCAGTACCCGAGAA3，up2:5，CGTGAGGTGGGTGTCGAG3，up3:5，GGTTGGAGGTCGAGAATG3，將得到的TAIL-PCR的產(chǎn)物(1400bp和800bp)以及上述用P1和P2引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物(723bp)的序列用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接，最終得到了總長為2799bp(核苷酸序列如序列表中序列3所示)的片段。分析表明，該片段中含有兩個開放閱讀框(0RF1和ORF2),共同組成一個操縱子。其中，開放閱讀框0RF1的核苷酸序列為序列表中序歹U3自5'末端第580-1128位核苷酸，共549bp，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列l(wèi)所示；開放閱讀框ORF2的核苷酸序列為序列表中序歹U3自5'末端第1125-2603位核苷酸，長度為1479bp，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。為了進(jìn)一步驗證已知序列的正確性，設(shè)計了一對引物P3和P4，序列如下P3:5'CCCTCGACATCGAGGAAG3'P4:5'TGTCTGTAAGCGGGGTA3'然后以極端嗜鹽古菌i/a/o/eraxme^erra""CGMCC1.2087的基因組DNA為模板，以P3和P4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序為:94。C3min預(yù)變性；然后94。C30s、56。C30s、72。C180s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min。擴(kuò)增體系為25pl。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(美國Promega公司)上進(jìn)行測序。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物為2799bp，其核苷酸序列與序列表中序列3所示的核苷酸序列一致，包括完整的/^"五h連因序列(序列表中序列3的自5'端第580-1128位核苷酸序列)、;/wCh違因序列(序列表中序歹U3的自5'端第1125-2603位核苷酸序列)和^^^前的啟動子及其上游序列(序列表中序列3的自5'端第l-579位核苷酸序列)；p/^五H連因序列(序列表中序列3的自5'端第580-1128位核苷酸序列)編碼PhaEHf亞基(序列如序列表中序列l(wèi)所示)，；A"CHf基因序列編碼PhaCHf亞基(序列如序列表中序列2所示)。PhaEHf亞基和PhaCHf亞基組成與聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)合成相關(guān)的酶，將其命名為PhaEC附；將PhaECHf的編碼基因(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)命名為基因/7/w五CHf。將該兩個開放閱讀框的序列在NCBI上進(jìn)行同源比對分析，結(jié)果表明549bp的ORF1編碼的氨基酸序列(序列表中序列1)與極端嗜鹽古菌i/a/oan:M/amfln、mw加'ATCC43049的PhaEnm(GenBank號YP—137338)具有60%的同源性，1479bp的ORF2編碼的氨基酸序列(序列表中序列2)與極端嗜鹽古菌/^/oam^maW柳or加'ATCC43049的PhaCnm(GenBank號YPJ37339)具有57%的同源性。實施例2、驗證基因;^a五CHf的功能一、通過構(gòu)建缺失基因;^a五CHf的突變菌株i/a/o/eraxwecZ/tora"e/PHBV-1來驗證1、滅活基因//^五CHf的同源重組整合質(zhì)粒pLHC的構(gòu)建pLHC的構(gòu)建過程如圖l所示，具體的實施方式如下1)用于破壞基因;^五CHf的同源重組雙交換臂的擴(kuò)增根據(jù)如aCHf和;/w五Hf的核苷酸序列，設(shè)計了兩對雙交換臂的擴(kuò)增引物N1/N2和Cl/C2:Nl:5'AGCCTGCAGCCCTCGACATCGAGGAAG3'(帶下滑線的序列為尸M識別位點)N2:5TATGGATCCACAGACTACTCCGGCGTG3'(帶下滑線的序列為SamHI識別位點)Cl:5TATGGATCCGGCGAGTAAACCGTTCAA3'(帶下滑線的序列為BflmHI識別位點)C2:5TATGGTACCATCGGGAGCTGTACGGAC3'(帶下滑線的序列為Xp"I識別位點)以極端嗜鹽古菌/fo/o/eraxm^Z/tora"e/CGMCC1.2087的全基因組DNA為模板，用引物對N1/N2進(jìn)行擴(kuò)增，得到破壞;^a五CHf的雙交換左臂(phaEU)PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增程序為:94。C3min預(yù)變性;然后94°C30s、56°C30s、72°C30s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min。擴(kuò)增體系為25pl。