專利名稱：一種微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微流控技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種適 于細(xì)胞或微生物微環(huán)境培養(yǎng)的微流控芯片裝置。
背景技術(shù)：
微流控芯片(Microfluidic chip)最初起源于分析化學(xué)領(lǐng)域，是一 種采用精細(xì)加工技術(shù)，在數(shù)平方厘米的基片，制作出微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 及其它功能單元，以實現(xiàn)集微量樣品制備、進樣、反應(yīng)、分離及檢測 于一體的快速、高效、低耗的微型分析實驗裝置。微流控芯片技術(shù)用于細(xì)胞培養(yǎng)及其生化分析已引起較廣泛的關(guān) 注，如細(xì)胞搡作，綠色熒光蛋白的表達，基因轉(zhuǎn)染，細(xì)胞活性測試， 細(xì)胞分離，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測量，激素分泌監(jiān)測以及高通量的細(xì)胞含 量分析等。自從Harrison等人首次在微流控芯片上對細(xì)胞進行操縱及 傳輸試驗后，Yang等人用微流控芯片研究細(xì)胞群體的排列行為，并用 熒光檢測其攝取鈣離子的反應(yīng)情況。釆用微流控芯片進行細(xì)胞培養(yǎng)能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境，便于生化 分析。前面的工作中報道了很多用化學(xué)的圖形以及物理的固定選擇性 將細(xì)胞連接在表面上的方法。這些方法雖然很有用，但是它們需要特 別的表面處理，同時需要復(fù)雜的微加工工藝或者操作，使得在微流體 系的細(xì)胞陣列不能廣泛地為生物學(xué)家所使用。而且這些方法，主要通 過流體在細(xì)胞周圍的流動來實現(xiàn)對細(xì)胞營養(yǎng)的供給，細(xì)胞會處于一定 的流速之下，這對部分非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)和觀測都會帶來不便。同時 它們也不能對細(xì)胞長時間的生長進行很好的觀測。總體來說，微流相關(guān)研究在國際上才剛剛起步， 一方面研究比較 初步，實驗不夠豐富；另一方面偏重實驗室階段的探索，離應(yīng)用尚有 較大距離。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種微流細(xì)胞(微生物)培 養(yǎng)陣列，用于細(xì)胞的培養(yǎng)及分析。本發(fā)明的另一目的在于提供使用上述微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣 列的細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)方法。本發(fā)明微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列包括 一 個或多個微流細(xì)胞(微 生物)培養(yǎng)陣列單元，所述微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列單元包括主 溝道以及若干個與主溝道相連通的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每個培養(yǎng)單元包含 一段擴散溝道與細(xì)胞培養(yǎng)室，細(xì)胞培養(yǎng)室通過擴散溝道與主溝道相連 通。當(dāng)微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列由多個微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng) 陣列單元構(gòu)成時，可用一總溝道分別與各個主溝道的一端相連通。上述細(xì)胞培養(yǎng)單元優(yōu)選分布在主溝道的兩側(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)室可以呈 多種形狀，優(yōu)選為三角形，其一頂點通過擴散溝與主溝道連通。擴散 溝道截面積比細(xì)胞培養(yǎng)室截面積小，優(yōu)選擴散溝道截面積小于細(xì)胞培養(yǎng)室截面積的20%，但允許細(xì)胞通過，細(xì)胞培養(yǎng)室的高度優(yōu)選不超過 細(xì)胞線度的1.5倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，這里所述的截面積是 指擴散溝道的寬與高之積，細(xì)胞培養(yǎng)室的截面積亦是指其寬與高之積。 本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易理解，對于不同形狀的擴散溝道，這里的截 面積是指最小截面積，對于不同形狀的細(xì)胞培養(yǎng)室，這里的截面積是 指最大截面積。