專利名稱：：一種可調(diào)控的肝損傷動(dòng)物模型的制作方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可調(diào)控的肝損傷動(dòng)物模型的制作方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎的主要病原之一，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)約有1.7億慢性感染者。由于缺乏良好的小動(dòng)物模型，使HCV發(fā)病機(jī)制的研究還局限于HCV感染自然史的觀察和黑猩猩的實(shí)驗(yàn)感染，而黑猩猩是受保護(hù)動(dòng)物，在倫理和經(jīng)濟(jì)上都受到許多限制，因此人源化小鼠是替代靈長類動(dòng)物用于HCV感染和藥物篩選的理想模型。近年來，Mercer(Mercer,D.F.etal.HepatitisCvirusreplicationinmicewithchimerichumanlivers.Nat.Med.7，927-933.2001)、Tateno(Tateno，C.etal.Nearcompletelyhumanizedliverinmiceshowshuman—typemetabolicresponsestodrugs.Ara.J.Pathol.165，901-912.2004)禾口Turrini(TurriniPetal.DevelopmentofhumanizedmiceforthestudyofhepatitisCvirusinfection.TransplantProc.2006May;38(4):1181-4)等人先后以Alb-uPA小鼠作為移植受體來制備人源化小鼠肝臟，并實(shí)現(xiàn)了HCV感染，然而Alb-uPA小鼠uPA基因的表達(dá)會(huì)造成新生小鼠出血死亡，因此，存在著純合子死亡率極高以致繁殖后代極為困難的致命缺陷。另外，小鼠肝細(xì)胞具有極強(qiáng)的再生能力，Alb-uPA小鼠在出生后1-2個(gè)月內(nèi)，再生的肝細(xì)胞替代轉(zhuǎn)基因的肝細(xì)胞從而失去適合細(xì)胞移植的環(huán)境，因此，應(yīng)用Alb-uPA小鼠作為受體時(shí)，移植時(shí)間僅限于出生后14天之內(nèi)，移植手術(shù)難度高且移植后成活率低。最近幾年，發(fā)展了一些可誘導(dǎo)性表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng),包括可誘導(dǎo)的真核生物表達(dá)系統(tǒng)和原核生物表達(dá)系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)也存在很大的局限性，表現(xiàn)為l)以重金屬離子、激素及熱休克蛋白為誘導(dǎo)劑的真核表達(dá)系統(tǒng)，其誘導(dǎo)刺激可引起多元效應(yīng),引發(fā)許多基因表達(dá),難以區(qū)分特異或非特異性事件;在沒有誘導(dǎo)劑存在時(shí),還常出現(xiàn)表達(dá)泄露現(xiàn)象；2)可誘導(dǎo)性原核表達(dá)系統(tǒng)，如基于lac阻遏因子基礎(chǔ)上的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其作用雖然特異，但其要求的誘導(dǎo)劑劑量接近細(xì)胞毒水平，而且誘導(dǎo)過程緩慢、誘導(dǎo)效率低，也難以廣泛推廣。近年來發(fā)展的一種高效無毒、具有嚴(yán)密開/關(guān)功能的基因表達(dá)系統(tǒng)，稱為Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)。Tet-off系統(tǒng)在沒有四環(huán)素(tetracycline,Tet)5或其衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline，Dox)存在的情況下，引起插入啟動(dòng)子下游目的基因的高效表達(dá)，隨著四環(huán)素濃度的增加，基因表達(dá)以一種劑量依賴性的方式逐漸關(guān)閉直至為零。Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)受四環(huán)素的作用剛好與Tet-off系統(tǒng)相反，即在沒有四環(huán)素的情況下表達(dá)水平為零，在加入四環(huán)素或強(qiáng)力霉素后目的基因高效表達(dá)。Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是目前最為理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，與目前所用的其他真核基因表達(dá)系統(tǒng)比較，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密性、特異性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，自推出以來，在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用。Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)工作原理如下大腸桿菌Aco"'株轉(zhuǎn)座子TnlO中Tet阻遏因子(Tetr印ressor，TetR)負(fù)性調(diào)節(jié)四環(huán)素抗性操縱子(tetracycline-resistauceoperon)，TetR與四環(huán)素有很高的親和性。在沒有四環(huán)素存在時(shí)，TetR與Tet操縱因子序列(Tet0)結(jié)合而阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)；當(dāng)有四環(huán)素時(shí)，TetR對(duì)Tet0的阻遏解除，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)?；谶@個(gè)原理，Gossen等將TetR1-207個(gè)氨基酸與單純皰疹病毒VP16的C-端130個(gè)氨基酸所組成的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域(transcriptionalactivatordomain,VP16AD)融合，將TetR這個(gè)阻遏因子改建成四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活子(tetracyclinetranscriptionalactivator,tTA);而7個(gè)拷貝42bp大小的TetO加上其上游最小單位CMV啟動(dòng)子構(gòu)成了四環(huán)素反應(yīng)因子(tetracyclineresponseelement,TRE)，被石開究基因位于其下游。這樣，與前述Tet0-TetR工作原理相反，當(dāng)缺乏四環(huán)素時(shí)，tTA蛋白與TetO結(jié)合，激活TRE下游基因的轉(zhuǎn)錄；而加入四環(huán)素時(shí)，四環(huán)素與TetR的高親和性，使tTA蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，不能結(jié)合Tet0，從而TRE下游基因的轉(zhuǎn)錄活化被阻斷。在Tet-off的基礎(chǔ)上，Bujard通過改變Tet上4個(gè)氨基酸，在5，端接上一個(gè)核定位信號(hào)，其它結(jié)構(gòu)不變，構(gòu)建成"反義"Tet阻遏因子，形成反義四環(huán)素激活子(rtTA)。所謂反義四環(huán)素激活子，即在有四環(huán)素或其衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline)存在時(shí)，rtTA蛋白可與TRE結(jié)合而促使TetO調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，而撤走四環(huán)素或強(qiáng)力霉素時(shí)，基因不被轉(zhuǎn)錄。這個(gè)系統(tǒng)被稱之為Tet-on系統(tǒng)。對(duì)于那些基因需被抑制表達(dá)以及不必要或不便于長時(shí)間表達(dá)(如基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)的情況，Tet-on系統(tǒng)使研究變得十分便利。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種可調(diào)控的肝損傷動(dòng)物模型的制作方法及其專用載體。本發(fā)明所提供的重組表達(dá)載體P，是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入DNA片段K得到的重組載體；所述DNA片段K由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子(TRE)、啟動(dòng)子和尿激酶原激活劑編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成;所述啟動(dòng)子是如下l)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。所述四環(huán)素反應(yīng)因子為如下A)或B)或C)的DNA分子A)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；B)在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；C)與序列表中序列2限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。