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測得擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為542bp的片段，該片段具有序列表中序歹i」3的自5'端第l-542位核苷酸序列，即為破壞坤^CHf的左臂(phaEU)。以極端嗜鹽古菌Z/a/o/eraxme&temwe/CGMCC1.2087的全基因組為模板，用引物對C1/C2進(jìn)行擴(kuò)增，得到破壞j^a五CHf的雙交換右臂(phaCC)PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增程序為:94。C3min預(yù)變性；然后94。C30s、56。C30s、72。C30s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min。擴(kuò)增體系為25pl。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測得擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為631bp的片段，該片段具有序列表中序列3的自5'端第2056-2687位核苷酸序列，即為破壞p/^五CHf的右臂(phaCC)。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物phaEU和phaCC。2)破壞;/z^ECHf的整合載體pLHC的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶5"mHI和^"I分別雙酶切載體pUBP(中國科學(xué)院微生物研究所)(Appl.Environ.Microbiol"73，6058-6065)禾口PCR產(chǎn)物phaCC，連接酶切后的載體和PCR片段，然后用CaCl2化學(xué)法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測序；結(jié)果表明片段phaCC(其核苷酸序列為序列表中序列3的自5'端第2056-2687位核苷酸序列)己經(jīng)正確插入載體pUBP的5amHI和尺;"I位點間，將其命名為重組載體pUBP-R。右臂成功連入后，再用限制性內(nèi)切酶/^I和^"附HI分別雙酶切連有右臂的重組載體pUBP-R和PCR產(chǎn)物phaEU，連接酶切后的載體和PCR片段，然后用CaCl2化學(xué)法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測序；結(jié)果表明片段phaEU(其核苷酸序列為序列表中序列3的自5'端第l-542位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體pUBP-R的5畫HI和戶M位點間，得到含有phaEU和phaCC完整的雙交換整合載體，并將其命名為pLHC(圖l)。2、基因尸/^五C附缺失突變菌株Fa/o/erflxw^&emwe/PHBV-1的構(gòu)建通過pLHC的雙交換臂與極端嗜鹽古菌/Za/o/eraxme必emz"e/CGMCC1.2087基因組中的//a五CH違因進(jìn)行同源重組，破壞7/a/o/era:cme^'ferrawe/CGMCC1.2087基因組中的;7to五CH違因,具體步驟如下所述1)整合載體pLHC轉(zhuǎn)化/fa/o/eraxme必errawe/CGMCC1.2087及篩選;/2fl五CHf基因的單交換菌株采用PEG介導(dǎo)的方法(Can.J.Microbiol.35:148-52.)將環(huán)狀質(zhì)粒pLHC轉(zhuǎn)化至極端嗜鹽古菌/fa/o/eraxw^/temz""CGMCC1.2087，由于pLHC缺少極端嗜鹽古菌的復(fù)制子，在有抗性選擇的壓力下菌株只能通過載體上與極端嗜鹽古菌基因組的同源序列重組到極端嗜鹽古菌//a/o/eraxme必em"e,CGMCC1.2087的基因組上，轉(zhuǎn)化后在含有5嗎/mL莫維諾林的AS-168(每升含有5.0g酸水解酪素(casaminoacids)，5.0g酵母提取物(yeastextract),l.Og谷氨酸鈉(sodiumglutamate)，3.0g檸檬酸鈉，200gNaCl，20gMgS04.7H20，2.0gKC1,0.36gFeS04'4H20and0.36mgMnCl2'4H20,12g瓊脂，pH7.2)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子，能在該抗性平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為發(fā)生了單交換的克隆，結(jié)果得到約100個發(fā)生了單交換的克隆。2)同源重組雙交換后缺失;^a五CH連因的突變工程菌株/ya/o/eraxm^/ferra"e/PHBV-1的篩選步驟l)篩選到的p/^五CH違因的單交換菌株，在含有莫維諾林的培養(yǎng)基中其整合的質(zhì)粒穩(wěn)定存在，故將步驟l)篩選到的p/^五CH違因的單交換菌株在不含莫維諾林的液體AS-168培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)約1000代，使其發(fā)生二次交換。然后在固體AS-168培養(yǎng)基平板上稀釋涂布均勻得到單克隆，挑取單克隆同時在AS-168固體平板上及含5ng/mL莫維諾林的AS-168的固體平板上劃線，挑選在AS-168固體平板上生長而在含5^ig/mL莫維諾林的AS-168的固體平板不能生長的克隆，接種于AS-168液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)48-72hr后提取基因組DNA。