專利名稱：：檢測pou3f4基因499c>t突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于檢測POU3F4基因4990T突變基因的試劑盒。本發(fā)明還涉及新的POU3F4突變基因及其診斷和/或治療人類遺傳性耳聾的應用。
背景技術：
：遺傳性聾分為非綜合征型耳聾(nonsyndromichearingimpairment，NSffl)和綜合征型耳聾(syndromichearingimpairment,SHI)。全部NSHI和絕大部分SHI是孟德爾遺傳單基因病，極少部分SHI是染色體病。耳聾是導致交流障礙最常見的疾病。估計全世界約有7億人口聽力損失至少達55dB，其中，學語前聾是常見的發(fā)病形式，也是社會影響較重的一類，發(fā)病率為1/1000，約半數(shù)是遺傳因素所致，此人群已超過27/萬，其中70。/。是NSHI，3(f/。是SHI。遺傳性聾在16世紀就有文獻記載，但由于內耳部位深，體積小，研究手段受到限制，因此認識和理解控制聽覺系統(tǒng)的基因研究進展很慢。近10多年來，隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展及分子生物學、遺傳學的飛速發(fā)展，人們對遺傳性聾的認識不斷加深，并取得了顯著進步。X-連鎖遺傳NSHI以DFN表示，已報道8型(DFN1DFN8)，DFN2、DFN4、DFN63型已基因定位，DFN1和DFN3已基因克隆。DFN1在兒童早期開始進行性聽力下降，以后可合并進行性肌張力障礙、痙攣、吞咽困難、精神障礙、偏執(zhí)狂、皮質盲，該型耳聾實質上屬于SHI，因疾病早期僅出現(xiàn)聽力受損，遺傳性聾分型時被納入了NSHI。DFN3是X-連鎖遺傳NSHI最常見的類型，臨床表現(xiàn)為伴有鐙骨固定的混合性聾，神經(jīng)性聾呈進行性下降，內耳道和前庭異常擴大，小耳蝸，半規(guī)管半徑變小，高分辨CT掃描可發(fā)現(xiàn)內耳道異常擴大、蝸軸異常、蛛網(wǎng)膜下腔與外淋巴腔直接相通，鐙骨底板切除或卵圓窗開窗后發(fā)生外淋巴液"井噴"，有導致全聾之虞，為手術禁忌。DFN1和DFN6在兒童期開始出現(xiàn)進行性高頻感音神經(jīng)性聾，成年后可達累及全頻率的中深度聾。X-連鎖遺傳NSHI女性攜帶者多表現(xiàn)為不完全顯性，成年后可出現(xiàn)輕-中度聽力受損，可進行性加重。根據(jù)Shine和Watson在1967年的報道，在一個夏威夷-華裔家系的兩代人中，9個個體患有傳導性耳聾、前庭系統(tǒng)障礙，術中發(fā)現(xiàn)鐙骨底板固定。當鐙骨底板活動后，大量的外淋巴和腦脊液涌出，提示耳蝸導水管異常開放。Nanceetal.(1970,1971)在歐洲觀察到一個相似的家系，在這個家系中，聽力下降為混合型。Phelps等(1991)研究了7個X連鎖形式的耳聾家系，多數(shù)患者內聽道的末端膨隆和內聽道末端與耳蝸基底轉之間的骨質缺損。Phelpsetal.(1991)認為這是由于內聽道蛛網(wǎng)膜下腔間隙和耳蝸外淋巴之間的交通導致了外淋巴"水腫"，如果鐙骨受擾，則會出現(xiàn)鐙井噴。一些女性攜帶者表現(xiàn)較為輕微。deKok等(1995)總結了DFN3的特征，指出耳聾為鐙骨固定引起的傳導性耳聾和進行性的感音神經(jīng)性聽力下降引起的混合型，有時極重的感音神經(jīng)性聾會掩蔽傳導性成分。CT掃描顯示內聽道異常擴張和內聽道與內耳之間的異常溝通，因此形成了在打開鐙骨底板時出現(xiàn)鐙井噴的原因。Bitner-Glindzicz在POU3F4基因發(fā)現(xiàn)了特殊的突變，他認為DFN3應以極重的感音神經(jīng)性聾伴或不伴傳導成分，伴隨獨特的耳發(fā)育障礙為特征，極重度的感音神經(jīng)性聾是這種疾病的必要條件。Douville等(1994)報道小鼠的基因Brain-4(Pou3f4)編碼一種轉錄因子定位在Plp和DXMit6標記之間，這一區(qū)域在小鼠和人類的染色體高度保守，因此提示人類POU3F4基因位于Xql3-q22之間。POU3F4在小鼠中的同源基因——RHS2，在胚胎發(fā)育過程中，受孕后15.517.5天在腦、神經(jīng)管和聽泡表達，因此胚胎早期它的定位和空間/時間表達模式上都提示是X連鎖混合型聽力下降伴外淋巴井噴的候選基因。在5位無關的DFN3患者中，deKoketal發(fā)現(xiàn)了2個錯義突變和2個無義突變，這些突變導致了蛋白截短或非保守氨基酸替代。而在50位對照者中沒有發(fā)現(xiàn)POU3F4基因突變。說明POU3F4突變是DFN3的分子基礎。由POU3F4基因突變導致的X-連鎖遺傳的耳聾曾有多個家系的報道，包括一個中國家系，家系患者具有特征性的臨床表現(xiàn)，該基因是一個值得關注的耳聾相關基因。