本發(fā)明微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列的材料優(yōu)選釆用PDMS (聚 二甲基硅氧烷)以及玻片，其中玻片作為基片，PDMS作為蓋片。本發(fā)明進一步提供利用微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列的細(xì)胞(微 生物)培養(yǎng)實現(xiàn)方法(1) 將芯片置于真空環(huán)境去氣若干分鐘；(2) 將細(xì)胞懸液震蕩均勻后注射入主溝道，由于PDMS材料特殊的可吸收氣體以及透過氣體的特性，細(xì)胞溶液自動被吸收入細(xì)胞(微 生物)培養(yǎng)室，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)室被液體填充完成，細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)液體流 速降為零；(3)換液操作通過更替主溝道的液體實現(xiàn)去除主溝道的細(xì)胞溶液并實現(xiàn)對細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)細(xì)胞(微生物)的環(huán)境更替。本發(fā)明微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列利用擴散的方式實現(xiàn)培養(yǎng)室 營養(yǎng)液(試劑)的替換，在替換營養(yǎng)液(試劑)時營養(yǎng)液(試劑)在 主溝道中流過，營養(yǎng)物質(zhì)物(試劑)通過擴散實現(xiàn)培養(yǎng)室的營養(yǎng)(化 學(xué)物質(zhì))的更替，而細(xì)胞(微生物)處于零流速的狀態(tài)。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)室的單細(xì)胞分布，而布置時間只需一分 鐘左右。改變主溝道溶液，通過擴散可以十分方便的在一分鐘左右更 替培養(yǎng)室內(nèi)的營養(yǎng)，而細(xì)胞仍能處于零流速的狀態(tài)。由于培養(yǎng)室厚度 的限制細(xì)胞為單層生長，使得顯微觀測十分的方便。本發(fā)明微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，將在細(xì)胞生物學(xué)，特別藥物篩選中發(fā) 揮巨大的作用。


圖1本發(fā)明微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列示意圖之一； 圖2本發(fā)明微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列示意圖之二； 圖3利用吸氣方法布置的酵母細(xì)胞微腔體陣列，其中a為酵母細(xì) 胞溶液被自動吸入細(xì)胞培養(yǎng)單元的顯微時序圖；b為細(xì)胞培養(yǎng)室被布 置上細(xì)胞的顯微圖像；c為進液的酵母細(xì)胞密度為3"(f細(xì)胞/ml時， 100個細(xì)胞培養(yǎng)單元被布置上的細(xì)胞數(shù)量分布；d為進液的酵母細(xì)胞密 度為10l田胞/ml時，IOO個細(xì)胞培養(yǎng)單元被布置上的細(xì)胞數(shù)量分布； 圖4酵母細(xì)胞在微腔體中單層生長，箭頭所指處為酵母細(xì)胞； 圖5并行的觀測酵母細(xì)胞在不同銅離子濃度下的表型。 圖中，l為主溝道，2為細(xì)胞培養(yǎng)室，3為擴散溝道，4為細(xì)胞培 養(yǎng)單元，5為總溝道。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的常規(guī)手段。實施例1微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列如圖l所示，主溝道l寬度為100微米，細(xì)胞培養(yǎng)室2為邊長125 微米的等邊三角，三角形頂點處通過一段20微米寬、20微米長的擴 散溝道3與主溝道1相連，主溝道l、培養(yǎng)室2、擴散溝道3的高度均 為6微米。細(xì)胞培養(yǎng)室2與擴散溝道3構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)單元4，若干個 重復(fù)排列的細(xì)胞培養(yǎng)單元4分列在主溝道1的兩側(cè)，構(gòu)成了微流控細(xì) 胞(微生物)培養(yǎng)陣列的基本單元，由一個或多個上述微流控細(xì)胞(微 生物)培養(yǎng)陣列單元構(gòu)成本發(fā)明微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列。