專利名稱：枯草芽孢桿菌在降解真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，尤其涉及一種枯草芽孢桿 菌在降解真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人們對食品安全重視程度的提高，許多國家和地區(qū)紛紛采取
多種生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，如良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(Good Agricultural Practices, GAP)、良好藥品生產(chǎn)規(guī)范(Good Manufacture Practice, GMP)和危害分析及關(guān)鍵控制點(diǎn)(Hazard Analysis and Critical Control Point, HACCP)等，保障從"田園到餐桌"的食品安全供應(yīng) 鏈體系。我國科技部也于2002， 2006年分別啟動(dòng)了 "十五"、"十一五" 國家科技重大專項(xiàng)"食品安全關(guān)鍵技術(shù)"，強(qiáng)調(diào)建設(shè)和加強(qiáng)我國食品 安全的支撐體系。真菌毒素作為影響食品安全的一大隱患，成為這次 科技攻關(guān)的核心問題。
目前用于控制食物鏈真菌毒素水平的方式有物理、化學(xué)的方法。 加熱、紫外照射和離子輻射等物理方法雖能破壞霉菌孢子活性，但不 能完全有效地控制食品或飼料中真菌毒素的水平，而化學(xué)方法雖然能 破壞真菌毒素，但也會(huì)對營養(yǎng)成分造成極大的破壞，并導(dǎo)致化學(xué)試劑 殘留對健康危害的不確定性。國外研究的熱點(diǎn)是尋找生物技術(shù)的方法 和手段替代上述物理化學(xué)方法來控制食品和飼料中的真菌毒素水平。 近年來，采用微生物的方法控制食物鏈中的真菌毒素已被科學(xué)界所關(guān)注。許多學(xué)者試圖通過微生物發(fā)酵的方法減少或消除谷物中脫氧雪腐 鐮刀菌烯醇的污染，并取得了一定的進(jìn)展。
本發(fā)明著力于益生菌降解真菌毒素的研究，是基于益生菌良好的 生理功能，以乳酸菌、雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌為代表的益生菌可促 進(jìn)動(dòng)物或人體原生微生物菌群生長而對宿主產(chǎn)生有益的影響，還具有 抑制有害菌的生長、消除致癌因子、提高機(jī)體免疫力、降低膽固醇等 重要生理功效，而且具有使用安全、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。 目前，國內(nèi)外很少有關(guān)益生菌降解或清除真菌毒素的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌在降解脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇中的應(yīng)用，該枯草芽孢桿菌菌株具有很強(qiáng)的降解脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇的能力，使用安全、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性。
本發(fā)明應(yīng)用如下
1 、消除液體培養(yǎng)基對間接競爭ELISA檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 干擾的方法-
在大規(guī)模篩選降解菌株時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)MRS( Mann-Rogosa-Sharpe medium)培養(yǎng)基對間接競爭ELISA反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的干擾。為消除培養(yǎng) 基的干擾，發(fā)明人設(shè)計(jì)了一系列MRS稀釋度實(shí)驗(yàn)，以純水為參照物， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)8倍稀釋，MRS培養(yǎng)基的干擾可以忽略。
2 、菌株培養(yǎng)產(chǎn)物制備酶制劑的方法
酶制劑是工業(yè)應(yīng)用的添加劑之一，目前酶制劑有粉劑、片劑等， 以枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物制成的酶制劑是利用生化分離的手段(包括各種分離柱、制備色譜等)將菌株代謝產(chǎn)物加以純化得到較純的毒素降 解酶，制成干粉或通過壓片等方式做成片劑產(chǎn)品。
3 、制備活菌制劑的方法-
在大規(guī)模工業(yè)處理污染物時(shí)，利用生物學(xué)方法獲得的活菌株進(jìn)行 液體發(fā)酵處理來達(dá)到消除污染的效果是目前科學(xué)界非常感興趣的應(yīng) 用。本發(fā)明獲得的菌株可經(jīng)過簡單的培養(yǎng)而大量獲得降解脫氧雪腐鐮 刀菌烯醇的活菌體，在培養(yǎng)至菌體對數(shù)期(12到16小時(shí))時(shí)，取出 并添加部分營養(yǎng)裝成活菌液體制劑或添加固形物制成固體活菌制劑。
4、制備人體或動(dòng)物體解毒的口服制劑或藥品的方法