目前尚無關于在耳聾患者中發(fā)現(xiàn)POU3F4基因4990T突變的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的在于提供用于檢測POU3F4突變(499C>T)基因的試劑盒。本發(fā)明將為在中國耳聾人群，特別是X連鎖遺傳形式的先天性聾椏患者中開展耳聾基因篩查提供方便確實的方法；并為將來利用這一突變作為靶點開展耳聾的基因治療提供堅實的基礎。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種人類遺傳性耳聾相關基因的檢測試劑盒。所述檢測方法為通過檢測來自于患者的待測樣本中是否存在POU3F4基因499C>T突變(R167X)，而判斷該患者的耳聾發(fā)生原因及類型。其中，所述R167X是指POU3F4基因的4990T堿基改變引起表達產(chǎn)物Brn-4蛋白的編碼終止于167位氨基酸，不成熟的表達產(chǎn)物誘導啟動體內調節(jié)機制，使變異的mRNA降解。發(fā)明人應用候選基因篩査的方法在一個中國X連鎖遺傳的先天性極重度聽力下降家系中發(fā)現(xiàn)與X連鎖遺傳性耳聾相關的POU3F4基因新的突變位點——4990T(R167X)。在這個X連鎖遺傳的耳聾家系中，先證者(男性)和其舅舅(先天性極重度聽力下降)以半合子存在，先證者的母親，姨媽和外婆均為攜帶者，未發(fā)病，突變與耳聾共分離，說明該突變位點是導致耳聾的原因。目前中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個由該基因突變導致的先天性極重度聽力下降家系，說明了該基因的突變在先天性極重度聽力下降患者中比較常見，具有重大研究意義。目前，國際上尚無P0U3F4基因499OT(R167X)突變的報道。圖1給出POU3F4編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對照圖，并示出突變位點(方框標記處)，該突變位于POU3F4基因的499位堿基，原有的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?OT)，使得原有編碼精氨酸的密碼子CGA變?yōu)榻K止密碼子UGA(方框標記處)，突變發(fā)生后基因表達產(chǎn)物產(chǎn)生一個僅有167個氨基酸的短肽鏈，原有的兩個重要結構域(DNA特異性結構域和同源結構域)均喪失，也因此失去了轉錄因子的功能。檢測該突變可用本領域的任何檢測點突變的方法來進行，例如PCR(聚合酶鏈反應)一測序法、采用標記的POU3F4基因DNA探針雜交法或用限制性片段長度多態(tài)性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發(fā)明的一個實施方案中，采用PCR擴增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟1)采集待測個體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA;2)以該DNA為模板，以針對POU3F4基因或POU3F4基因第499位堿基附近的編碼區(qū)設計的PCR引物進行PCR反應，得到PCR擴增產(chǎn)物；3)將得到的PCR產(chǎn)物進行直接測序分析，將所得到的序列與POU3F4正常基因的序列進行比較，確定是否存在POU3F4突變位點。4)根據(jù)以上結果判斷待測個體是否為POU3F4基因突變4990T導致的遺傳性耳聾。進一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進行翻譯以確定是否存在R167X氨基酸突變位點。在發(fā)明人進行的實驗中，收集耳聾遺傳資源，建立遺傳性耳聾資源庫。通過聾病門診收集各種感音神經(jīng)性耳聾患者，在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，并建立門診病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中的發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后，應用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20。C保存，每份DNA樣品均詳細對應于登記的患者臨床資料。然后，應用在線引物設計軟件Primer3設計引物，包含POU3F4整個編碼區(qū)，應用PCR擴增。PCR產(chǎn)物直接測序測序引物與PCR擴增引物相同，正反向測序，應用ABI公司3730DNA測序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號Z82170)比較確定POU3F4突變位點。按正常閱讀框進行翻譯以確定POU3F4的突變位點。