所述尿激酶原激活劑為如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)其氨基酸序列是GenBankAccessionNumberNP—032899的自氨基末端第1至433位氨基酸殘基；b)將a)限定的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有尿激酶原激活劑功能的由a)限定的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。所述尿激酶原激活劑的編碼基因?yàn)槿缦翴)或II)或III)的DNA分子I)其核苷酸序列是GenBankAccessionNumberNM—008873的自5'末端第59位至1360位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述尿激酶原激活劑的DNA分子；III)與I)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼具有尿激酶原激活劑功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。所述重組表達(dá)載體P具體可為pTRE-uPA。上述pTRE-uPA是將PBI載體I和7V力eI位點(diǎn)間的小片段取代為尿激酶原激活劑的編碼基因得到的。本發(fā)明還提供了另一種重組表達(dá)載體Q，是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入DNA片段N得到的重組載體；所述DNA片段N由肝臟特異啟動(dòng)子和Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子(rtTA)編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成。所述肝臟特異啟動(dòng)子為小鼠白蛋白啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin,TTR)啟動(dòng)子或載脂蛋白(apolipoproteinE，ApoE)啟動(dòng)子等。所述的重組表達(dá)載體Q中，在所述小鼠白蛋白啟動(dòng)子上游還插入了增強(qiáng)子，形成了所述小鼠白蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子融合的DNA片段T，所述DNA片段T是如下i)或ii)或iii)的DNA分子i)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；ii)在嚴(yán)格條件下與i)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；iii)與序列表中序列3限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。所述反義四環(huán)素激活子可為如下c)或d)的蛋白質(zhì)c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；d)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有反義四環(huán)素激活子功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。所述反義四環(huán)素激活子編碼基因可為如下e)或f)或g)的DNA分子e)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；f)在嚴(yán)格條件下與e)限定的DNA序列雜交且編碼所述反義四環(huán)素激活子的DNA分子；g)與序列表中序列5限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼具有反義四環(huán)素激活子功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；所述重組表達(dá)載體Q具體可為pAlb-rtTA。上述pAlb-rtTA是將pSK載體的Sacl和BamHI位點(diǎn)間的小片段取代為所述DNA片段T、EcoRI和HindIII位點(diǎn)間的小片段取代為反義四環(huán)素激活子編碼基因得到的。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。切除所述重組表達(dá)載體P中的原核表達(dá)元件得到的DNA片段P'也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述DNA片段P'具體可為用Drdl和Hpal酶切所述pTRE-uPA得到的大片段。切除所述重組表達(dá)載體Q中的原核表達(dá)元件得到的DNA片段Q'也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述DNA片段Q'具體可為用Kpnl和Sacl酶切所述pAlb-rtTA得到的大片段。本發(fā)明還提供了一種肝損傷動(dòng)物模型的制作方法，包括以下步驟1)將所述重組表達(dá)載體P或所述DNA片段P'導(dǎo)入動(dòng)物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物A;將所述重組表達(dá)載體Q或所述DNA片段Q'導(dǎo)入動(dòng)物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物B;2)將所述轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物A與非轉(zhuǎn)基因正常動(dòng)物進(jìn)行雜交，得到攜帶有所述DNA片段K的Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Al;將所述轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物B與所述非轉(zhuǎn)基因正常動(dòng)物進(jìn)行雜交，得到攜帶有所述DNA片段N的Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Bl;3)將所述Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Al和所述Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Bl進(jìn)行雜交，得到的攜帶有所述DNA片段K和所述DNA片段N的F2代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C作為肝損傷動(dòng)物模型。所述方法中還可包括將同窩的所述F2代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C進(jìn)行傳代得到的所有攜帶有所述DNA片段K和所述DNA片段N的后代均作為肝損傷動(dòng)物模型的步驟。所述動(dòng)物具體可為小鼠。本發(fā)明得到的模型小鼠，在強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)后，檢測到了uPAmRNA的表達(dá)；誘導(dǎo)前后血清中的ALT活力濃度明顯提高，可以確定肝臟受到了一定程度的損傷；通過肉眼觀察可見DOX誘導(dǎo)后小鼠肝臟的顏色變白，呈現(xiàn)出明顯的損傷癥狀。結(jié)果證明，本發(fā)明制作的模型小鼠的uPA的表達(dá)模式是正確的，并能對(duì)小鼠的肝臟造成較為嚴(yán)重的損傷，因此，該小鼠模型可以作為人源肝細(xì)胞移植的優(yōu)良受體進(jìn)行人源化小鼠肝臟的相關(guān)研究。本文發(fā)明應(yīng)用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)制備了Tet-on調(diào)控uPA基因在小鼠肝細(xì)胞中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞中uPA基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量受Doxycycline誘導(dǎo)調(diào)控，肝損傷的時(shí)間和程度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求人為加以控制。因此，該轉(zhuǎn)基因小鼠作為人源化小鼠肝臟具有以下三個(gè)方面優(yōu)勢1)與正常小鼠一樣很容易獲得轉(zhuǎn)基因純合子后代，可以獲得大量的可移植受體小鼠；2)細(xì)胞移植的時(shí)間不受限制，可以選擇在出生后46周的成體小鼠，所以，移植手術(shù)的難度降低、大大提高手術(shù)后小鼠成活率；3)小鼠肝損傷的程度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，通過飼喂Doxycycline的劑量來加以調(diào)控，從而得到更為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為不同退火溫度PCR擴(kuò)增的uPAcDNA電泳圖圖2為凝膠回收后的PCR擴(kuò)增的uPADNA的電泳圖圖3為pGEMT-uPA陽性重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖圖4為鑒定pTRE-uPA陽性克隆的電泳圖圖5為pTRE-uPA載體的酶切鑒定電泳圖圖6為線性化的pTRE-uPA的DNA片段的電泳圖圖7為用于顯微注射的pTRE-uPA載體DNA片段的電泳8為pAlb-rtTA載體的酶切鑒定電泳9為PCR鑒定pTRE-uPA轉(zhuǎn)基因陽性始建者小鼠圖10為PCR鑒定pAlb-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性始建者小鼠圖11為RT-PCR檢測DOX誘導(dǎo)后小鼠肝臟中uPAmRNA的表達(dá)圖12為Tet-uPA小鼠DOX誘導(dǎo)6天后肝臟形態(tài)的變化具體實(shí)施例方式應(yīng)用本發(fā)明制作小鼠模型的具體流程如下1)從ICR小鼠腎臟RNA中通過RT-PCR擴(kuò)增出尿激酶原激活劑(uPA)基因的cDNA。