目前許多廠家將枯草芽孢桿菌制成調(diào)節(jié)腸道的口服制劑，而不是 專門用于排除誤食入人體或動(dòng)物體的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。本發(fā)明獲 得菌株的一個(gè)重要的應(yīng)用就是將液體培養(yǎng)獲得的菌體在4000轉(zhuǎn)離心 10分鐘，并用生理鹽水洗滌3次后，添加到以脫脂奶粉等可食用蛋 白粉和牛肉膏配成的營養(yǎng)液中制成菌懸液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是枯草芽孢桿菌可以在溫和的條件下，利用生物 合成和酶學(xué)途徑將食物或詞料中污染的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇完全降 解，并且可避免用物理或化學(xué)方法處理真菌毒素導(dǎo)致的降解不完全和 營養(yǎng)成分被破壞的缺點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的菌株降解液體培養(yǎng)基中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇實(shí)驗(yàn)圖。 圖2為本發(fā)明的菌體和上清液降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素實(shí)驗(yàn)圖。 圖3為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌上清液熱處理后降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇實(shí)驗(yàn)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
1. 將待測菌株從保藏的凍干管中分別接至平板上活化2次，37
"C培養(yǎng)18小時(shí)取出備用；
2. 將活化好的待測菌株接入MRS或營養(yǎng)肉湯(NB)液體培養(yǎng)基， 并根據(jù)文獻(xiàn)模擬成1 y g/mL的食品污染模型。在37。C、厭氧或180 rpm 搖床培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)液于3000 rpm離心15分鐘，上清液備用；
3. 用預(yù)先調(diào)成微堿性的超純水進(jìn)行8倍稀釋，并確定其pH值為 中性；
4. 用間接競爭ELISA試劑盒對所有待測菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測；
5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示橫坐標(biāo)為測試菌株編號(1號為枯草
芽胞桿菌ZZ; 2號為枯草芽胞桿菌KM; 3號為地衣芽胞桿菌；4號為
鼠李糖乳桿菌；5號為保加利亞乳桿菌；6號為嗜酸乳桿菌2c菌株； 7號為纖維二糖乳桿菌；8號為巻曲乳桿菌；9號為發(fā)酵乳桿菌；10 號為嗜酸乳桿菌124a菌株；ll號為德氏乳桿菌；12號為嗜酸乳桿菌 160b菌株；13號為植物乳桿菌)，同時(shí)設(shè)NB培養(yǎng)基+脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇為對照組14號；MRS培養(yǎng)基+脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為對照組15 號?？v坐標(biāo)為測試樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度。ND表示 沒有檢測到樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度(ng/mL)。從圖1 可以看出1號枯草芽胞桿菌ZZ中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度 低于檢測限，說明其有強(qiáng)烈的降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇作用。實(shí)施例2:
1. 將芽孢桿菌分別于37'C， 180 rpm振蕩培養(yǎng)12 h， 4000 rpm 離心10 min分離上清液和菌體。
2. 上清液用0.22 um微濾膜過濾，收集過濾液；
3. 菌體用生理鹽水洗滌兩次，以清除殘留的上清液，最后用生 理鹽水懸浮，使得菌體濃度為10lfl CFU/mL;
4. 分別取過濾除菌的上清液和菌懸液980 UL，并分別加入50 w g/mL的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇水溶液20 u L，使得脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇終濃度為l ug/mL， 37"C靜止溫育3 h和14 h取樣；
5. 用間接競爭ELISA試劑盒檢測樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的 殘留濃度；
6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示橫坐標(biāo)表示測試菌株編號(1號為枯
草芽胞桿菌ZZ; 2號為地衣芽胞桿菌；3號為蠟樣芽孢桿菌；口代表
上清液，目代表菌體)，同時(shí)設(shè)三個(gè)對照組(水+脫氧雪腐鐮刀菌烯醇
為對照組4; NB培養(yǎng)基為對照組5; NB培養(yǎng)基+脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 為對照組6)?？v坐標(biāo)為測試樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度 (ng/mL)。 ND表示沒有檢測到樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃 度。從圖2中可以看出，枯草芽孢桿菌的上清液(口)中脫氧雪腐鐮刀 菌烯醇?xì)埩魸舛鹊陀贓LISA檢測試劑盒的最低檢測限(20ng/mL)，而 枯草芽孢桿菌的菌體(固)基本無降解毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的能 力。1. 按實(shí)施例2中的方法收集枯草芽孢桿菌的上清液備用；