上述步驟2所得到的PCR反應產(chǎn)物還可以用雜交探針來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的POU3F4核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發(fā)色物質或熒光物質標記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩査是否存在已被確定的突變。在上述方法中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的核苷酸序列設計，通常為1530個堿基，GC含量為4550%左右，在適當?shù)臏囟认屡c末端特異性結合，其可以利用專門的計算機程序設計。在本發(fā)明的一個具體實施例中，應用引物設計軟件設計了一對PCR引物，其序列為上游引物POU1-F:5'匿TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5，國GAACCTGCAGATGGTGGTCT匿3，(nt87773-nt87792)POU3F4正?；虻臉藴市蛄锌梢詤⒖祭鏕enbank:Z82170。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明進一步提供了用于檢測POU3F4基因4990T突變的試劑盒，試劑盒中可以包含以下試劑用于擴增樣本DNA中POU3F4基因或POU3F4基因第499位堿基附近編碼區(qū)的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；PCR反應試劑；對PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序的試劑。例如，本發(fā)明的一個實施方案中提供一個檢測POU3F4基因4990T突變的試劑盒，容器內裝有用以檢測P0U3F4基因499OT突變的成分，與之同時提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機構審核的、有關藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴增后，直接檢測樣品中POU3F4基因4990T突變位點的試劑盒，可含有擴增引物、dNTPs、用于PCR反應的DNA聚合酶及其緩沖液、或測序反應所需試劑等的一種或多種。本領域技術人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對PU3-F和PU3-R引物，所述用于PCR反應的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(1)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對POUl-F和POUl-R引物，進行PCR反應；(2)PCR反應產(chǎn)物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標準序列比較確定突變位點的存在；(3)按正常閱讀框進行翻譯以確定是否存在Bm-4氨基酸突變位點。該試劑盒可簡便快捷地檢測POU3F4突變位點，從而應用于耳聾相關基因的檢測和耳聾診斷或治療方法中。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了POU3F4突變基因在診斷或治療人類遺傳性耳聾中的應用。通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在POU3F4基因499C>T突變而判斷該患者的耳聾發(fā)生原因及類型，進而為臨床診斷和治療提供參考；此外，在進一步的臨床治療方面，在檢測為發(fā)生了POU3F4基因4990T突變之后，可以將正常基因導入攜帶突變基因的細胞并在其中表達，它可與內源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進行基因治療。本發(fā)明提出了通過檢測患者中是否存在POU3F4基因新的突變而診斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測方法，這將有利于在臨床上開展耳聾患者，特別是X連鎖遺傳形式的先天性聾啞患者的POU3F4突變篩査工作，為耳聾患者提供診斷和治療服務。下面結合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的說明，詳細描述但不限制本發(fā)明。