專利名稱：：一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法及試劑盒，更具體地說是通過測定人促血管生成素-1(angi叩oietin1;ANGPT1)多態(tài)性位點(diǎn)3379A/T預(yù)測受試者對于出血性腦卒中的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)和基因診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：我國在世界上是腦卒中的大國。2003年全球每年死亡5702萬人，約1%的死亡率。由于心腦血管病死亡1673萬，約占所有死亡的1/3;心腦血管疾病中，550萬死于腦卒中，亦約占l/3;而其中420萬在發(fā)展中國家，其中約一半(200萬)是在中國。中國初發(fā)腦卒中的發(fā)病率已接近發(fā)達(dá)國家水平(中國115.61-219/100000/年；發(fā)達(dá)國家130-410/1OOOOO/年)。來自世界衛(wèi)生組織(WHO-MONICA，1994-2003年)的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，目前心腦血管病占我國總死亡原因的40.7%，并呈逐年上升趨勢。中國殘存腦中風(fēng)患者700萬，冠心病200萬，每年新的與復(fù)發(fā)的腦中風(fēng)300萬，心臟病50萬。60歲以上，每5個中有一個患冠心病或腦中風(fēng)。每6個患者中有一個以"猝死"為"首發(fā)，唯一也是最終"的臨床表現(xiàn)；每3個心梗中有一個無癥狀或不典型。心腦血管病也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)(我國心腦血管病每年耗費(fèi)至少約3000億元人民幣)。中國人與西方人群腦卒中的病理類型構(gòu)成有明顯不同。西方以缺血性腦卒中為主(約占腦卒中的80%)，出血性腦卒中少見；而中國人出血性腦卒中與缺血性腦卒中的發(fā)病平分秋色。出血性腦卒中，又稱為腦中風(fēng)或腦血管意外，是一組以腦部出血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，具有發(fā)病急，病死率高等特點(diǎn)，同時(shí)也是致殘率最高的疾病，75%的卒中病后患者有不同程度的殘疾。能夠找到出血性腦卒中疾病的早期預(yù)測標(biāo)記，具有非常明顯的意義。出血性腦卒中的發(fā)生是基因遺傳傾向和一系列環(huán)境危險(xiǎn)因素長期作用的結(jié)果所導(dǎo)致的，正常血管內(nèi)的維護(hù)修復(fù)能夠?qū)弓h(huán)境危險(xiǎn)因素所造成的血管損傷。目前進(jìn)行出血性腦卒中的遺傳病因研究中，采用單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism)作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法是有效的。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需〉1%，SNP是雙等位基因標(biāo)記。由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNP在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬個。SNP以其密度高，平均每lkb就有1個；代表性強(qiáng)，位于基因內(nèi)部的SNP可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平；遺傳穩(wěn)定性好，同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言；易于自動化分析，因SNP在人群中為雙等位基因標(biāo)記，可簡單以"+/-或1/0"直接分型，成為很好的遺傳標(biāo)志。作為本研究的候選基因，促血管生成素-1(Angiopoietin-l，ANGPT1)是1996年發(fā)現(xiàn)的特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，是受體類酪氨酸激酶Tie-2的特異性配體，與血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)在血管生成過程中有協(xié)同作用，促進(jìn)血管重塑、成熟，維持血管的完整性和調(diào)節(jié)血管功能，同時(shí)還可維持成熟血管中內(nèi)皮細(xì)胞的靜息狀態(tài)和血管的完整。ANGPT1/Tie2還有阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管損傷修復(fù)的功能。由于促血管生成素-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其對于血管生理具有不可忽視的影響。在已知的幾個位于ANGPT1基因上的SNP位點(diǎn)中，處于ANGPT1mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的3379A/T由于處于microRNA204/211的結(jié)合區(qū)域而受到我們的關(guān)注。MicroRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類21—25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框(ORF)。MicroRNA可以與編碼基因的mRNA3'-UTR相結(jié)合，形成不完全的堿基配對，抑制mRNA的表達(dá)或是促進(jìn)mRNA的降解。MicroRNA廣泛地參與了生長發(fā)育的全過程，包括干細(xì)胞分化、血細(xì)胞形成、心臟和骨骼肌發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、胰島素分泌、膽固醇代謝和免疫應(yīng)答反應(yīng)等。同時(shí)MicroRNA也涉及一系列的疾病的病理生理過程，包括癌癥和心腦血管疾病等。目前普遍認(rèn)為，大概有30%的人類基因受到MicroRNA的調(diào)控。在MicroRNA與編碼基因的mRNA3，-UTR結(jié)合的過程中，MicroRNA5，端的6~7個堿基對于結(jié)合的特異性起著決定性的作用，因此被稱為"種子序列(seeds叫uence)"。因此與種子序列相對應(yīng)的mRNA序列也就顯得尤為重要，在這個序列內(nèi)發(fā)生的堿基變化將直接影響MicroRNA與編碼基因mRNA的結(jié)合，進(jìn)而影響MicroRNA對基因的調(diào)控，而3379A/T正是處于這個區(qū)域內(nèi)。