分別以此基因組DNA，//fl/o/eraxme&ferrawe/CGMCC1.2087野生菌株的基因組DNA，以及質(zhì)粒pLHC為模板(陽性對照)，弓I物N1和C2(引物序列見上面)進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行篩選缺失//2^:CH違因的突變工程菌株。PCR擴(kuò)增程序為:94°C3min預(yù)變性；然后94°C30s、56°C30s、72°C180s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min。擴(kuò)增體系為25p1。然后用1.0%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測。電泳結(jié)果見圖2。圖2中泳道l為以i^/o/eraxme&term"e/CGMCC1.2087野生型菌株基因組為模板的PCR結(jié)果，其產(chǎn)物對應(yīng)于序列表中序列3的自5'端第l-2687位核苷酸序列，大小為2687bp;泳道2為以;^a五CH遵因的雙交換菌株基因組為模板的PCR結(jié)果，其產(chǎn)物對應(yīng)于序列表中序列3的自5'端第l-542位及2057-2687核苷酸序列，大小為1073bp;泳道3為以質(zhì)粒pLHC為模板的PCR結(jié)果，其產(chǎn)物亦為1073bp，與雙交換菌株的結(jié)果一致，證明目的菌株確實已經(jīng)發(fā)生雙交換，該菌株基因組上的/^五CH違因缺失了序列表中序歹ij3的自5'端第543-2056位核苷酸序列，將發(fā)生雙交換的Z/a/o/eraxweAfemme/菌株命名為PHBV-1.然后將Z/a/o/era:cme&^rawe/PHBV-1單克隆接種于AS-168液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)48-72hr后再轉(zhuǎn)接到MST(每升含有200gNaCl,20gMgS04'7H20,2gKC1,1g谷氨酸鈉(sodiumglutamate),0.0375gKH2P04,50mgFeS047H20,0.36mgMnCl2.4H20，1g酵母提取物(yeastextract),10g淀粉(starch),pH7.2)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天，然后離心收集菌體。同時，以未經(jīng)任何處理的i7a/o/eraxme^^t朋e/CGMCC1.2087野生菌株在同樣條件下培養(yǎng)3天作為陽性對照。將收集的菌體冰干，然后稱取約75mg冰干的菌體，將其置于酯化管中，再向其中加入2mL酯化液(3%體積的濃硫酸溶于甲醇中，含lg/L苯甲酸作為內(nèi)標(biāo))和2mL氯仿，混勻后將其置于100"C的烤箱中酯化4小時。酯化后加入lml蒸餾水，混勻，待有機(jī)相和水相分層后，取lnl下層有機(jī)相用氣相色譜進(jìn)行檢測。實驗設(shè)3次重復(fù)。檢測結(jié)果如圖3A和3B所示(圖中顯示3HB和3HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。結(jié)果表明，未經(jīng)任何處理的7^/o/eraxmet/tom3"e/CGMCC1.2087野生菌株在MST培養(yǎng)基中可產(chǎn)生聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)(圖3A)，而缺失基因;/2fl五CHf的突變菌株Hfl/o/eraxmefifeemme/PHBV1在相同的培養(yǎng)條件下由于缺失了/7/zWCh連因，而不能夠合成聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)(圖3B)。證明由本發(fā)明的;/^五CH連因(序列表中序列3)編碼的兩個亞基(序列表中序列1和2)構(gòu)成的酶phaECHf為與聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)合成相關(guān)的酶。二、將；^oECHf基因回轉(zhuǎn)到步驟一構(gòu)建的ifo/o/eraxme^^7W7e/PHBV-1突變菌中，以進(jìn)一步驗證一a五CHf基因的功能將基因//za五CHf^入突變株ifa/o/era;c附W/^r朋"PHBV-1，以驗i正p/^五CH連因的功能，具體操作如下1、構(gòu)建重組載體pWL102-ECHf首先根據(jù)極端嗜鹽古菌^a/o/eraxme&tora朋/CGMCC1.2087的基因組序列設(shè)計引物HfFl和HflU，引物序列如下Hffh5'AGACGCCATGGACGAAAT3'dol)HfRl:5'ATAGGATCCATCGGGAGCTGTACGGAC3'(B,HI)以//a/o/eraxm^feerra"e/CGMCC1.2087的基因組DNA為模板，用引物HfFl和HfRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增i/a/o/eraxme力Ye/7Yme/CGMCC1.2087的基因;/za￡CHf。PCR反應(yīng)條件為:94。C3min預(yù)變性；然后94。C30s、56。C30s、72。