附圖的簡要說明圖l為POU3F4基因編碼區(qū)氨基酸與核酸堿基的對照突變位于POU3F4基因第499位堿基，用方框圈起來的是突變的堿基和氨基酸，突變后的堿基序列(下劃線部分)使氨基酸的編碼終止于167位氨基酸；圖2為本發(fā)明方法中PCR反應過程示意圖，示出了反應溫度和時間；圖3為本發(fā)明方法中，對PCR產(chǎn)物進行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置；圖4為本發(fā)明方法中POU3F4基因測序結果，上方為野生型序列，中間為女性攜帶者雜合突變序列，下方為患者半合子序列，箭頭所指為4990T突變位點位置。發(fā)明的具體實施方式本發(fā)明所用試驗材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。待測血樣提取與POU3F4基因編碼區(qū)的PCR擴增實施例1一、待測對象血樣DNA的制備1、研究對象一個中國X連鎖遺傳先天性極重度聽力下降家系，患者表現(xiàn)為先天性極重度聽力下降，顳骨CT檢查顯示內聽道膨大，呈X連鎖隱性遺傳模式。共調查家系成員17人，男性10人，女性7人。患者2人，均為男性，聽力學表型一致。按照下述方法對其中8名成員，包括5名女性、3名男性進行POU3F4基因檢測，發(fā)現(xiàn)2名男性患者均為突變半合子，另一名正常男性基因為野生型，在5名女性中共檢測到3名雜合攜帶者分別為先證者的母親、外婆和姨媽。另外兩名女性未發(fā)現(xiàn)突變。另外選取聽力正常，沒有聽力減退遺傳背景正常對照110名，進行POU3F4基因突變檢測，結果沒有發(fā)現(xiàn)任何突變。對所有參加者詳細調査其病史以及家族史，并對其進行體格檢查，耳科檢査包括耳鏡檢査、聽力學評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣510ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天1)抗凝血用PBS作1倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18。C28。C)，上面鋪一層1倍體積已稀釋的血液，室溫，1000xg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細胞層，轉入5mlEp管中，5000xg,離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000xg，離心10分鐘。4)將細胞懸于2mlTE緩沖液(10mMTris.HCl，lmMEDTA，pH8.0)中，加10%的SDS(十二垸基硫酸)至終濃度0.5%(100(^1)，蛋白激酶k100200pg/ml(10mg/ml)，50。C水浴35小時。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000xg,離心10分鐘。6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000xg,離心10分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000xg，離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2.5倍體積的無水乙醇。10)-20。C沉淀DNA過夜。第二天11)高速離心，10000xg，10分鐘，4°C。12)棄上清液，加入75。/。乙醇2ml，高速離心10000xg，5分鐘13)棄上清液，吹干。14)用TE緩沖液溶解(200(^1TE/5ml全血，400TE/10ml全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計定量。二、POU3F4基因編碼區(qū)的PCR擴增1、引物序列上游引物POUl-F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5'-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3，(nt87773-nt87792)注POU3F4基因序列檢索號Z821702、PCR反應體系的建立(表l)表1POU3F4基因的PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，緩沖液、普通Taq酶從寶生物基因公司購得，dNTP從寶生物公司購得，引物由上海生工公司合成。反應條件PCR反應在ABI公司9700熱循環(huán)儀上進行，反應過程(包括溫度和時間)如圖2所示。POU3F4基因編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的純化和定量實施例2一、PCR產(chǎn)物的純化——96孔板法1、向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50pl無菌水，混勻。