2)將步驟l)得到的cDNA克隆入Tet-on系統(tǒng)的反應(yīng)元件pBI載體中構(gòu)建成pTRE-uPA。3)構(gòu)建能在小鼠肝臟中特異性表達(dá)的Tet-on系統(tǒng)的調(diào)控元件pAlb-rtTA的載體。4)分別將步驟2)和步驟3)構(gòu)建的載體切除原核表達(dá)元件，得到兩種線性的DNA片段。5)將步驟4)得到pTRE-uPA線性DNA片段應(yīng)用原核顯微注射法導(dǎo)入ICR小鼠，得到轉(zhuǎn)基因首建者小鼠A;將步驟4)得到pAlb-rtTA線性DNA片段應(yīng)用原核顯微注射法導(dǎo)入ICR小鼠，得到轉(zhuǎn)基因首建者小鼠B。6)將轉(zhuǎn)基因首建者小鼠A與ICR小鼠雜交獲得Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠，鑒定陽性的為Al;將轉(zhuǎn)基因首建者小鼠B與ICR小鼠雜交獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠，鑒定陽性的為Bl。7)將轉(zhuǎn)基因小鼠A1和轉(zhuǎn)基因小鼠B1雜交獲得的雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠C，即為可調(diào)控的肝損傷小鼠模型。8)將同窩的所述F2代轉(zhuǎn)基因小鼠C進(jìn)行傳代得到的所有攜帶有所述DNA片段K和所述DNA片段N的后代均作為肝損傷小鼠模型。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、Tet-on調(diào)控uPA基因在小鼠肝臟特異性表達(dá)的重組載體的構(gòu)建Tet-on調(diào)控uPA基因在小鼠肝臟特異性表達(dá)的重組載體有兩個(gè)，一個(gè)是攜帶有Tet-on表達(dá)的反應(yīng)元件TRE和uPA基因的重組表達(dá)載體pTRE-uPA，另一個(gè)是攜帶有小鼠白蛋白(Albumin)啟動(dòng)子和Tet-on表達(dá)的調(diào)控元件rtTA基因的重組載體pAlb-rtTA。在pAlb-rtTA中，rtTA基因位于Albumin啟動(dòng)子之下并受其調(diào)控，在小鼠肝臟中特異性表達(dá);而肝臟中rtTA的濃度變化進(jìn)而可以調(diào)控尿激酶原激活劑(uPA)基因的表達(dá)。pTRE-uPA和pAlb-rtTA的具體構(gòu)建方法如下一、pTRE-uPA質(zhì)粒載體的構(gòu)建和供原核注射DNA樣品的制備從ICR小鼠腎臟RNA中通過RT-PCR擴(kuò)增出尿激酶原激活劑(uPA)基因的cDNA，將其克隆入pGEM-T載體中測序正確后，必〃I禾P順eI雙酶切下uPAcDNA片段并克隆入Tet-on系統(tǒng)的反應(yīng)元件pBI載體的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，構(gòu)建成pTRE-uPA載體，進(jìn)一步使用HpaI和DrdI酶切出3.6kb的DNA片段用于原核顯微注射制作轉(zhuǎn)基因小鼠。(一)小鼠uPAcDNA的克隆和測序提取ICR小鼠腎臟的總RNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)得到uPAcDNA并將其克隆于pGEM-T載體上，藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。1、ICR小鼠腎臟總RNA提?、偃〕赡甑腎CR小鼠一只，頸椎脫臼法致死，使用干熱滅菌后的鑷子取小鼠的腎臟放入1.5ml的Eppendorf管(無核酸酶)中，加入lmlTrizol(invitrogen，Cat.No.15596-026)充分勻漿，室溫靜置5分鐘；②加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，靜置2min;③4。C離心，12000gX15min，取上清；④加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min;⑤4。C離心，12000gX10min，棄上清；⑥加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4°C，7500gX5min，棄上清；⑦晾干，加入100ul無RNase水溶解(65。C促溶10-15min)。提取的總RNA立即用于反轉(zhuǎn)錄或是置于-8(TC保存。將小鼠腎臟總RNA稀釋50倍后，于紫外分光光度計(jì)測定A260/280的0D值。0D260=0.699;OD280=0.435;A260/280=l.607;總RNA的濃度為0,699X40ug/mlX50(稀釋倍數(shù))=1398ug/ml。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈①取0.7ul總RNA(相當(dāng)于lug總RNA)于200ulPCR管中，70。C孵育10分鐘后置于冰上。②在上述PCR管中加入以下體積的溶液，制備成20ul的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25mMMgCl24ul10XRTbuffer2uldNTP混合物2ulRNA酶抑制劑0.5ulAMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5ul01igo(dT)15lul無核酸酶的水至終體積20ul③上述反應(yīng)體系42"C孵育15分鐘后，95。C加熱5分鐘，4'C保溫5分鐘后，置于-2(TC保存?zhèn)溆谩?、PCR擴(kuò)增uPAcDNA①根據(jù)Genebank中小鼠的uPAmRNA序列(麗—008873)設(shè)計(jì)一對(duì)引物Pl和P2，引物上游引入必wl酶切位點(diǎn)，引物下游引入7^el酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)注的DNA序列)。上游引物位于uPAmRNA起始編碼區(qū)上游96bp處，下游引物位于終止密碼子下游76bp處。Pl:5'GGCACGCGTATGAAAGTCTGGCTGGCGAG3，，P2:5'TCTGCTAGCGAGAGGACGGTCAGCATGGG3。②應(yīng)用引物Pl和P2，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用TaKaRa的PyrobestDNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(100ul)如下無菌去離子水71ul10XPyrobestbufferII10ulPl(10uM)2ulP2(10uM)2uldNTP混合物(各2.5raM)8ulc腿5ulPyrobestDNA聚合酶2ulPCR反應(yīng)條件如下將下述變性一退火一延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。變性94°C，30sec;退火分別采用57。C、58.6°C、60.5°C、62.4°C、64.2。C和65°C6個(gè)溫度梯度進(jìn)行，40sec;延伸72°C，2min。分別將上述6種退火溫度下進(jìn)行PCR的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，電泳圖見圖l。圖1中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL2000;1:57。CPCR的產(chǎn)物；2:58.6°CPCR的產(chǎn)物；3:60.5°CPCR的產(chǎn)物；4:62.4°CPCR的產(chǎn)物；5:64.2°CPCR的產(chǎn)物；6:65°CPCR的產(chǎn)物；7:PCR空白對(duì)照。由圖可見，隨著PCR退火溫度從57。C上升到65X:的過程中，1.4kb大小的目的條帶的亮度和特異性都隨之增強(qiáng)，因此在隨后的PCR反應(yīng)中選擇了65C為最適的退火溫度。4、PCR產(chǎn)物的回收將退火溫度為65"C的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后，應(yīng)用DNA快速純化/回收試劑盒(北京鼎國生物公司，cat.noA014-1)回收L4kb條帶，具體步驟如下①100ul反應(yīng)體系的PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7yQ瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，切取含DNA片段的瓊脂糖置于1.5mlEppendorf管中稱重，用吸頭搗碎并加入溶液A。②65"C水溶5-IO分鐘，膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶2-3次，待溶化后置室溫，加入15ul溶液B,充分混勻。③將溶液置于離心柱中，靜置2分鐘，10000rpm離心20-30秒，若一次加不完，可分兩次離心；倒掉液體，加入500ixl溶液C于離心柱中8000rpm離心20-30秒，棄液體，此步驟重復(fù)一次；⑤12000rpm再次離心1分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精；⑥將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋放置5-10分鐘，使乙醇揮發(fā)殆盡；⑦加入20-30ul溶液D，5(TC水浴靜置2分鐘后，15000rpm離心1分鐘，管底溶液即為所需DNA?；厥盏腄NA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。