C150s進(jìn)行30個循環(huán)；72。C再延伸7min;擴(kuò)增體系為25|iL?；厥誔CR產(chǎn)物，然后用^wzHI/AAcoI切割；并用相同的內(nèi)切酶切割穿梭載體pWL102(中國科學(xué)院微生物研究所)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5478-82)。連接酶切后的載體和片段，并將連接產(chǎn)物用CaCl2化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，篩選獲得陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，載體pWL102的5amHI和AAcol位點間已經(jīng)正確插入序列表中序列3自5'端第411-2687位核苷酸序列，將該重組載體命名為pWL102-ECHf。2、構(gòu)建重組菌PHBV-l/ECHf將步驟1獲得的pWL102-ECHf通過PEG介導(dǎo)的方法(Can.J.Microbiol.35:148-52.)轉(zhuǎn)化至步驟一中獲得的突變菌/^/o/eraxm^//^rawe/PHBV-1中，并在含有5mg/L莫維諾林的AS-168固體平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，再對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取質(zhì)粒及酶切和測序驗證，證明獲得了已經(jīng)導(dǎo)入重組載體pWL102-ECHf的陽性轉(zhuǎn)化子，將含有pWL102-ECHf的重組極端嗜鹽古菌7/a/o/eraxme^Yemme/PHBV-1命名為PHBV-l/ECHf。3、發(fā)酵重組菌PHBV-l/ECHf以驗證其是否產(chǎn)生PHBV將得到的PHBV-l/ECHf工程菌按照步驟一2中所述的方法進(jìn)行發(fā)酵，再按照步驟一2所述的方法進(jìn)行酯化反應(yīng)(經(jīng)過甲酯化處理后)，然后用氣相色譜檢測反應(yīng)體系中聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的積累情況。同時將空載體pWL102導(dǎo)入Z/a/o/eraxm^//tora"e/PHBV-1得到的重組菌(命名為/fe/o/eraxm^Z/^ra"e/PHBV-l/pWL102)、未經(jīng)任何處理的野生型菌株i/a/o/eraxmeaf/tora"e/CGMCC1.2087和菌株i/a/o/eraxmeflf/tor朋^PHBV-1分別按照上述方法進(jìn)行發(fā)酵與分析，作為對照。實驗設(shè)3次重復(fù)，檢測結(jié)果如圖3A、3B、3C和3D所示(圖中顯示3HB和3HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。結(jié)果表明，//^五CHf基因?qū)雐/a/o/eraxmeWferra""PHBV-1后獲得的重組菌PHBV-l/ECHf能夠產(chǎn)生PHBV(圖3D),//a/o/eraxm^"erra"e〖PHBV-1和/fo/o/eraxm^/femwe/PHBV-1/pWL102未產(chǎn)生PHBV(圖3B和圖3C)，表明是;^afCH連因的導(dǎo)入才使得原來喪失聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的合成能力的菌株重新獲得了PHBV的積累能力，并且其含量和產(chǎn)量均與野生菌//a/o/eraxmeafterra"e/CGMCC1.2087(圖3A)相當(dāng)。圖3中A為極端嗜鹽古菌//a/o/eraxm^/terra"e/CGMCC1.2087野生菌產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果；B為缺失;/z"五CHf基因的突變菌i^/o/eraxme^Ywra"e/PHBV-1的結(jié)果；C為導(dǎo)入空載體pWL102重組菌/Za/o/eraxmet/temwe/PHBV-1/pWL102的結(jié)果；0為導(dǎo)入/7/"￡01違因的菌//"/0/^^we&tor"朋/PHBV-l/ECHf產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果(圖中顯示3HB和3HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。氣相色譜檢測的各樣品經(jīng)過甲醇高溫處理生成羥基脂肪酸甲酯，4.85min的出峰位置對應(yīng)lng苯甲酸的甲酯化產(chǎn)物(內(nèi)標(biāo))。再次證明/7/w五CHf編碼/fe/o/eraxmeaf/^ra"e/的PHBV合酶的功能。同時表明，//a/o/eraxm^Z/^ra"e/PHBV-1由于可提供PHA合成的前體，因此可以作為一株宿主菌來驗證來自于其它極端嗜鹽古菌的PHA合酶基因功能，這為將來在嗜鹽菌領(lǐng)域篩選新型的PHA合酶基因提供平臺。實施例3、；^a五CHf基因的過表達(dá)將實施例2步驟二構(gòu)建的重組質(zhì)粒pWL102-ECHf按實施例2步驟一2中所述的方法導(dǎo)入未經(jīng)任何處理的野生型菌株/fo/o/eraxweAYemme/CGMCC1.2087中，將獲得的重組菌命名為i/a/o/eraxme必mw^ypWL102-EC附，按施例2步驟一2中所述方法進(jìn)行發(fā)酵與分析。