2、將其轉移到Mimpore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒有水即可。3、向純化板中再次加入5(Hil的去離子水，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。4、將純化板從真空泵上取下，向板中加入2(^1的去離子水，靜止15分鐘，再震蕩15分鐘，然后吸到一新96孔板內。5、保存在-2(TC冰箱中。1、樣品準備取一96孔點樣板，每孔先加上樣緩沖液6pl，在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中，每孔用排槍移出PCR產(chǎn)物(2|il)，轉移到點樣板上、混勻、離心(腔板孔號要與96孔點樣板一一對應)。2、流程1)配膠(0.8%瓊脂糖)稱取2.4g瓊脂糖，懸浮于300ml0.5xTBE中(500ml錐形瓶)。2)溶膠微波爐中高火加熱至沸，持續(xù)沸騰數(shù)分鐘，注意不要沸出，其間取出混勻。3)涼膠待膠完全溶解，從微波爐中取出，涼至6(TC左右，加入1滴EB(約10^1，10mg/ml)，搖勻。4)鋪膠平板兩端用膠布封嚴，把250ml膠液全部倒入平板，插入梳尺。5)上膠將平板放入已盛有電泳液(0.5xTBE，液面距膠面l至2mm)的電泳槽中，拔下梳尺。6)加樣用排槍按規(guī)定格式加樣，最后用單槍加入DNA標準品。7)走膠蓋上電泳槽蓋，檢查正負級，開啟電泳儀，調節(jié)電泳電壓。8)定量當溴酚藍走離加樣孔1.5至2cm處，關閉電泳儀，小心取膠，放入攝相儀照相，進行定量。定量marker為DL2000，如圖3所示，經(jīng)過電泳后，有6條帶可見，片段長度分別是2000bp,1000bp,750bp,500bp，250bp,100bp，DL2000的總濃度是300ng/5pl。電泳時取5jilDL2000，因此每條帶的含量為50ng。PCR產(chǎn)物電泳時取3pl(PCR產(chǎn)物)+5^1(上樣緩沖液)進行電泳。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳后的灰度值與DL2000的灰度值的比較判斷PCR產(chǎn)物的含量。純化的POU3F4基因編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的直接測序實施例3一、PCR產(chǎn)物DNA模板的純度與用量要求DNA純度OD260/OD28。=1.6~2.0。DNA濃度PCR產(chǎn)物10ng/nl。DNA用量PCR產(chǎn)物100-200bp1-3ng200-500bp3-10ng500-1000bp5-20ng1000-2000bp10-40ng〉2000bp40-100ng二、測序反應1、測序反應所需試劑應為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測序反應所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應為潔凈無菌的。2、為了保證測序樣本及反應試劑的新鮮，加樣時應在冰上操作。3、目前的反應體系為5pl，各種試劑加入量如表2所示。表2POU3F4基因PCR擴增產(chǎn)物的測序反應體系模板純化的PCR產(chǎn)物(實施例2中制備)200-500bp3-10ng<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*BigDye3.1為美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的一種用于測序反應的熒光染料。4、樣品放于PCR儀上，所作反應的過程見表3。表3POU3F4基因PCR擴增產(chǎn)物的測序反應過程<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5、反應完的樣品要及時從PCR儀上取下，短時間內要進行純化的樣品放置于4。C冰箱中，超過一天以上才能純化的樣品放置于-2(TC冰箱冷凍。三、測序反應物的純化和測序1、向每孔中加入20|1180°/。乙醇，4,000rpm離心30min;將樣品板放在折好的紙巾上，在離心機中倒甩，倒甩時速率不能超過1,000rpm;2、在每孔中加入30|1170%乙醇，4,000rpm離心10min，倒甩；3、重復第2步的操作；4、重復第2步的操作；5、將樣品板放于千凈的抽屜中，避光干燥30min;6、加入5pl甲酰胺，封膜，離心后置于-2(TC冰箱中；7、上機器前95。C變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后上樣。測序圖如圖4所示。