專利名稱：：鑒定西花薊馬的巢式pcr方法及特異引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種能夠特異鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及特異引物。技術(shù)背景西花薊馬是一種世界性的危險(xiǎn)性害蟲，起源于北美洲西部山區(qū)，最早記載于1895年，曾是美國加州最常見的一種薊馬，近年來侵入中國部分地區(qū)，被國內(nèi)有關(guān)專家確定為危險(xiǎn)性外來入侵害蟲。西花薊馬直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等葉片、花器或果面上留下疤痕及斑點(diǎn)。此外，西花薊馬還能傳播番茄斑點(diǎn)萎蔫病毒等在內(nèi)的多種病毒，且在若蟲取食植物30分鐘后即可獲毒，然后主要由成蟲傳播。目前已知其寄主植物多達(dá)500余種，包括重要的菊科、葫蘆科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是溫室種植的花卉、茄果類植物受害最重，因此采取措施防止西花薊馬對(duì)植物的危害非常迫切。但由于其卵、若蟲、成蟲都有很強(qiáng)的隱蔽性，對(duì)藥劑容易產(chǎn)生抗藥性，而常規(guī)的防治措施難以奏效，所以在防治及檢疫工作中，早期鑒定出西花薊馬并提早防治非常有現(xiàn)實(shí)意義。目前為止，薊馬種類的鑒定主要以雌成蟲的形態(tài)特征為主，但是西花薊馬的成蟲體色具多態(tài)性---黑色、褐色和黃色，同時(shí)薊馬的若蟲、蛹無法通過形態(tài)鑒定到種，目前也有對(duì)未成熟時(shí)期的卵、若蟲或蛹進(jìn)行分類的研究，但仍在研究階段，尚無明確定論。然而在植物檢疫過程當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本為若蟲時(shí)，通常須繼續(xù)飼養(yǎng)至成蟲才能夠鑒定。這樣，不僅耗時(shí)，且蟲體微小，常常在飼養(yǎng)過程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要開發(fā)一種快速、簡單且準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)分子標(biāo)記技術(shù)，能很好地解決這些問題。近年來，利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別昆蟲種類的研究非常多，可利用的標(biāo)記技術(shù)也非常多，但由于分析樣品的特殊性，對(duì)于選擇哪種分子標(biāo)記技術(shù)卻很重要。在DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用過程中，若所研究的昆蟲DNA資料未知的情況下，利用RAPD-PCR技術(shù)是最簡便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各種保存方式的標(biāo)本，也可做特定害蟲的快速鑒定(DeBarroPJ,DriverF.UseofRAPD-PCRtodistinguishtheBbiotypefromotherbiotypesofBemisiatabaci(Gennadius)(Hemiptera:Aleyrodidae).AustrilianJournalofEntomology.1997,36(2):149-152;GarnerKJ，SlavicekJM.IdentificationandcharacterizationofaRAPD-PCRmarkerfordistinguishingAsianandNorthAmericangypsymoths.JournalofInsectMolecuarandBiology,1996,5(2):81-91;HaymerDandMclnnisD.ResolutionofpopulationsoftheMediterraneanfruitfly，Ceratitiscapitata,attheDNAlevelusingrandomprimersforthepolymerasechainreaction.Genome1994,37:244-248)。然而這種鑒定技術(shù)的開發(fā)需要收集完整的鑒定樣品作為對(duì)照，否則無法建立完整的分子標(biāo)記技術(shù)；為彌補(bǔ)樣品不足的缺陷，直接由已知序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測目的基因，不失為一有用的方法。根據(jù)文獻(xiàn)18S和28SrDNA在所有生物中具有功能上和進(jìn)化上的同源性，其整體結(jié)構(gòu)和核酸序列在物種間非常保守，再加上中間包含保守區(qū)和變異區(qū)，適合于不同層次上的分類分析(HillisDMandDixonMT.RibosomalDNA:molecularevolutionandphylogeneticinference.QuarterlyReviewofBiology,1991，66，411-453;Cruickshank肌Molecularmarkersforthephylogeneticsofmitesandticks.SystematicandAppliedAcarology.2002,7:3-14)。