通過實(shí)驗(yàn)，我們首次證實(shí)，3379A/T確實(shí)可以影響microRNA204/211與編碼基因mRNA的結(jié)合。由于傳統(tǒng)的PCR-酶切分析SNP的方法存在時(shí)間長、可重復(fù)性差、靈敏度低、準(zhǔn)確率低等問題。本發(fā)明中，我們使用了新的LDR-PCR測序分型技術(shù)對SNP3379A/T進(jìn)行分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，該方法通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的ANGPT1基因3379位點(diǎn)(rs2507800)的基因型，預(yù)測受試者對出血性腦卒中的易感性。一種分離核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的堿基序列。本發(fā)明證實(shí)，ANGPT1的3379位點(diǎn)基因型為AA純合子時(shí)，受試者的易感性最高；增加出血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)為1.96倍。一組預(yù)測出血性腦卒中易感性的引物和探針序列(寡核苷酸序列)，能特異性地?cái)U(kuò)增出含ANGPT1基因的3379位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQIDN0.2—SEQIDN0.6所示的堿基序列；其中序列表SEQIDN0.2和SEQIDNO.3所示的堿基序列分別為F引物序列和R引物序列；序列表SEQIDN0.4至SEQIDNO.6所示的堿基序列是LDR探針混合物。以上寡核苷酸序列在一次檢測中同時(shí)使用。一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的試劑盒，由以下試劑組成20ul10XHotStarPCR緩沖液，40ul10mMdNTP混合液，20^1lOOmMMgS04溶液，20ul5unit/ulHotStarDNA聚合酶，各2ul50pmol/ulF和R引物，0.5ul40unit/ulTaqDNA連接酶，10ull0XTaqDNA連接酶反應(yīng)緩沖液，10ul12.5pmol/ul/eachLDR探針混合物，4ml超純水；F和R引物是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的堿基序列；LDR探針混合物是序列表SEQIDNO.4-SEQIDNO.6所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為-20。C。所述的LDR探針序列SEQIDNo.4的5'端磷酸化，3'端標(biāo)記熒光染料FAM。本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明首次闡明了ANGPT1基因多態(tài)性位點(diǎn)與出血性腦卒中的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，該方法可用于出血性腦卒中的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。本發(fā)明所采用的LDR法是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對基因多態(tài)性位點(diǎn)的識別。高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。這種方法操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度和準(zhǔn)確率高。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為SNP檢測結(jié)果3種測序圖譜中，圖1-1對應(yīng)SNP3379的AT基因型；圖1-2對應(yīng)SNP3379的AA基因型；圖1-3對應(yīng)SNP3379的TT基因型。具體實(shí)施方式用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下。需要時(shí)，用高壓鍋(120°C，20分鐘)滅菌EDTA:乙二胺四乙酸二鈉SDS:十二垸基硫酸鈉TE:10mMTris-HCl(pH7.5);lmMEDTA(pH8.0)10xPCR緩沖液100mMTris-HCl(pH8.3);500mMKCl;15mMMgCl2dNTP:脫氧核苷三磷酸實(shí)施例l:檢測出血性腦卒中相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒一.試劑盒成分檢測出血性腦卒中相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出ANGPT1基因SNP3379位點(diǎn)的引物對，及其LDR-PCR相應(yīng)試劑，成分和含量如下，于一20°C保存_表1:PCR擴(kuò)增試劑(10人份):<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>dNTP混合液lOmM40ulQIAGENMgS04lOOmMQIAGENHotStarDNA聚合酶5unit/ul2ulQIAGENF引物50pmol/ul2ul北京奧科R引物50pmol/ul2ul北京奧科超純水3ml自制10XHotStarPCR緩沖液100mMTris-HCl(pH8.3),500mMKC1,15mMMgCl2，100嗎/mlBSA。10mMdNTP混合液dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM。F引物序列和R引物序列分別為序列表SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的堿基序列。_表2:LDR檢測試劑(IO人份)_組分_^_^_^_TaqDNA連接酶緩沖液10X10ulNEBTaqDNA連接酶40unit/ul0.5ulNEB探針混合物12.5pmol/ul/each10ul上海翼和超純水_^__LDR探針混合物是序列表SEQIDN0.4至SEQIDN0.6所示的堿基，其中SEQIDN0.4的5'端磷酸化，3'端標(biāo)記熒光染料FAM。二.使用方法1.通過PCR擴(kuò)增含有所檢測的SNP位點(diǎn)的DNA片段(1)PCR系統(tǒng)(20uL體系)表3:PCR系統(tǒng)(20uL體系)組分_^_模板(實(shí)施例2制備)lug/ullulHotStarPCR緩沖液10X2uldNTP混合液10mM2ulMgS04100mM0.6^1HotStarDNA聚合酶5unit/ul0.2ulF引物R引物超純水50pmol/ul50pmol/ul0.2ul0.2ul14.4ul35個循環(huán)F引物5，-TGGCAACTAGCAGTCAGAATTT-3'(SEQIDNo.2)R引物5，-TGGAATATGCAACATTGTCCTT-3，(SEQIDNo.3)(2)PCR反應(yīng)參數(shù)95°C15分鐘'94。