同時將空載體pWL102導(dǎo)入//a/o/eraxmecfeerrawe/CGMCC1.2087得到的重組菌(命名為/fe/o/eraxmeWfemmei/pWL102)和未經(jīng)任何處理的野生型菌株Z/""/o/eraxme必mw2"CGMCC1.2087分別按照施例2步驟一2中所述方法進(jìn)行發(fā)酵與分析，作為對照。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實驗結(jié)果表明，//a/o/eraxwe&Y"ra"^/pWL102產(chǎn)生聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV的能力為1.3mg/ml發(fā)酵液，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pWL102-ECHf的菌株i/"/o/eracwe&terra"ei/pWL102-ECHf產(chǎn)生聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV的能力為2.3mg/ml發(fā)酵液，未經(jīng)任何處理的野生型菌株//a/o/eraxme必emwe/CGMCC1.2087產(chǎn)生聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV的能力為1.4mg/ml發(fā)酵液。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pWL102-ECHf的菌株產(chǎn)生聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV的能力比轉(zhuǎn)入空載體pWL102的菌株和野生型菌株提高了60。/。。說明通過提高/7/^ECHf基因的拷貝數(shù)和(或)表達(dá)量，可以大幅度提高Z/a/o/eraxme^^raw"菌生產(chǎn)聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV的能力。本發(fā)酵實驗均用搖瓶在沒有優(yōu)化的條件下進(jìn)行，若采用發(fā)酵罐并優(yōu)化發(fā)酵條件，將獲得更加可觀的產(chǎn)量。序列表<160>3<210>1<211>182<212〉PRT<213>富鹽菌屬極端嗜鹽古菌//a/o，axmWtora腦'<400>1MetSerGinGinLysGlyAspGluTrpThrMetTyrAlaAlaGluMet151015AsnGluThrMetLeuAlaAlaLeuGluArgAsnValGluAlaGinThr202530GinPheValGluSerTrpLeuAspAlaLeuGluGluThrProGluMet354045SerThrGluThrlieSerGluGlyLeuAsnGlyTyrAlaArgAlaTyr505560GluValTrpMetAsnAlaAlaGluGinGinPheGluArgAlaSerAsp65707580AlaPheGluGlyGluAspValSerAlaAsnGluPheArgAsplieTrp859095LeuAsnSerAlaAsnGluAlaPheLysGluValMetGlyThrSerAla100105110PheAlaAlaAlaThrGlyGinThrValGluAspAlaLeuGluMetGin115120125ArgGluValAspGluAlaAlaGinSerThrLeuArgThrLeuGlyPhe130135140AlaThrGluGlyAsplieAspGluValAlaGluArgLeuValGluLeu145150155160GluArgArgGinHisAlaValGluThrLysLeuAspArgLeuLeuAsp165170175AlaMetAspValGluGly180<210〉2<211>492<212>PRT〈213〉富鹽菌屬豐及端嗜鹽古菌Haloferaxmediterranei<400>2MetThrProValThrPheAlaLeuAspLeuGinArgArgGinTrpGlu151015GinAlaAlaGluLeuValAspArgThrSerAlaAlaSerAspArgAla202530GluThrValSerGluValSerValGlyLysThrProAsnGluValVal354045TyrLysGluAsnLysLeuArgLeuLeuHisTyrGluSerLysThrGlu505560ThrGinTyrAspValProlieLeulieValTyrAlaLeulieAsnArg65707580ProTyrlieLeuAspLeuGinProAspArgSerValValGinThrLeu859095LeuGluGinGlyPheAspValTyrLeulieAspTrpGlyGluProSer100105110ArgLeuAspThrHisLeuThrLeuAspAspTyrValThrArgTyrlie115120125AspAsnCysValAsplieValArgAspArgSerGlyGinAspSerlie130135140AsnLeuLeuGlyTyrCysMetGlyGlyThrMetSerValMetTyrAla145150155160<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