圖 2中所示的是有7個微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列單元構(gòu)成的微流 控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列，在圖2中7個微流控細(xì)胞(微生物)培 養(yǎng)陣列單元同一端的主溝道與總溝道5相連，A為裝載細(xì)胞的入口， B 為替換溶液的入口，這樣可以在A端同時對七條主溝道的培養(yǎng)室布置 上同一種群的酵母細(xì)胞，從B端給七條道不同的培養(yǎng)環(huán)境以作平行對 照，對每一種培養(yǎng)環(huán)境有足夠數(shù)量的細(xì)胞以作統(tǒng)計。當(dāng)然，從A端或 B裝載細(xì)胞或替換溶液并不受此限制。在本例中，微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列的基片為玻片，蓋片 為PDMS。芯片的制作可釆用下述方法在干凈的硅片上按照設(shè)計的模板釆用軟光刻的方法(Y. N. Xia and G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,1998, 37， 5， 550-575丄uo， C. X" Fu, Q., Li， H., Xu, L. P. " a/"丄W 2005, 5,726—729.)制得高 度為6微米的模具，并用液態(tài)的PDMS(A: B=10: 1， A:聚二甲基硅氧烷單體，B:相應(yīng)的交聯(lián)劑；購自GE公司，產(chǎn)品型號為RTV615 )倒 在模具上，PDMS的高度大約為5mm，在80度烘箱中30分鐘使得 PDMS固化。切下后在相應(yīng)的入口和出口處鉆孔后，將PDMS與清潔 好的玻片粘和，從而形成芯片。實施例2單細(xì)胞培養(yǎng)觀察本例中使用實施例1的微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列(圖1) 對酵母細(xì)胞進行單細(xì)胞培養(yǎng)觀測。 具體方法(1) 將酵母細(xì)胞培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)液中，使用前震蕩均勻并稀釋 到合適的濃度，濃度大約為10 細(xì)胞/ml。(2) 取芯片放于真空環(huán)境IO分鐘左右，將菌從入口注入，推速 為20微升/小時。如圖3，酵母細(xì)胞會被自動吸入細(xì)胞培養(yǎng)單元(圖 3a)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)單元被溶液占滿(圖3b)，可用培養(yǎng)液將主溝道的細(xì) 胞溶液沖走.，對酵母細(xì)胞進行培養(yǎng)，如圖4。研究表明，通過上述方法搡作，酵母細(xì)胞溶液被自動吸入細(xì)胞培 養(yǎng)室中(圖3a)，可以實現(xiàn)單細(xì)胞的分離，并且布置細(xì)胞的操作可在一 分鐘內(nèi)完成；當(dāng)當(dāng)細(xì)胞室充滿培養(yǎng)液時，主溝道的流過的液體不會對 細(xì)胞培養(yǎng)室產(chǎn)生直接影響，細(xì)胞培養(yǎng)室中的細(xì)胞基本處于零流速狀態(tài) (圖3b)。當(dāng)進液的酵母細(xì)胞密度為3"(f細(xì)胞/ml時，約35%的細(xì)胞 培養(yǎng)室被布置上單個細(xì)胞(圖3c)。當(dāng)進液的酵母細(xì)胞密度為107細(xì)胞 /ml時，約45%的細(xì)胞室被布置上單個細(xì)胞。實施例3環(huán)境變化對細(xì)胞表型的影響觀察本例中使用實施例1的微流控細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列(圖2) 對酵母細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境的生長進行觀測以及統(tǒng)計。 具體方法(1)將包含銅離子誘導(dǎo)綠色熒光蛋白的酵母細(xì)胞培養(yǎng)于YPG培 養(yǎng)液中，使用前震蕩均勻并稀釋到合適的濃度，濃度大約為107細(xì)胞/ml。(2)取芯片放于真空環(huán)境10分鐘左右，將菌從A入口注入，推 速為40微升/小時，使得七條細(xì)胞培養(yǎng)道中的培養(yǎng)室都被填充滿菌液。(3 )從b入口 1到7通道分別通入含有不同銅離子濃度的培養(yǎng)液， 銅離子濃度分別為0; 0.2; 0.4; 0.6; 1; 1.5; 2mM。細(xì)胞培養(yǎng)溫度 控制在30攝氏度。實驗中觀測每條通道中含有單細(xì)胞的30個培養(yǎng)室， 每15分鐘利用X-Y自動平移平臺掃描一次芯片記錄并一次顯微圖， 總實驗時間為20小時，在20小時結(jié)東時，掃描一次芯片的熒光數(shù)據(jù)。 分析各個通道的酵母細(xì)胞的分裂周期以及熒光數(shù)據(jù)與對應(yīng)銅離子濃度 的關(guān)系并繪制圖5。結(jié)果表明a、銅離子的加入影響了細(xì)胞的分裂，當(dāng)銅離子濃度逐 漸增加時，細(xì)胞分裂周期顯著延長；b、銅離子濃度對綠色熒光蛋白的 誘導(dǎo)量呈正相關(guān)，但當(dāng)銅離子濃度超過lmM時，其對綠色熒光蛋白的 誘導(dǎo)表達沒有顯著變化。