然而在實(shí)際的分類鑒定實(shí)驗(yàn)中，由于我們得到的標(biāo)本量少至單頭蟲體，而薊馬體形微小，單頭提取的DNA濃度很低，即使運(yùn)用上述分子鑒定方法，也經(jīng)常因?yàn)槟０辶刻俣硅b定工作難以順利進(jìn)行。有研究者以線粒體DNA為分析模板，設(shè)計(jì)出特異鑒定出西花薊馬的特異引物，但由于線粒體DNA在細(xì)胞中含量較低，在實(shí)際鑒定實(shí)驗(yàn)中需要3-4頭蟲體才能完成鑒定(周力兵，劉忠善，李春艷，丁元明PCR法鑒定西花薊馬，植物檢疫，2007，21(2):78-81)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白及存在的問題，本發(fā)明提供一種能快速、精確鑒定出西花薊馬的巢式PCR方法以及一對(duì)能特異鑒定出西花薊馬的PCR引物。一種鑒定西花薊馬的特異引物F1、F2，其序列為Fl:5,陽GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3'，F(xiàn)2:5'陽GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應(yīng)分兩步，第一步以rDNA為模板用通用引物擴(kuò)增出18S至28S區(qū)段，第二步反應(yīng)以第一步PCR產(chǎn)物為模板，用特異引物Fl、F2擴(kuò)增西花薊馬特有的片段。所述通用引物為CS249，CS250,其序列分別為CS249:5，-TCGTAACAAGGTTTCCG-3，。CS250:5'-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3，。所述巢式PCR方法是雙管巢式PCR反應(yīng)或單管巢式PCR反應(yīng)。所述巢式PCR方法是單管巢式PCR反應(yīng)。經(jīng)過同源比對(duì)分析西花薊馬與花薊馬之間高度保守的18S和28SrDNA區(qū)間，搜尋到變異區(qū)段，根據(jù)變異區(qū)段的序列信息設(shè)計(jì)出一對(duì)能特異地?cái)U(kuò)增出西花薊馬的特異引物F1、F2，因此本發(fā)明應(yīng)用通用引物通過巢式PCR第一步反應(yīng)將18S部分+ITSl+5.8S+ITS2+28S部分從基因組中大量擴(kuò)增出來，然后在此基礎(chǔ)上應(yīng)用特異引物F1、F2進(jìn)行巢式PCR第二步反應(yīng)，避免了特異引物F1、F2擴(kuò)增基因組別的區(qū)段，使鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確，提高了所設(shè)計(jì)引物的專一性。由于本發(fā)明所要鑒定的西花薊馬，非常難于獲得大量的樣本，很多時(shí)候少至單頭，所以提出的DNA量極少，rDNA在細(xì)胞中含量高，容易獲得，以rDNA作為分析的材料，以通用引物擴(kuò)增出18S至28S區(qū)段作為次級(jí)模板，再利用特異引物特異性擴(kuò)增西花薊馬，即使只有一只蟲體也能順利鑒定出西花薊馬，而不像利用線粒體DNA作模板時(shí)需要3—4頭蟲體才能完成檢測。另外在本發(fā)明中，巢式PCR由常規(guī)的雙管反應(yīng)演變出了單管反應(yīng)，單管反應(yīng)對(duì)于實(shí)際的鑒定操作的快速、準(zhǔn)確性提供了進(jìn)一步的保證，特別是在海關(guān)檢疫或者植物病害診斷中，準(zhǔn)確性和高效率常常很重要，單管巢式反應(yīng)可以避免倒換樣品時(shí)造成模板污染和時(shí)間浪費(fèi)。綜上所述，本發(fā)明提供了一種巢式PCR方法和一對(duì)特異引物，以薊馬的rDNA為分析模板，能將少至一頭的西花薊馬從與其親緣關(guān)系極近的薊馬種類中，高效、準(zhǔn)確地鑒定出來，為植物病害診斷、海關(guān)檢疫、生物分類研究等工作提供了一種實(shí)用的技術(shù)。圖l.雙管巢式PCR第一步反應(yīng)F01是西花薊馬的若蟲、F02是西花薊馬的成蟲；FI1是花薊馬的若蟲、FI2是花薊馬的成蟲。圖2.雙管巢式PCR第二步反應(yīng)。F01是西花薊馬的若蟲、F02是西花薊馬的成蟲；FI1是花薊馬的若蟲、FI2是花薊馬的成蟲。圖3.采用與雙管巢式PCR相同的兩套引物對(duì)西花薊馬成蟲和若蟲、花薊馬的成蟲和若蟲、黃胸薊馬的成和若蟲、煙薊馬的成蟲和若蟲、塔六點(diǎn)薊馬成蟲進(jìn)行單管巢式PCR鑒定。C14、H6、Q2為西花薊馬的成蟲，Bll西花薊馬的若蟲，E17、E2花薊馬的成蟲，Q10花薊馬的若蟲，R2、R18黃胸薊馬的成蟲，Rl黃胸薊馬的若蟲，T21、Sl、S2煙薊馬的成蟲，SH3煙薊馬的若蟲，Ol是塔六點(diǎn)薊馬。圖4.設(shè)計(jì)特異引物的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5.西花薊馬與花薊馬18S-28SrDNA序列比對(duì)分析。1至44號(hào)區(qū)間為薊馬18SrDNA保守區(qū)域；45至891號(hào)區(qū)域?yàn)镮TS1;892至1067為5.8S區(qū)域；編號(hào)1068至1421為ITS2區(qū)域；1422至1485為28S區(qū)域。