圖2中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL2000;1:回收的PCR產(chǎn)物。將得到的DNA稀釋20倍，于紫外分光光度計(jì)下測定A260/2800D。A26(K).035;A280=0.022;A260/280=l.609;DNA濃度為:0.035X50ug/mlX20=35ng/ul。其余的DNA儲(chǔ)存于-2(TC備用。5、PCR產(chǎn)物的鑒定回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)體外加A反應(yīng)后，連入pGEM-T載體進(jìn)行序列分析，具體步驟如下1)加A反應(yīng)反應(yīng)體系(lOul)如下.-PCR產(chǎn)物7.2ulIOXPCR緩沖液luldNTP混合物(2.5raM)0.8ulTaqDNA聚合酶1.Oul70。C條件下反應(yīng)30分鐘。2)連接反應(yīng)反應(yīng)體系(lOul)如下2XT4DNA連接酶緩沖液5ulpGEM-T(50g/ul)0.5ul加A后的PCR產(chǎn)物3.5ulT4DNA連接酶lul室溫孵育l小時(shí)后，用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。3)轉(zhuǎn)化取5ul連接產(chǎn)物加入到100ul大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘；42。C孵育90秒；再冰浴2分鐘；將其轉(zhuǎn)移至0.5ralLB培養(yǎng)液中，37°C、100rpm條件下培養(yǎng)45分鐘；然后吸取50ul均勻涂布于經(jīng)過IPTG和X-gal處理的10cmLB平板上，37匸條件下培養(yǎng)18小時(shí)。4)重組陽性菌落的挑選和鑒定挑選8-10個(gè)分散良好的白色單菌落，分別加入5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C、250rpm條件下培養(yǎng)12小時(shí)，待培養(yǎng)基變得混濁時(shí)，分取lul菌液用于PCR鑒定重組，其余菌液4'C條件下保存。經(jīng)PCR鑒定，確為重組陽性的克隆命名為pGEMT-uPA。應(yīng)用Promega公司的WizardPlusSVMinipr印sDNAPurificationSystem試劑盒提取重組陽性克隆質(zhì)粒，提取質(zhì)粒的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下①吸取L5ml菌液至1.5mlEppendorf管中，lOOOOg離心lmin，棄上清，再次加入1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，離心、棄上清后收獲菌體；②加入250ul細(xì)胞懸浮液，用移液器反復(fù)吹打后再劇烈振蕩lmim仔細(xì)觀察待菌體徹底懸浮即可；③緩慢加入250ul細(xì)胞裂解液，上下緩慢的顛倒4-5次以混勻，室溫孵育小于5rain，待溶液變得澄清即可；④加入10ul堿性蛋白酶溶液(AlkalineProteaseSolution)，上下緩慢的真頁倒4-5次以混勻，室溫孵育5min;加入350ul中和液，立即上下顛倒4-5次以混勻；⑤室溫條件下14000g離心10min;⑥將約850ul的上清液移入置于收集管上的制備柱(Pr印aredSpinColumn)中，室溫條件下14000g離心lmin;⑦吸出收集管中的液體，將制備柱(Pr印aredSpinColumn)重新放于收集管上；⑧加入750ul清洗液(ColumeWashSolution)，室溫條件下14000g離心lmin;⑨吸出收集管中的液體，將制備柱(Pr印aredSpinColumn)重新放于收集管上;14加入250ul清洗液(Col匿WashSolution)，室溫條件下14000g離心2min;⑩將制備柱(Pr印aredSpinColumn)重新放于一新的、無菌的1.5mlEppendorf管上，加入lOOul無核酸酶的水，室溫條件下14000g離心lmin，以洗脫質(zhì)粒DNA。取2ug質(zhì)粒進(jìn)行I和MeI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后質(zhì)粒DNA片段的大小，如出現(xiàn)3kb和1.3kb兩條DNA條帶則可確定該質(zhì)粒確為pGEMT-uPA陽性重組質(zhì)粒，電泳圖見圖3。圖3中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL2000;1:pGEMT-uPA載體Mlul+Nhel酶切；2:pGEMT-uPA載體。從圖3可見，pGEMT-uPA用必〃I和順eI雙酶切后可見分子量大小分別為3.Okb和1.3kb的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果完全相符。5)測序經(jīng)PCR、I禾P順eI雙酶切鑒定確為陽性重組質(zhì)粒的pGEMT-uPA送交北京三博遠(yuǎn)志生物公司測序。測序結(jié)果表明，pGEMT-uPA中克隆的uPAcDNA序列完全正確，是GenBankAccessionNumberNM—008873的自5'末端第59位至1424位脫氧核糖核苷酸，其編碼序列是GenBankAccessionNumberNM—008873的自5'末端第59位至1360位脫氧核糖核苷酸，編碼序列是GenBankAccessionNumberNP—032899的自氨基末端第1至433位氨基酸殘基的uPA。(二)載體的構(gòu)建和鑒定pBI(Clontech)是攜帶Tet-on調(diào)控反應(yīng)元件TRE的質(zhì)粒，調(diào)控外源基因表達(dá)的CMV啟動(dòng)子位于TRE反應(yīng)元件下游并受TRE調(diào)控，所以選擇pBI質(zhì)粒作為出發(fā)載體構(gòu)建pTRE-uPA。pBI質(zhì)粒上，所述調(diào)控外源基因表達(dá)的CMV啟動(dòng)子序列見序列表的序列l(wèi)，所述四環(huán)素反應(yīng)因子(TRE)序列見序列表的序列2。將pGEMT-uPA經(jīng)MluI和NheI雙酶切，得到1.4kb的片段，連入經(jīng)過同樣酶切的pBI質(zhì)粒(Clontech)中，酶切鑒定成功重組的陽性質(zhì)粒，進(jìn)行進(jìn)一步的大量提取和純化。1、pBI質(zhì)粒的提取應(yīng)用Promega公司的WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem試劑盒提取pBI質(zhì)粒。用I和I雙酶切質(zhì)粒DNA得到大小為4.4kb的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明酶切后的DNA片段大小正確。2、pTRE-uPA載體的構(gòu)建和鑒定1)酶切和回收①pTRE-uPA質(zhì)粒的酶切和回收用MluI(NEB)和NheI(NEB)雙酶切經(jīng)測序正確的pGEMT-uPA質(zhì)粒以回收uPAcDNA，反應(yīng)體系50ul，具體如下10XNEBBuffer5ulpGEMT-uPA質(zhì)粒DNA20ul(約5ug)Mlul2.5ulNhel酶2.5ul無菌水20ul以上溶液混勻后，37。C保溫12h后，取1111進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，待確定酶切已完全后，中止反應(yīng)。使用鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收1.4kb大小的uPAc腿片段。②pBI質(zhì)粒的酶切和回收pBI質(zhì)粒使用itfi/I+MeI酶切(NEB公司)，反應(yīng)體系50ul，具體如下10XNEBBuffer5ulDNA20ul(約5ug)Mlul2.5ulNhel酶2.5ul無菌水20ul以上溶液混勻后，37r保溫12h后，取lul進(jìn)行凝膠電泳檢測酶切是否完全，待確定酶切已完全后，中止反應(yīng)。使用鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收酶切后的DNA。2)連接反應(yīng)使用DNALigationKitVer2.0，按照插入的DNA/載體摩爾比3:1的比例分別吸取適量的DNA在1.5ml管中，反應(yīng)體系10ul，分別加入10Xbufferlul，lOmMdNTP0.2ul，T4DNA連接酶0.2ul，適量的無菌水補(bǔ)足至10ul，16。C條件下反應(yīng)30min。3)轉(zhuǎn)化取5ul連接產(chǎn)物加入到100ulToplO感受態(tài)中，冰浴30分鐘；42〔孵育90秒；再冰浴2分鐘；將其轉(zhuǎn)移至0.5mlLB培養(yǎng)液中，37°C、100rpm條件下培養(yǎng)45分鐘；然后吸取50ul均勻涂布于直徑10cm的LB平板上，37'C條件下培養(yǎng)18小時(shí)。4)重組陽性質(zhì)粒的篩選、鑒定隨機(jī)挑取形態(tài)正常、分散良好的20個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，電泳圖見圖4。圖4中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL2000;l-20:隨機(jī)挑取的l-20號(hào)克隆。結(jié)果有12個(gè)陽性克隆。