2. 將上清液分別在65、 75、 85、 95、 IO(TC下加熱10 min，然 后加入脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(終濃度為1000 ng/mL)共培養(yǎng)3小時(shí)；
3、 所有樣品用間接競爭ELISA檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留 濃度；
4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示橫坐標(biāo)表示熱處理的溫度(°C)，縱坐 標(biāo)為測試樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度(ng/mL)。 ND表示 沒有檢測到樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的殘留濃度。從圖3中可以看 出上清液中的有效降解組分隨熱處理溫度的上升而逐步失去活性，在 65-75i:間，活性喪失比例較大。
實(shí)施例4:
1. 將枯草芽孢桿菌大量培養(yǎng)，其上清液做如下處理(1)經(jīng)過 真空濃縮，低溫干燥獲得粗酶制劑；(2)經(jīng)過分級超濾、酸分級沉淀、 陰離子交換等分離純化程序獲得降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素的酶 物質(zhì)，制成高純度酶制劑。
2. 將粗酶制劑或高純度酶制劑溶解在少量水中，通過噴霧的方
式使其均勻分散在批量真菌毒素污染的谷物飼料中，飼料經(jīng)過多次翻 曬堆積，其內(nèi)部溫度控制在25-37°C，酶作用一段時(shí)間后，測定脫氧
雪腐鐮刀菌烯醇的降低污染程度。
3. 取少量谷物依次用甲醇水二h l的浸泡、離心棄沉淀、過 固相萃取柱、免疫親和柱等處理后，用HPLC在218nm檢測其中的毒 素殘留。
權(quán)利要求
1、一種枯草芽孢桿菌在降解真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用，其特征是在食品和飼料安全中的應(yīng)用，枯草芽孢桿菌能完全降解農(nóng)作物中污染的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征是枯草芽 孢桿菌在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中37°C、 180rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)，可完全 降解液體中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素，降解產(chǎn)物為無毒性的產(chǎn)物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征是將枯草 芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中37°C、 180rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)，并純 化得到相應(yīng)的降解毒素的酶，制成酶制劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征是將枯草 芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中37°C、 180rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)，并制 備成降解真菌毒素或其它類型毒素的活菌制劑。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征是將枯草 芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中37°C、 180rpm搖床培養(yǎng)12小時(shí)，并制 成用于人體或動(dòng)物體解毒的口服制劑或藥品。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌在降解真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用，其應(yīng)用方法如下1.消除液體培養(yǎng)基對間接競爭ELISA檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇干擾的方法；2.菌株培養(yǎng)產(chǎn)物制備酶制劑的方法；3.制備活菌制劑的方法；4.制備人體或動(dòng)物體解毒的口服制劑或藥品的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是枯草芽孢桿菌可以在溫和的條件下，利用生物合成和酶學(xué)途徑將食物或飼料中污染的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇完全降解，并且可避免用物理或化學(xué)方法處理真菌毒素導(dǎo)致的降解不完全和營養(yǎng)成分被破壞的缺點(diǎn)。
文檔編號C12N1/20GK101412976SQ200810106969
公開日2009年4月22日 申請日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者萬翠香, 鋒 徐, 揚(yáng)史良, 明 曾, 程波財(cái), 許恒毅, 亮 郭, 華 魏 申請人:南昌大學(xué)