C30秒65°C1分鐘.72°C1分鐘72°C7分鐘PCR儀PERKINELMERGeneAmpPCRsystem9600;MJPTC-200Gradientcyclero(3)PCR產(chǎn)物檢測用3y。的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察PCR反應(yīng)的效果，并確定其作為模板在LDR反應(yīng)中加入的量。PCR產(chǎn)物的序列為序列表SEQIDNo.l所示核苷酸序列。2.通過LDR反應(yīng)測定ANGPT1基因SNP+3379多態(tài)性(1)LDR系統(tǒng)(lOuL體系)表4:LDR系統(tǒng)(10uL體系)組分濃度體積PCR產(chǎn)物TaqDNA連接酶緩沖液TaqDNA連接酶探針混合物超純水1ug/ul10X40imit/ul12.5pmol/ul/eachlullul0.05ullul6.95ml探針混合物如下5，-P-ATATATACAAAAAGAAAATTAATCATTTTTTTTTTTTTTnTnTTTTTTT-FAM-3'(SEQIDN0.4)該序列5'端磷酸化，3'端標(biāo)記熒光染料FAM。'，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCAAAACTATTATATGTAAGGGAA-3'(SEQIDNO.6)(2)LDR反應(yīng)參數(shù)「95°C2分鐘35個循環(huán)j94°C30秒L6(TC2分鐘測序儀ABIPRISM377DNASequencer,ABIPRISM3100DNASequencer。三.試驗(yàn)結(jié)果測序結(jié)果如圖l所示，當(dāng)測序圖中出現(xiàn)雙峰時(shí)，可以確認(rèn)SNP3379基因型為AT;當(dāng)測序圖為單峰，且峰尖值為102時(shí)，可以確認(rèn)SNP3379基因型為AA;當(dāng)測序圖為單峰，且峰尖值為102時(shí)，可以確認(rèn)SNP3379基因型為TT。實(shí)施例2:收集和基因組DNA的提取樣本由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院中德實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的973課題收集的的病例。共計(jì)收集出血性腦卒中患者489例，平均年齡58.0土9.7歲，其中男性占63.2%，對照1843例，平均年齡59.3土8.5歲，其中男性占57.6%。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了倫理委員會批準(zhǔn)。根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA:在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2^NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37"C過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進(jìn)行離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70M的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。實(shí)施例3:ANGPTl基因SNP與出血性腦卒中的相關(guān)性研究一.SNP的識別確定采用實(shí)施例1所述的檢測試劑盒，運(yùn)用LDR-PCR測序分型技術(shù)對ANGPTl基因的SNP3379位點(diǎn)進(jìn)行檢測。二.統(tǒng)計(jì)方法利用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡檢測，數(shù)量變量采用t檢驗(yàn)，質(zhì)量變量采用卡方檢驗(yàn)。雙側(cè)P〈0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異顯著。采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算出血性腦卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)OR值及其95%可信區(qū)間(CI)。三.結(jié)果病例和對照的基本l臨床資料表5:病例和對照的基本臨床資料<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可見，病例組與對照組間在年齡構(gòu)成、血壓、血脂水平、血糖等方面均有顯著差異(PO.Ol)。在體重指數(shù)，性別組成上，對照組和病例組之間差異不顯著。2.SNP3379A/T位點(diǎn)多態(tài)性與出血性腦卒中密切相關(guān)表6:SNP3379A/T位點(diǎn)多態(tài)性與出血性腦卒中相關(guān)性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>AA基因型在出血性腦卒中患者中的分布與對照組有顯著差異(PO.Ol)。在未考慮出血性腦卒中傳統(tǒng)危險(xiǎn)因子的情況下，以T等位基因作對照，A等位基因可使出血性腦卒中的危險(xiǎn)性顯著增加(OR1.96，CI1.48~2.59)。3.多因素Logistic回歸分析基因多態(tài)性與其它危險(xiǎn)因素和腦卒中的關(guān)聯(lián)性Logistic多元回歸分析了出血性腦卒中患者年齡、性別、總膽固醇、甘油三脂、體重指數(shù)、吸煙、糖尿病史、高血壓和ANGPT1基因3379AA基因型對出血性腦卒中的相對危險(xiǎn)度。表7:多因素Logistic回歸分析基因多態(tài)性與其它危險(xiǎn)因素和腦卒中的關(guān)聯(lián)性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在傳統(tǒng)的出血性腦卒中危險(xiǎn)因素中，高血壓會導(dǎo)致出血性腦卒中危險(xiǎn)度增高。在校正了傳統(tǒng)的出血性腦卒中危險(xiǎn)因素以后，與TT基因型相比較后，AA基因型的攜帶者患腦出血的相對危險(xiǎn)度高達(dá)2.365(CI1.5083.710)?？梢?，ANGPT1的3379基因多態(tài)性顯著與出血性腦卒中的易感性相關(guān)。本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1)本發(fā)明的ANG基因多態(tài)性的檢測方法可用于分析ANGPT1基因上的SNP3379位點(diǎn)的多態(tài)性，應(yīng)用在對出血性腦卒中的輔助性診斷和對個體是否有多大的出血性腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。