再分別挑取12個(gè)陽性克隆的菌落置于裝有3mlLB液體培養(yǎng)基(含有A即100ug/ml)的試管中，37°C、250rpm條件下培養(yǎng)12小時(shí)，待培養(yǎng)液變得渾濁時(shí)終止培養(yǎng)，應(yīng)用Promega公司的WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)必wI+順eI和"rdI+處aI雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳，如出現(xiàn)兩條分子量大小分別為4.35kb和1.38kb(Mlul+Nhel酶切結(jié)果)和3.6kb和2.lkb(Drdl+Hpal酶切結(jié)果)的DNA片段時(shí)，則可以確定為重組陽性的質(zhì)粒，命名為pTRE-uPA。經(jīng)必〃I+凇eI和十處aI雙酶切鑒定，從12個(gè)陽性克隆中篩選到pTRE-uPA。pTRE-uPA的酶切結(jié)果見圖5，圖5中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL15000;1:pTRE-uPA載體；2:pTRE-uPA載體經(jīng)MluI+Nhel酶切；3:pTRE-uPA載體經(jīng)Drdl+Hpal酶切。結(jié)果酶切片段大小正確，說明構(gòu)建成功。(三)pTRE-uPA載體的酶切線性化和純化選取Drdl和Hpal雙酶切pTRE-uPA載體使其線性化，凝膠回收3.6kb的目的片段，進(jìn)一步純化后用于顯微注射。1、酶切線性化反應(yīng)體系(450ul)如下pTRE-uPAl200ul(約30ug)Drdl5ulHpal5ul10XNEBbuffer4.5ul無菌去離子水235.5ul混勻后，37°C條件下酶切消化12小時(shí)后，先吸取2ul酶切反應(yīng)液電泳檢測是否酶切完全，如果分子量為5.7kb的DNA條帶消失，同時(shí)出現(xiàn)了3.6kb和2.lkb兩個(gè)DNA片段則說明酶切已完全，則終止酶切反應(yīng)。將酶切反應(yīng)完全的產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用DNA快速純化/回收試劑盒(北京鼎國生物公司，cat.noA014-l)回收分子量大小為3.6kb的包含有Tet-on反應(yīng)調(diào)控元件TRE和uPAcDNA的片斷?；厥掌蔚碾娪緢D見圖6。圖6中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker，DL15000;1:回收的DNA片段(2ul);2:回收的DNA片段(4ul);3:回收的DNA片段(6ul)。2、線性化的pTRE-uPA的純化用PromegaWizardDNAclear-upkit(Cat:A7280)進(jìn)一步純化線性化的DNA片段。3、原核注射DNA樣品的制備按一定的稀釋比測定DNA樣品的260nm0D值及280nm0D值，計(jì)算其比值。DNA濃度為260nmOD值X50ug/mlX稀釋倍數(shù)^DNA(ug/ml)。根據(jù)測定的結(jié)果，加入適量的TE，將DNA濃度稀釋至2-5ng/ul，然后12000gX10min，4。C下離心。將上述離心后的上1/3部分溶液小心吸出，分裝于經(jīng)過充分洗滌的0.2ml管，20ul/管(可先將上部1/3液體轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)干凈的0.6mltube,然后再分裝)。最后將分裝后的DNA凍存于-2(TC或-8(TC冰箱,準(zhǔn)備用于原核注射。最后用于顯微注射用的DNA片段的電泳結(jié)果見圖7。圖7中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:麗Amarker，DL15000;1、2:均為純化后用于顯微注射的pTRE-uPA載體DNA片段，分子量大小為3.6kb。二、pAlb-rtTA載體的構(gòu)建與供原核注射DNA樣品的制備1、Alb啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的獲得將位于小鼠白蛋白基因5'上游IO.4-8.5kb之間的l.99kb的增強(qiáng)子片斷和0.33kb的啟動(dòng)子片斷融合成長度為2.3kb的Alb啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，具體實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)(PinkertCAetal.AnALBenhancerlocated10kbupstreamfunctionsalongwithitspromotertodirectefficient,liverspecificexpressionintransgenicmice.GenesDev1987;1:268-276.)。獲得的Alb啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列見序列表中的序列3。2、rtTA編碼基因的獲得EcoRI和HindIII(NEB)雙酶切pUHrt62-1質(zhì)粒(Clontech)獲得附加有SV40polyA的rtTA編碼基因，獲得的rtTA基因經(jīng)過DNA序列分析，結(jié)果表明序列完全正確，rtTA基因的編碼序列見序列表中的序列5，rtTA基因編碼的氨基酸序列見序列表中的序列4。3、pAlb-rtTA載體的構(gòu)建先將Alb啟動(dòng)子/增強(qiáng)子插入pSK載體的Sacl和BamHI多克隆位點(diǎn)構(gòu)建成pSK-Alb，然后再將帶有SV40polyA的rtTA編碼基因插入pSK-Alb載體的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pAlb-rtTA載體。對(duì)得到的載體進(jìn)行SacI+Kpnl雙酶切鑒定，結(jié)果見圖8。圖8中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker，DL15000;1-3:分別為隨機(jī)挑取的1-3號(hào)克隆。由圖可見，出現(xiàn)分子量大小分別為3.5k和3k的條帶。瓊脂糖凝膠電泳回收3.5kb的DNA片段。3、線性化的pAlb-rtTA載體的純化瓊脂糖凝膠電泳回收3.5kb的DNA片段進(jìn)行進(jìn)一步的純化以用于顯微注射。具體操作同步驟一的(三)的2。4、原核注射DNA樣品的制備具體操作同步驟一的(三)的3。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因小鼠的制作和繁育一、轉(zhuǎn)基因小鼠的制作和鑒定1、轉(zhuǎn)基因小鼠的制作①選取4-5周齡雌性ICR小鼠，陰道口封閉，作為供體，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射IOIU孕馬血清(PMSG)。②47-48小時(shí)后，每只小鼠腹腔注射IOIU的人促絨毛膜性腺激素(HCG)，并與正常公鼠合籠，以提供受精卵。另取數(shù)只適齡母鼠(2月齡以上)，選取其中的陰道口潮紅的發(fā)情母鼠作為受體，與結(jié)扎公鼠合籠。③第二天上午9:00前觀察供體、受體，有精栓者拿出備用，受體籠拿出作好隔離措施。10:30左右，斷頸處死供體，手術(shù)取出整個(gè)輸卵管，放入含有0.05%透明質(zhì)酸酶(Sigma)M2液(Sigma)中，顯微鏡下，用鑷子撕開輸卵管壺腹部，受精卵隨同顆粒細(xì)胞即一同流出。⑤仔細(xì)觀察放在透明質(zhì)酸酶M2液中的受精卵，當(dāng)受精卵周圍的顆粒細(xì)胞脫離時(shí)，將受精卵吸出，放入M2液(Sigma)中洗滌，最后放在M16液(Sigma)中放入5%C02，37"C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。⑥在顯微鏡下觀察，挑選細(xì)胞飽滿，透明帶清晰，雄原核清晰可見的受精卵待用。⑦安裝持卵針和注射針，使其末端平行于載物臺(tái)，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆蓋石蠟油，移入待注射的受精卵，DNA在注射針中的氣泡應(yīng)在先前全部彈走。⑧在高倍鏡下，將注射針輕觸持卵管，使DNA緩慢流出并控制其流量；反復(fù)吹吸受精卵，使其處于最佳位置，將注射針刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出；將注射過的和未注射過的受精卵上下分開放置，不致于混攪，注射完畢后，放入5%C02,37t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)。⑨將受體麻醉，注射計(jì)量為^戊巴比妥鈉0.01ml/g，腹腔注射。手術(shù)取出卵巢連接輸卵管，用脂肪鑷固定，在顯微鏡下找到輸卵管開口。吸取注射后經(jīng)培養(yǎng)成活的受精卵，吸取方法是先吸一段較長的M2，吸一個(gè)氣泡，然后吸取受精卵，盡量緊密泡，再吸一段液體，共四段液體三個(gè)氣泡。除較長的那段液體，其余的液體大致lcra左右，氣泡0.2cm左右。將移植管口插入輸卵管口，輕輕將移植管內(nèi)的液體吹入，看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個(gè)氣泡，即移植成功。將卵巢連同輸卵管放回腹腔，縫合肌肉和皮膚。⑩受體每隔一個(gè)星期稱體重一次，當(dāng)?shù)诙伪鹊谝淮畏Q重增加時(shí)，即可初步判斷懷孕。手術(shù)后19-21天仔鼠分娩，即得到轉(zhuǎn)基因首建者(Founder)小鼠。2、轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定使用pTRE-uPA載體進(jìn)行注射共得到48只轉(zhuǎn)基因首建者小鼠A。，使用pAlb-rtTA載體進(jìn)行注射共得到30只轉(zhuǎn)基因首建者小鼠B。。待轉(zhuǎn)基因首建者(Founder)小鼠3周后，剪腳趾編號(hào)，剪尾提取DNA應(yīng)用PCR方法進(jìn)行檢測。