檢測耳聾相關基因POU3F4-499QT突變位點試劑盒及其應用實施例41、試劑盒的組成(1)擴增用引物上游引物POU1-F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3，(nt86989-nt87008)下游引物POU1-R:5'-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3，(nt87773-nt87792)注POU3F4基因序列檢索號Z82170(2)PCR擴增用Taq酶5U/|il(3)10x緩沖液(含15mlMgCl2)(4)dNTP2mM(5)Big-Dyemix2、使用方法主要包括如下步驟1)PCR擴增用軟件Primer3對POU3F4基因的編碼區(qū)設計PCR引物，反應條件為94°C預變性4分鐘，94。C變性l分鐘，退火溫度50。C分鐘，72。C延伸2分鐘，35個循環(huán)，反應結束后再72。C延伸5分鐘，4。C保存。2)PCR產(chǎn)物純化將含有PCR產(chǎn)物的MpMScreen-PCR板抽真空，加入去離子水，靜置，隨后將MpltiScreen-PCR板置于混合器上震蕩，純化后的PCR產(chǎn)物重新溶解后轉移至另一潔凈的96孔板中。3)測序反應及驗證以PCR引物作為測序引物進行測序反應，在ABI9700熱循環(huán)儀上進行測序反應。反應結束后，延伸產(chǎn)物上樣于ABIPRISM3730DNA序列分析儀。將所得到的測序圖譜進行分析，與Genbank中的標準序列比較以確定突變位點是否存在。具體方法參見實施例1、2、3、4。以上對本發(fā)明的詳細描述并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求所定義的范圍。權利要求1、一種用于檢測與聽力損失相關的位于POU3F4基因的499C＞T突變的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測位于POU3F4基因的499C＞T突變的試劑和任選的用于擴增POU3F4基因的試劑。2、如權利要求1所述試劑盒，所述試劑盒包括下述試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；用于擴增樣本DNA中包含POU3F4基因499位堿基片段的PCR引物及相應的PCR反應試劑；檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑。3、如權利要求2所述的試劑盒，其中所述的PCR引物為POUl畫F:5,-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT-3'POU1-R:5，畫GAACCTGCAGATGGTGGTCT畫3'。4、如權利要求2所述的試劑盒，其中所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的試劑選自測序檢測試劑、限制性內切酶酶切檢測試劑、限制性長度多態(tài)性檢測試劑、序列特異性弓I物檢測試劑以及探針雜交檢測試劑。5、如權利要求l所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測位于POU3F4基因的499C>T突變的步驟包括1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA;2)以該DNA為模板，以下列PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產(chǎn)物；POUl畫F:5，-TAACCCGTGCTAGCGTCTTT畫3'POUl曙R:5,-GAACCTGCAGATGGTGGTCT-3'3)將得到的PCR反應產(chǎn)物進行直接測序，并將測序結果與POU3F4正?；虻男蛄羞M行比較，確定是否存在POU3F4基因的4990T突變位點。6、如權利要求5所述試劑盒，所述步驟還進一步包括4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定R167X氨基酸突變位點。全文摘要本發(fā)明涉及具有499C＞T突變的POU3F4突變基因，此突變基因與人類遺傳性耳聾相關，本發(fā)明提供了檢測POU3F4基因499C＞T突變的試劑盒，通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷耳聾發(fā)生的原因和類型的檢測方法。該突變基因和檢測方法將有利于臨床上開展耳聾患者的POU3F4突變篩查工作，為耳聾患者的診斷和治療提供服務。文檔編號C12Q1/68GK101250589SQ200810102709公開日2008年8月27日申請日期2008年3月25日優(yōu)先權日2008年3月25日發(fā)明者王秋菊,趙亞麗,韓東一,韓明鯤申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院