以利于開展出血性腦卒中的早期干預(yù)和治療。2)利用本發(fā)明闡述冠出血性腦卒中心病基因的多態(tài)性，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)ANGPT1表達(dá)的活性分子，促進(jìn)ANG新藥開發(fā)。3)本發(fā)明建立的檢測ANGPT1基因多態(tài)性的核酸序列和出血性腦卒中相關(guān)位點(diǎn)，可高靈敏度、特異性地應(yīng)用于出血性腦卒中基因診斷用的試劑盒。如上所述，得出結(jié)論，ANGPT1基因的多態(tài)性與出血性腦卒中具顯著相關(guān)性。因此，根據(jù)本發(fā)明，測定多態(tài)性可用于進(jìn)行基因診斷。本發(fā)明敘述了ANGPT1基因出血性腦卒中相關(guān)的新突變點(diǎn)，并提供了一種測定ANGPT1基因多態(tài)性的方法。而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測定ANGPT1基因的多態(tài)性。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種測定出血性腦卒中相關(guān)基因多態(tài)性的基因診斷方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><400>2tggcaactagcagtcagaattt22〈210〉3〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3tggaatatgcaacattgtcctt22<210>4〈211〉51<212〉DNA<213〉人工合成〈400>4atatatacaaaaagaaaattaatcatttttttttttttttttttttttttt51〈210〉5〈211〉51〈212〉DNA〈213>人工合成<400>5ttttttttttttttttttttttttttggcaaaactattatatgtaagggag51<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>權(quán)利要求1.一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，其特征在于該方法通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的ANGPT1基因3379位點(diǎn)(rs2507800)的基因型，預(yù)測受試者對出血性腦卒中的易感性位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因型3379AA，增加出血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)為1.96倍。2.—種分離核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的堿基序列。3.—組預(yù)測出血性腦卒中易感性的引物和探針序列(寡核苷酸序列)，能特異性地?cái)U(kuò)增出含ANGPT1基因的3379位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQIDN0.2—SEQIDN0.6所示的堿基序列；其中序列表SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的堿基序列為F和R引物序列；序列表SEQIDNO.4至SEQIDNO.6所示的堿基序列是LDR探針混合物。4.一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成20ullOXHotStarPCR緩沖液，40ul10mMdNTP混合液，20^1lOOmMMgS04溶液，20ul5unit/ulHotStarDNA聚合酶，各2ul50pmol/ulF禾卩R引物，0.5ul40unit/ulTaqDNA連接酶，10ullOXTaqDNA連接酶反應(yīng)緩沖液，10ul12.5pmol/ul/eachLDR探針混合物，4ml超純水；F和R引物是序列表SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的堿基序列；LDR探針混合物是序列表SEQIDN0.4—SEQIDN0.6所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為-20。C。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的試劑盒，其特征在于所述的LDR探針序列SEQIDNo.4的5'端磷酸化，3'端標(biāo)記熒光染料FAM。全文摘要本發(fā)明公開了一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)和基因診斷領(lǐng)域。一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，通過提取宿主細(xì)胞基因組DNA，測定受試者的ANGPT1基因多態(tài)性3379位點(diǎn)(rs2507800)的基因型，預(yù)測受試者對出血性腦卒中的易感性ANGPT1基因型為AA純合子時(shí)，受試者的易感性最高；增加出血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)為1.96倍。本發(fā)明中ANGPT1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)具有SEQIDNO.1所示的核酸序列位點(diǎn)，是與出血性腦卒中發(fā)病相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)之一。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次闡明了ANGPT1基因多態(tài)性位點(diǎn)與出血性腦卒中的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測出血性腦卒中易感性的方法，該方法可用于出血性腦卒中的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。文檔編號C12N15/11GK101245392SQ200810102698公開日2008年8月20日申請日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日發(fā)明者凱孫,張禪那,惠汝太,濤楊,毅石,陳敬洲申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院