具體的方法如下(1)PCR引物的設(shè)計(jì)①用于檢測轉(zhuǎn)基因小鼠A的上游引物在設(shè)計(jì)在miniCMVpromoter序列內(nèi)，下游引物設(shè)計(jì)在uPA基因的cDNA序列內(nèi)，以保證PCR結(jié)果的可靠性，設(shè)計(jì)的PCR引物序列如下uPA434F:5'GTCGAGTAGGCGTGTACGGT3，，uPA841R:5'CCATTTCCATGATAGCAGGT3'。PCR產(chǎn)物大小為407bp。②用于檢測轉(zhuǎn)基因小鼠B的引物上游在設(shè)計(jì)在Albuminpromoter序列內(nèi)，引物下游設(shè)計(jì)在rtTA基因序列內(nèi)，以保證PCR結(jié)果的可靠性，設(shè)計(jì)的PCR引物序列如下Alb-rtTA2178F:5，GCTCCAGATGGCAAACATACGC3，，Alb-rtTA2822R:5，TTCCTCCAATACGCAGCCCAGT3'。PCR產(chǎn)物大小為644bp。(2)PCR反應(yīng)應(yīng)用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(10ul)如下無菌去離子水7.lul10XPyrobestbuffer1.0ul上游引物(10uM)0.2ul下游引物(10uM)0.2uldNTPMixture(各2.5mM)0.8ulcDNA0.5ulPyrobestDNAPolymerase0.22ul反應(yīng)條件94。C變性30sec—57。C退火30sec—72。C延伸40sec，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。pTRE-uPA轉(zhuǎn)基因首建者小鼠鑒定結(jié)果見圖9。圖9中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL15000;1-48:分別為48只出生的小鼠。pAlb-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性小鼠鑒定結(jié)果見圖10。圖10中，從左到右的泳道對(duì)應(yīng)的樣品依次為M:DNAmarker,DL15000;PC:pAlb-rtTA載體;轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。結(jié)果得到ll只pTRE-uPA轉(zhuǎn)基因陽性始建者小鼠A，分別為7、9、12、18、22、26、29、31、35、39、42;5只pAlb-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性始建者小鼠B，分別為1-5，2-9，2-10，3-8，4-6。二、Tet-on調(diào)控uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育轉(zhuǎn)基因首建者小鼠A和轉(zhuǎn)基因首建者小鼠B分別與ICR小鼠交配得到Fl代小鼠A1和B1;F1代的小鼠A1和B1相互交配，子代為F2代，PCR篩選Alb-rtTA和uPA基因雙陽性的小鼠得到雜合的Tet-on調(diào)控的uPA小鼠C，即為小鼠模型；將小鼠C進(jìn)行傳代得到的雙陽性后代小鼠均可作為小鼠模型。從小鼠A中選取26、29兩只分別與ICR小鼠交配得到F1代；從小鼠B中選取2-9、2-IO兩只分別與ICR小鼠交配得到F1代；PCR篩選uPA片段轉(zhuǎn)基因陽性的Fl代小鼠Al和Alb-rtTA片段轉(zhuǎn)基因陽性的Fl代小鼠Bl相互交配，得到的后代得到F2代仔鼠；再經(jīng)PCR篩選得到Alb-rtTA和uPA基因雙陽性的小鼠C,即為模型小鼠；將小鼠C進(jìn)行傳代得到的雙陽性后代小鼠均可作為小鼠模型，用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的鑒定。三、Tet-on調(diào)控轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟uPA表達(dá)的鑒定Tet-on調(diào)控uPA基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)誘導(dǎo)條件下可造成特異性肝臟損傷，肝臟損傷的情況可以通過小鼠血清中的的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)濃度升高反映出來，另外，還可以通過RT-PCR檢測肝臟中uPAmRNA的表達(dá)來確定DOX誘導(dǎo)后uPA基因的表達(dá)情況。1、DOX誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)基因小鼠血清中ALT濃度的變化的檢測選取待誘導(dǎo)的Tet-onuPA小鼠眼睚靜脈叢采血，8000rpm條件下離心5min，收集上清凍存于-2(TC備用，采血后的小鼠在飲用水中加入lmg/ml的強(qiáng)力霉素(doxycycline，Dox)誘導(dǎo)表達(dá)6天后，同樣的方法再次采血并收集血清用于ALT濃度的檢測，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因的ICR小鼠作為對(duì)照。用上海百祥生物科技有限公司ALT測定試劑盒檢測ALT，按表1在96孔板中加入各溶液，取出，冷至室溫，于酶標(biāo)儀上490nm比色，以空白孔較零，讀取各孔吸光度。樣品ALT活力濃度^測定管吸光/標(biāo)準(zhǔn)管吸光X標(biāo)準(zhǔn)血清中酶活力濃度。結(jié)果見表2。表196孔板中加入的溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2DOX誘導(dǎo)Tet-uPA小鼠6天后血清中ALT濃度的變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>2、RT-PCR檢測肝臟中uPAmRNA的表達(dá)切取DOX誘導(dǎo)6天的Tet-uPA小鼠的肝臟，提取RNA，RT-PCR檢測uPA基因mRNA的表達(dá)。其中RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄以及PCR反應(yīng)的具體操作步驟同上，PCR引物和反應(yīng)條件如下-PCR引物序列上游引物5，GCTGTCAGAACGGAGGTGTA3'下游引物5'TTGGGAGTTGAATGAAGCAG3'PCR反應(yīng)條件變性94°C、30sec—退火:57°C、30sec—延伸:72°C、30min反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物:600bp。切取上述5只D0X誘導(dǎo)6天的Tet-uPA小鼠的肝臟，提取RNA，用beta-actin作為內(nèi)參，RT-PCR檢測uPA基因mRNA的表達(dá)，同時(shí)以正常ICR小鼠的作為對(duì)照。結(jié)果見圖11。圖11中，從左到右的對(duì)應(yīng)的樣品依次為編號(hào)72-133的小鼠、編號(hào)72-134的小鼠、編號(hào)72-137的小鼠、編號(hào)61-29的小鼠、編號(hào)66-74的小鼠、ICR小鼠。結(jié)果可見，5只Tet-uPA小鼠經(jīng)D0X誘導(dǎo)6天后，肝臟中uPA基因在轉(zhuǎn)錄水平均有較高的表達(dá)，而對(duì)照的ICR小鼠則沒有表達(dá)。3、肝臟形態(tài)學(xué)鑒定觀察D0X誘導(dǎo)6天后的轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟形態(tài)，見圖12。圖12中，a為非轉(zhuǎn)基因小鼠，b為轉(zhuǎn)基因小鼠。通過肉眼觀察可見DOX誘導(dǎo)后小鼠肝臟的顏色變白，呈現(xiàn)出明顯的損傷癥狀，而非轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)DOX誘導(dǎo)后肝臟形態(tài)沒有變化。結(jié)論應(yīng)用Tet-on調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)成功地制作了可調(diào)控的肝損傷小鼠模型，該小鼠模型可以作為人源肝細(xì)胞移植的優(yōu)良受體進(jìn)行人源化小鼠肝臟的相關(guān)研究。序列表〈110〉北京大學(xué)北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司〈120〉一種可調(diào)控的肝損傷動(dòng)物模型的制作方法及其專用載體<130>CGGNARY81209<160〉5<210〉1<211>129<212>薩〈213〉人工序列<400〉1taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgc60ctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcct120ccgcggccc129〈210〉2〈211〉312<212>DNA<213>人工序列〈400〉2ann+y<"i/T+<TU匕LCI」Clg(T十(tq9picr十r*CTagtttacc.Eictccct.a才.cag60tgatagagaaaagtgaa3gtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaa120gtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccc180tettc6igtgatagagaaaagtgaaagtxgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaa240gtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagsgaaaagtgaaagtcgagctcggt300acccgggtcg312<210>3<211>2336<212>薩<213〉人工序列<400〉3ctagcttcctt￡lgC￡Ltg3Cgttccacttttttctaatggtggagcttacttctttgatttg60atcttttgtg犯3Cttttggaaattacccatcttcct犯gcttctgcttctctcagtttt120ctgcttgctcattccacttttccagctgaccctgccccctaccaacattgctccacaagc180acaaattcattaaat"tctaagttttatagttgtttggatcgcataggtag240ctaaagaggtggcaacccacgcatgagcttgattttttttgattt3g犯c300cttcccctctctgttcctag3ct3cactacacattctgc已a(bǔ)gcatagcac360Ixtactttaattactttcattttcttgtatcctcacagcccctgcgttac420agcatccactcagtatcccttgagcatgaggtgacactacttaacatagggacgagatgg480ctcctgctctgtcagcagggcactgtacttgctgataccagggaatgttt540gttcttaaataccatcattccggacgtgtttgccttggccagttttccatgteicatgcag6003aag犯g1:t1:ggactgatxaatacagtcctctgcctttaaagcaataggaa肌ggccagic660ttgtctacgtttagtatgtggctgtagaaagggtat卿tataaaaattagiaactaatga720aatggcagtcttacaceitttttggcagcttatttaaagtcttggtgttaagtacgctgga780gctgtcacagggcatgtctgcacggggaccataagttact840gacattcgtttcccattccatttg肌tacacacttttgtcatggtattgcttgctgaaat■tgttttgcaattcaa^ttcei111aat&a&tgaM"tttaM960ttatctcaatgttata犯aaagtcaMttttacttatata1020atttttaaacatttgtttattgagcttattatggatgaatctatctctat1080tactctaaaaaagaagaaagaccatagacaatcatctatttgatatgtgt1140tgtgagt卿catcagatgctccatttctcactgtaateiccatttatagt1200t3cttgca犯ELCt犯Ctggaattctaggacttaaatattttaagttttagctgggtgact1260ggttgg犯a3ttttaggtaagtactga^ccaagagattaa3ttct肌ag1320ttttagaagtaaatattaccaatattccaaagttgagcta1380caga犯tttcaaittttagctgt犯caatgtaatttgttgtctattttctt1440ttgagatacsgttttttctgtctagctttggctgtcctggaccttgctctgtagaccagg1500ttggtcttgaactcagagatctgcttgcctctgccttgcaagtgct郷attaaaagcat1560gtgccaccactgcctggctacaatctatgttttatetaggigattataaagctctggctttg1620tg3C3tt犯tctttcagata3t33gtcttttggattgtgtctggagaacat3cagactgt1680gagc卿tgttcagaggtatatttgcttaggggtg犯ttcaatctgcagcaataattatg17403gca^g肌ttactgacacttccattt"tatacattctacttgctgatctatga^C8tagat1800aagcatgcaggcattcatcatagttttctttatctggaaaatgaa^gaag1860cactttattaEitaca^gtttgLgatgtgttttgccatcttttaatttcttaagaaatactaa1920gctgatgcagcagtggtgCEigcttggcUgaactcgttct1980ccagcttgggatcgacctgcaggC3tgcttccatgccaaggcccacactgaaatgctcaa2040atggg卿caaagagattaagctcttatgtaaaMttgctgttttacatawtttaMga2100atggacaaagtcttgtgcatgggggtgggggtggggttagaggggaacagctccagatgg2160ca^catacgc^gggattt￡LgtC￡L￡LaCa<￡tctttttggcaaagatggtatgattttgtaa2220tggggtaggaacc犯tga^tgcg郷t^gtatggttasitgatctacagttattggtta2280犯ga^gteitatt卿gcgsgtctttctgcactttcctatc犯cccc2336<210〉4<211〉248<212〉PRT<213〉人工序列〈400>4MetSerArgLeuAsp15LeuAsnGlyValGly20LysLeuGlyValGlu冗ArgAlaLeuLeuAsp50ThrHisPheCysPro65AsnAsnAlaLysSer85LysSerLysVallieAsnGlyAlaLeuGluLeu1015lieGluGlyLeuThrThrArgLysLeuAlaGin2530GinProThrLeuTyrTrpHisValLysAsnLys4045AlaLeuProlieGluMetLeuAspArgHisHis5560LeuGluGlyGluSerTrpGinAspPheLeuArg707580PheArgCysAlaLeuLeuSerHisArgAspGly9095AlaLysValHisLeuGlyThrArgProThrGluLysGinTyrGluThr100105110LeuGluAsnGinLeuAlaPheLeuCysGinGinGlyPheSerLeuGlu115120125AsnAlaLeuTyrAlaLeuSerAlaValGlyHisPheThrLeuGlyCys130135140ValLeuGluGluGinGluHisGinValAlaLysGluGluArgGluThr145150155160ProThrThrAspSerMetProProLeuLeuArgGinAlalieGluLeu165170175PheAspArgGinGlyAlaGluProAlaPheLeuPheGlyLeuGluLeu180185190lielieCysGlyLeuGluLysGinLeuLysCysGluSerGlyGlyPro195200205AlaAspAlaLeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuProAlaAspAla210215220LeuAspAspPheAspLeuAspMetLeuProAlaAspAlaLeuAspAsp225230235240PheAspLeuAspMetLeuProGly245<210〉5<211>744<212>DNA〈213>人工序列<400>5atgtctagactggac肌gagcaaagtcataaacggcgctctgg犯ttactcaatggagtc60ggtatcg犯ggcctgacgac3giggsaBctcgctca^犯gctgggagttgagcagcctacc120ctgtactggcacgtgaagaac朋gcgggccctgctcgatgccctgccaatcg卿tgctg180gacaggcatcatacccacttctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcgg240aacaacgccaagtcattccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggct犯agtgcat300ctcggcacccgcccaacagag33ac3gtacgaaaccctgga^a3tca_gctcgcgttcctg360tgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccacttt420acactgggctgcgtattggaggascEiggagcatcaagtagcaaaagaggaaeigagagaca480cctaccaccgattctatgcccccacttctgagaC￡L￡lgC￡l3ttgagctgttcgaccggcag540ggagccgaacctgccttccttttcggcctgga_￡LCt33tC3tatgtggcctgg卿犯cag600ctaaagtgcga卿cggcgggccggccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctc660cca_gccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgat720tttgaccttgacatgctccccggg74權(quán)利要求1、一種重組表達(dá)載體P，是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入DNA片段K得到的重組載體；所述DNA片段K由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子、啟動(dòng)子和尿激酶原激活劑編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成；所述啟動(dòng)子是如下1)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。2、如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體P，其特征在于所述四環(huán)素反應(yīng)因子是如下A)或B)或C)的DNA分子A)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；B)在嚴(yán)格條件下與A)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；C)與序列表中序列2限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。