具體實(shí)施方式實(shí)施例1雙管巢式PCR步驟l特異引物設(shè)計(jì)搜索GENBANK中西花薊馬與其親緣關(guān)系較近的花薊馬、黃胸薊馬、煙薊馬、塔六點(diǎn)薊馬的18S與28S區(qū)段，用DNAman進(jìn)行同源比對(duì)，根據(jù)其變異區(qū)段序列信息設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Fl、F2(圖4)。步驟2形態(tài)分類并飼養(yǎng)從田間不同寄主上采集薊馬成蟲，帶回室內(nèi)單頭詞養(yǎng)收集各自的后代，一部分進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以區(qū)分種類，一部分作為分子鑒定的材料。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定有如下種類西花薊馬foc"We"tofoPergande、花薊馬i^'"/omaTrybom、黃胸莉馬7!/zawarte"57'sMorgan、'煙薊馬Ito6a"'Lindeman禾口i荅六點(diǎn)薊馬Sco/oAnjwtofcz/zos/z//步驟3單頭DNA提取方法利用百泰克科技有限公司DNA提取試劑盒(CA^DP1201)說明書結(jié)合西花薊馬體小，組織量少的情況，將其步驟改成如下所述-1)往1.5ml的離心管內(nèi)加60uL的裂解液，將裝有裂解液的離心管置于-2(TC的冰箱內(nèi)，迅速冷凍5分鐘至裂解液呈堅(jiān)硬冰塊狀；2)挑取1頭西花薊馬置于冰塊上，用燒鈍的黃槍頭迅速研磨薊馬蟲體，搗碎蟲體成黏糊狀；3)往黏糊狀液體中加入蛋白酶K1.75uL，蓋上管蓋將管放到旋渦震蕩器上震蕩片刻，混勻裂解液，然后于55。C水浴過夜；4)將離心管從水浴鍋中取出室溫冷卻至室溫，然后往里面加入RNA酶(10mg/mL)1.0uL并混勻，再在37'C中水浴30分鐘；5)再將離心管取出冷卻至室溫，加入蛋白沉淀液20ul，置于旋渦震蕩器上震蕩25秒鐘后，放入冰盒中冰浴15分鐘；6)然后將離心管放到離心機(jī)中13000轉(zhuǎn)/秒離心5分鐘；7)小心取上清于另一新離心管中，注意不要吸取到沉淀；8)向裝有上清的離心管中加入等體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻30次，靜止5分鐘；9)再12000轉(zhuǎn)/秒離心10分鐘，棄上清；10)往離心管內(nèi)加入lmL70。/。乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000轉(zhuǎn)/秒離心2分鐘，棄上清；611)再加llmL無水乙醇，漂洗DNA沉淀，再12000轉(zhuǎn)/秒離心2分鐘，棄上清。將離心管室溫自然晾干；12)加入15uLDNA溶解液并65X:水浴1小時(shí)溶解DNA;13)-2(TC冰箱內(nèi)長期保存。步驟4第一輪PCR反應(yīng)采用Moritz等2001年的文章(MoritzQDelkerC,PaulsenM，MoundLAandBurgermeisterW.ModernmethodsforidentificationofThysanoptera.OEPP/EPPOBulletin.2000,30:591-591)中記載的通用引物CS249(5-TCGTAACAAGGTTTCCG-3)和CS250(5'-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3')，以西花薊馬和花薊馬的基因組DNA為模板擴(kuò)增rDNA的18S至28S區(qū)間，反應(yīng)體系見表l-l:表1-1基因組DNA2.0(xLdNTPs(2.0mmo,)2單10xPCRBuffer2.5|uLMg2+(25醒ol/(xL)TaqEnzyme(5U/pL)O單MilliQH2011.5nL引物CS249(20pmoles)2.0ul引物CS250(20pmoles)2.0ul總體積定容至25^L反應(yīng)程序95。C2分鐘；94。Cl分鐘，55'C1分鐘，72°C2分鐘，共25個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。10pL上述產(chǎn)物直接跑1%瓊脂糖，并回收直接送測序公司測序，驗(yàn)證第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物是18S至28S區(qū)段之間的序列。如圖1所示，西花薊馬和花薊馬都在1.4kb處有一條帶，測序結(jié)果驗(yàn)證所擴(kuò)產(chǎn)物為rDNA的18s至28s之間的序列(圖5)。步驟5第二輪PCR反應(yīng)在另一個(gè)per反應(yīng)管中加入表1-2的反應(yīng)混合液。表1-2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)程序95°C2分鐘；94°Cl分鐘，62°C40秒，72°C40秒，共25個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。產(chǎn)物7pL跑1%瓊脂糖電泳。檢測結(jié)果顯示只在西花薊馬的模板中檢測出條帶(圖2).實(shí)施例2單管巢式PCR所需試劑、引物、形態(tài)分類步驟等與實(shí)施例l相同，以西花薊馬的成蟲和若蟲、花薊馬的成蟲和若蟲，黃胸薊馬的成蟲和若蟲、煙薊馬的成蟲和若蟲、塔六點(diǎn)薊馬成蟲的基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系和步驟改為表2-1至表2-2所述。