權(quán)利要求
1. 一種微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其包括一個或多個微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列單元，所述微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列單元包括主溝道以及若干個與主溝道相連通的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每個培養(yǎng)單元包含一擴散溝道和細(xì)胞培養(yǎng)室，細(xì)胞培養(yǎng)室通過擴散溝道與主溝道相連通。
2、 如權(quán)利要求l所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其由多個微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列單元構(gòu)成，且陣列一側(cè)具有分別與各個主溝道的一端相連通的總溝道。
3、 如權(quán)利要求l或2所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，細(xì) 胞培養(yǎng)單元分布在主溝道的兩側(cè)。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，擴 散溝道截面積比細(xì)胞培養(yǎng)室截面積小。
5、 如權(quán)利要求4所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，擴散溝 道截面積小于細(xì)胞培養(yǎng)室截面積的20%。
6、 如權(quán)利要求1或2所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，細(xì) 胞培養(yǎng)室的高度不超過細(xì)胞線度的1.5倍。
7、 如權(quán)利要求1或2所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，細(xì) 胞培養(yǎng)室呈三角形，其一頂點通過擴散溝與主溝道相連通。
8、 如權(quán)利要求1或2所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列，其特征在于，其 由基片和粘在其上的蓋片構(gòu)成，所述基片為玻片，所述蓋片由PDMS 制成。
9、 權(quán)利要求1 8任一項所述微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列在細(xì)胞培養(yǎng)和/或 分析中的應(yīng)用，特別是在藥物篩選中的應(yīng)用。
10、 一種利用權(quán)利要求1 8任一項所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列培養(yǎng) 細(xì)胞的方法(1 )將權(quán)利要求1~8任一項所述的微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列置于真空環(huán) 境去氣若干分鐘；(2) 將細(xì)胞懸液震蕩均勻后注射入主溝道，使細(xì)胞懸液充滿微流 細(xì)胞培養(yǎng)陣列；(3) 在培養(yǎng)過程中，更替主溝道的液體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微流細(xì)胞(微生物)培養(yǎng)陣列，其包括一個或多個微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列單元，所述微流細(xì)胞培養(yǎng)陣列單元包括主溝道以及若干個與主溝道相連通的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每個培養(yǎng)單元包含一擴散溝道和細(xì)胞培養(yǎng)室，細(xì)胞培養(yǎng)室通過擴散溝道與主溝道相連通。本發(fā)明微流細(xì)胞(微生物)陣列不僅能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞分離培養(yǎng)，而且在更換培養(yǎng)液或其它試劑的時候細(xì)胞始終處于零流速狀態(tài)，這為細(xì)胞的培養(yǎng)和觀測特別是非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)和觀測帶來了極大的便利，非常適用于基于細(xì)胞表型的高通量藥物篩選的研究工作。
文檔編號C12N1/14GK101275114SQ20081010460
公開日2008年10月1日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者歐陽頎, 羅春雄 申請人:北京大學(xué)