3、如權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體P，其特征在于所述尿激酶原激活劑是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)其氨基酸序列是GenBankAccessionNumberNP—032899的自氨基末端第1至433位氨基酸殘基；b)將a)限定的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有尿激酶原激活劑功能的由a)限定的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。4、如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體P，其特征在于所述尿激酶原激活劑的編碼基因是如下I)或II)或III)的DNA分子I)其核苷酸序列是GenBankAccessionNumberNM—008873的自5'末端第59位至1360位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述尿激酶原激活劑的DNA分子；III)與I)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼具有尿激酶原激活劑功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。5、如權(quán)利要求1至4中任一所述的重組表達(dá)載體P，其特征在于所述重組表達(dá)載體是pTRE-uPA;所述pTRE-uPA是將PBI載體I和I位點(diǎn)間的小片段取代為尿激酶原激活劑的編碼基因得到的。6、一種重組表達(dá)載體Q，是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入DNA片段N得到的重組載體；所述DNA片段N由肝臟特異啟動(dòng)子和Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成。7、如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體Q，其特征在于所述肝臟特異啟動(dòng)子為小鼠白蛋白啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子或載脂蛋白啟動(dòng)子。8、如權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體Q，其特征在于在所述小鼠白蛋白啟動(dòng)子上游還插入了增強(qiáng)子，形成了所述小鼠白蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子融合的DNA片段T，所述DNA片段T是如下i)或ii)或iii)的DNA分子i)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；ii)在嚴(yán)格條件下與i)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；iii)與序列表中序列3限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。9、如權(quán)利要求6或7或8所述的重組表達(dá)載體Q，其特征在于所述反義四環(huán)素激活子是如下c)或d)的蛋白質(zhì)c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；d)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有反義四環(huán)素激活子功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。10、如權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體Q，其特征在于所述反義四環(huán)素激活子編碼基因是如下e)或f)或g)的DNA分子e)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；f)在嚴(yán)格條件下與e)限定的DNA序列雜交且編碼所述反義四環(huán)素激活子的DNA分子；g)與序列表中序列5限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有反義四環(huán)素激活子功能的蛋白質(zhì)的DNA分子；11、如權(quán)利要求8至10中任一所述的重組表達(dá)載體Q,其特征在于所述重組表達(dá)載體是pAlb-rtTA;所述pAlb-rtTA是將pSK載體的Sacl和BamHI位點(diǎn)間的小片段取代為所述DNA片段T、EcoRI和HindIII位點(diǎn)間的小片段取代為反義四環(huán)素激活子編碼基因得到的。12、切除權(quán)利要求1-5中任一所述的重組表達(dá)載體P中的原核表達(dá)元件得到的DNA片段P'。13、如權(quán)利要求12所述DNA片段P'，其特征在于所述咖A片段是用DrdI和Hpal酶切權(quán)利要求5所述的pTRE-uPA得到的大片段。14、切除權(quán)利要求6-11中任一所述的重組表達(dá)載體Q中的原核表達(dá)元件得到的DNA片段Q，。15、如權(quán)利要求14所述DNA片段Q，，其特征在于所述DNA片段是用Kpnl和Sacl酶切權(quán)利要求11所述的pAlb-rtTA得到的大片段。16、一種肝損傷動(dòng)物模型的制作方法，包括以下步驟[1)將權(quán)利要求1-5中任一所述的重組表達(dá)載體P或權(quán)利要求12或13所述的DNA片段P'導(dǎo)入動(dòng)物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物A;將權(quán)利要求6-11中任一所述的重組表達(dá)載體Q或權(quán)利要求14或15所述的DNA片段Q'導(dǎo)入動(dòng)物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物B;[2)將所述轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物A與所述非轉(zhuǎn)基因正常動(dòng)物進(jìn)行雜交，得到攜帶有權(quán)利要求1-5中任一所述重組表達(dá)載體P中的所述DNA片段K的Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Al;將所述轉(zhuǎn)基因首建者動(dòng)物B與所述非轉(zhuǎn)基因正常動(dòng)物進(jìn)行雜交，得到攜帶有權(quán)利要求6-11中任一所述重組表達(dá)載體Q中的所述DNA片段N的Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Bl;[3)將所述Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Al和所述Fl代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Bl進(jìn)行雜交，得到的攜帶有所述DNA片段K和所述DNA片段N的F2代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C作為肝損傷動(dòng)物模型。17、如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將同窩的所述F2代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C進(jìn)行傳代得到的所有攜帶有所述DNA片段K和所述DNA片段N的后代均作為肝損傷動(dòng)物模型的步驟。18、如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物是小鼠。全文摘要本發(fā)明公開了一種可調(diào)控的肝損傷動(dòng)物模型的制作方法及其專用載體。本發(fā)明提供了兩個(gè)專用載體，一個(gè)是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子、啟動(dòng)子和尿激酶原激活劑編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成的DNA片段得到的；另一個(gè)是在真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入由肝臟特異啟動(dòng)子和Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成的DNA片段得到的。將上述兩個(gè)專用載體導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)可得到雙陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型肝細(xì)胞中uPA基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)調(diào)控，肝損傷的時(shí)間和程度可以根據(jù)需要人為控制。文檔編號(hào)C12N15/79GK101550425SQ20081010315公開日2009年10月7日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者多曙光,宋希軍,鄧宏魁,郭玉珊申請人:北京大學(xué);北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司