第一輪PCR反應(yīng)體系如表2-1:表2-l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</table反應(yīng)程序95°C2分鐘；94°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C2分鐘，共10個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。第二輪PCR反應(yīng)向第一輪反應(yīng)產(chǎn)物中直接加入如表2-2的反應(yīng)混合液。表2-2dNTPs(2.0mmol/nL)6.25&10xPCRBufferMg2+(25mmol/nL)5攀TaqEnzyme(5U/|iL)1.25|iLMilliQH2028.75^iL引物Fl(20pmoles)5.0ul引物F2(20pmoles)5.0ul總體積定容至57.5fiL反應(yīng)程序95°C2分鐘；94°C1分鐘，62°C40秒，72°C40秒，共22個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。產(chǎn)物7pL跑1%瓊脂糖電泳分析結(jié)果。檢測結(jié)果表示該引物只在西花薊馬的模板中擴(kuò)展出條帶，與其親緣關(guān)系最近的花薊馬，以及其它親緣關(guān)系較近的薊馬中都沒有擴(kuò)增出條帶，說明該方法能靈敏，準(zhǔn)確地鑒定出西花薊馬，發(fā)明提供的特異引物具有鑒定西花薊馬的專一性(圖3)。單管巢式反應(yīng)節(jié)省了中間檢測以及倒換反應(yīng)管的步驟，使鑒定反應(yīng)更為準(zhǔn)確和快速。附錄-序列表SEQNO.lFl:5'隱GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3'SEQNO.2F2:5'隱GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3，權(quán)利要求1.一種鑒定西花薊馬的特異引物F1、F2，其序列為F15’-GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3’，F(xiàn)25’-GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。2.—種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應(yīng)分兩步，第一步以rDNA為模板用通用弓嗽擴(kuò)增出18S至28S區(qū)段，第二步反應(yīng)以第一步PCR產(chǎn)物為模板，用權(quán)利要求1中的特異引物F1、F2擴(kuò)增西花薊馬特有的片段。3.權(quán)利要求2所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述通用引物為CS249，CS250，其序列分別為CS249:5，-TCGTAACAAGGTTTCCG-3，，CS250:5，-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3，。4.權(quán)利要求2所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是雙管巢式PCR反應(yīng)或單管巢式PCR反應(yīng)。5.權(quán)利要求4所述的一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，所述巢式PCR方法是單管巢式PCR反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及到一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法及其特異引物。一種鑒定西花薊馬的巢式PCR方法，其特征是PCR反應(yīng)分兩步，第一步以rDNA為模板用通用引物擴(kuò)增出18S至28S區(qū)段，第二步反應(yīng)以第一步PCR產(chǎn)物為模板，再根據(jù)18S至28S區(qū)間變異區(qū)段序列設(shè)計(jì)的特異引物F1、F2，進(jìn)行第二輪反應(yīng)，擴(kuò)增西花薊馬特有的片段，兩輪PCR反應(yīng)提高了鑒定的準(zhǔn)確性，改進(jìn)為單管巢式PCR后，提高了鑒定效率，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的特異引物能在親緣關(guān)系很近的模板之間準(zhǔn)確地鑒定出西花薊馬。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101245391SQ200810102530公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年3月24日優(yōu)先權(quán)日2008年3月24日發(fā)明者吳青君,張友軍,張治軍,徐寶云申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所