>GluThrProAspGluGlyLeuLysProGinAlaAlaAlaSerAsnGlu385390395400ThrValAlaGluGluProGluProGinValValGluSerAsnGluThr405410415ThrGluGluGluLeuGluProGinAlaValGluAlaAsnGluThrAla420425430ProGluGluLeuGluSerlieAspGlylieGlyProThrTyrAlaGlu435440445ArgLeuAlaSerValGlylieThrSerValSerGlyLeuAlaAlaAla450455460AspProSerGlulieAlaAlaThrlieAspValProValSerArgVal465470475480ThrAlaTrpValGluGinAlaSerAspArgThrAsp485490<210>3<211>2799<212>DNA<213>富鹽菌屬極端嗜鹽古菌//fl/o/eraxwedzYerra""<400>3ccctcgacatcgaggaagggLgacctcgttcaggcgttcgtcgtcccaatcaaacaatcac60gtggtgattcaca^gcc犯cccattcacgcagttCttCCElgttacagcgt120cgctccatcggcggagcatgcaccaaggtatcgagttccaaaagcaggta180acgcgcatgatggtcgatggtatgaaggcccaacagtcagttagccggaagggaactgac240ttcgctcggaccgcggtc犯gtcatacttcg卿tgatggactcgtcggtgccgggagac300aaccggatgt3CgCgg3Cgtgaaggacgcg3tgg3Cg3gCagttcgaca_gtatcgacgag360atgaccg犯c卿CCtggg3tgtcatggaag犯sgcttcgagacgccatg420gacgaaatcatggagcagtccctggaatecctagacgacgcgactg鄉(xiāng)tttacctcgaa480ggCCt3C3gggacctctgcacaggtcacaccagacacgccggagtagtct540gtcggttaactattttagcccgcccgagagtatatgcccatgtcacaacaaaaaggggac600g3gtgg3Cg3tgtatgcagcg卿cgatgcttgcggcact660gtcgaggcacagacacagttcgtcgagtcgtggctcgacgcgcttgaggagacacccgag720atgtccacggagacgst犯gcgagggcctcaacggctacgctcgcgcctacgaggtgtgg780atgaacgccgccgaeicagcagttcgagcgagcg鄉(xiāng)gax;gccttcg鄉(xiāng)g840tctgccaacgagttccgcgatatctggttga^ctcggcga3Cg3ggC3"ttC卿g3ggtg900atgggtacctccgcgttcgccgccgcgaccggacagacagtcgaagacgcactcgaaatg960cagcggga^gtcgacgaagccgcgcagtcgacactgcgcacgctcgggttcgccac3gag1020gg卿catcgacg犯gtcgcagagcgcctcgtcgseictcggcacgccgtc1080g,cg卿ctcgaccggctcctcgatgcg3tgg3Cgtgg鄉(xiāng)gatgacaccagtaacct1140tcgccttggacttgcagcgccgacagtgggagcaagctgcggaactcgtcgaccggacta1200gcgctgcctctgaccgtgccg83accgtgtcggaggtatcggtcggcaaa1260犯gtcgtctacaaggatgaata^actceigactcctccactacgaatcgaag3cggageicac1320agtacgatgtgcccattctcatcgtgtacgccggccgtacattctcgacc1380tccaacccgaccggagtgtcgttcagacgctcctcgaacaagggttcgacgtctacctca1440tcgattggggcgagccgtcacggctcgacacccscctcacgctcgatgactacgtgactc1500ggt3C3tCgElcaactgcgtcgacatcgttcgcgaccgctcggggcaggactcgattaacc1560ttctcgggtaCtgC3tgggCgCgtg8tgt3cgctgcgctcttccccgaga1620aggtcagg犯cctcggtctgatggccgcgggactcgtcttcgatgacacgggcggagtcc1680tcgagcgctggggtgacgagcagtactactcacccaaggccgtgaccgatgcgtttgg犯1740acgttccttcggElgttCCtCgacgtgggcttcgcactgatggaccctgtcgagaacttcg1800taaccaagtacgtccggttgttcgagaacgtcgagaacgagtccttcgtagagaacttct1860ctcggatggagcagtggctctctgacggtatcgacgtcgcgggcg卿cctacaagcagt1920tCttgg3gg3cgtctaccagC3g犯ca^gctcgctcagaacgaactcatgctcgacggga19808gC3ggtCg3cctcgaacgactcgagatgcccatcctccagattgtcggggagtacgacc2040acctcatccc織,ggcgagta^eiccgttcaacgacctcgttccgagcgaggatocgg2100aggttatcgaaggcgcgactggccacatcgggctttccgtctcgtcgcgctcg匿ggag2160acctctggccggccgtgagtgactggttcgccgaacgttcagagacagga2220cacctgactcgaigacceigaccagactcgcaggcgg卿aaacggacg卿2280cccccgatgagggactca犯ccacaggcggcsgcgtcg犯cga犯ctgtcgccga柳gc2340ctgaaccacaggtggt卿gtcgaiacgfigaccaccgaagaagaactcgaaccac鄉(xiāng)cgg2400tagaggcgaacgaaaccgcccctg犯gaactcgaatccatcgacggtattggtcccacat2460acgc卿gcgccttgcctcggtggg組肌cgtcggtgtctgggttggctgcggccgacc2520catcggagattgccgcaeiccatcgacgtgccggtctcacgeigtg3ccgcgtgggttgaac2580aggcatccgaccgcaccgatctaatcgttttttcgacgtgagacagggagt2640accgggatttttgcg兆ccg肌tcacacggtccgtacagctcccgettgtgtggtacctgg2700犯ctccg犯tggccatgccgacccatcacg8tgaggtcg3tgtcctcatcctccgtgtac2760tcgagaatgacctcgtgcgggataccccgc2799權(quán)利要求1、一種蛋白，由亞基1和亞基2構(gòu)成所述亞基1是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的多肽；所述亞基2是如下(c)或(d)的多肽(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(d)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(c)衍生的多肽。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列3中自5'末端第580-2603位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pWL102的多克隆位點插入序列表中序列3自5'端第411-2687位脫氧核苷酸所示的DNA分子得到的重組載體。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是通過將權(quán)利要求4或5所述重組載體導(dǎo)入極端嗜鹽古菌//a/o/eraxme^toraweZ中得到的；所述極》瑞嗜鹽古菌//a/07feraxmec"errawe/優(yōu)選為豐及端嗜鹽古菌//a/o々raxwetZ/terrfl"e/CGMCC1.2087。7、一種過量表達(dá)聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶的方法，是利用權(quán)利要求6所述的重組菌得到過量表達(dá)的與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶。8、一種提高極端嗜鹽古菌聚羥基丁酸戊酸共聚酯產(chǎn)量的方法，是利用權(quán)利要求6或7所述的過量表達(dá)聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)酶的極端嗜鹽古菌，生產(chǎn)聚羥基丁酸戊酸共聚酯。9、一種重組極端嗜鹽古菌，是滅活極端嗜鹽古菌//fl/o/erax附M/^tw^'CGMCC1.2087中的權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因得到的重組菌。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組極端嗜鹽古菌，其特征在于所述重組極端嗜鹽古菌是缺失極端嗜鹽古菌i/a/o/eraxmectterra"e/CGMCC1.2087的基因組中的序列表序列3的自5'端第543-2056位核苷酸序列或其部分序列得到的。全文摘要本發(fā)明公開了一種與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白的編碼基因為如下1)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列3中自5′末端第580-2603位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。本發(fā)明所提供的極端嗜鹽古菌中與聚羥基丁酸戊酸共聚酯合成相關(guān)的酶及其編碼基因，能夠用于通過基因工程提高嗜鹽古菌的聚羥基丁酸戊酸共聚酯及其衍生物的合成效率，使聚羥基丁酸戊酸共聚酯產(chǎn)量提高，適合于工業(yè)生產(chǎn)。文檔編號C12N1/21GK101525599SQ200810101529公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者華向,陸秋鶴,靜韓申請人:中國科學(xué)院微生物研究所