專利名稱：：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：小對葉0feco/7s歷o//w'eW)是玄參科假馬齒莧屬多年生沉水草本植物，不僅具有較高的觀賞價(jià)值，而且還兼有藥用之功能。它的自然繁殖系數(shù)很低，采用常規(guī)方法很難形成規(guī)?；纳a(chǎn)。目前主要對小對葉采用組織培養(yǎng)方法，通過葉片進(jìn)行增殖，在短期內(nèi)得到大量試管苗，既填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的空白，又具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。隨著小對葉養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，迫切需要培育出優(yōu)良的新品系，以提高產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,培育出抗逆、優(yōu)質(zhì)的小對葉新品種成為亟需解決的問題。目前，基因工程方法是最有效、最快捷、最可靠的新品種培育方法。因此，利用基因工程技術(shù)研究小對葉的生物學(xué)特性，培育小對葉的新品種成為必然的發(fā)展方向。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)、基因重組技術(shù)的發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到日益廣泛的應(yīng)用。這無論對于分子遺傳學(xué)研究或是遺傳改良都具有特別重要的意義。自從19S4年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)迅速發(fā)展，目前已經(jīng)建立了多種遺傳轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)法、顯微注射法等。其中根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)法是目前研究最多、理論機(jī)制最清楚、技術(shù)方法最成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法。在己獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法完成的。這一方法的遺傳轉(zhuǎn)化率受農(nóng)桿菌菌株類型、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響。目前，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化研究還未見報(bào)道。綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是源于海洋生物多管水母屬(AequoriaVictoria)的一種發(fā)光蛋白，能夠自身催化形成生色團(tuán)并在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，能在活細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。GFP的熒光反應(yīng)不需要任何底物及輔助因子，使表達(dá)檢測非常簡單。同時(shí)，GFP在細(xì)胞中呈自主表達(dá)，沒有細(xì)胞種類、位置和種屬的特異性。GFP對受體細(xì)胞無毒性，對目的基因沒有影響，因而可以很方便的對活體進(jìn)行觀察，來研究GFP基因的表達(dá)。由于GFP對光漂白、氧化劑、還原劑、酸、堿以及其它許多化學(xué)試劑具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，因此，GFP可作為報(bào)告基因來監(jiān)測轉(zhuǎn)基因的表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸與定位等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明所提供的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟以小對葉的葉片為外植體，用處于對數(shù)生長期的、OD6。。值為0.4-0.6的目的農(nóng)桿菌菌液侵染所述外植體5-10分鐘；所述目的農(nóng)桿菌菌液的OD柳值優(yōu)選為0.5，所述侵染的時(shí)間優(yōu)選為7分鐘。所述方法中還包括在所述侵染之前，對外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的步驟，所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間可為1-3天，優(yōu)選為2天。所述方法中還包括在所述侵染之后進(jìn)行共培養(yǎng)的步驟，所述共培養(yǎng)的時(shí)間可為4-6天，優(yōu)選為4天。所述方法中還包括在所述共培養(yǎng)之后進(jìn)行脫菌培養(yǎng)的步驟，所述脫菌培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可含有450mg/L的頭孢霉素。所述目的農(nóng)桿菌含有潮霉素抗性基因。所述方法中在所述脫菌培養(yǎng)后還包括篩選培養(yǎng)的步驟，所述篩選培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述脫菌培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入含有10mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分化得到芽。所述篩選培養(yǎng)方法中還包括如下步驟將所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所述目的農(nóng)桿菌菌液中可含有100mg/L乙酰丁香酮。所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中也可含有100mg/L乙酰丁香酮。用本發(fā)明方法對小對葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到的抗性芽率為7.5%，表明本方法轉(zhuǎn)化效率高。本發(fā)明中以水生植物小對葉為實(shí)驗(yàn)材料，以報(bào)告基因——綠色熒光蛋白基因(greenfluorescentprotein,GFP)來檢測外來基因能否在其中穩(wěn)定和瞬間表達(dá)，為今后建立小對葉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，使外源基因在其中穩(wěn)定表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，對小對葉的遺傳改良有十分重要的意義。另外，綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)入，還可以提高小對葉的觀賞價(jià)值，既美化了環(huán)境，又為后續(xù)凈化水體的研究奠定了基礎(chǔ)。圖1為頭孢霉素Cef對小對葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。圖2為卡那霉素對小對葉離體葉片綠芽分化的影響。圖3為潮霉素對小對葉離體葉片綠芽分化的影響。圖4為小對葉離體葉片分化率與抗生素濃度的回歸關(guān)系。圖5為轉(zhuǎn)基因植株的總DNA提取。圖6為GUS基因PCR擴(kuò)增分析。圖7為GFP基因PCR擴(kuò)增分析。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中主要化學(xué)試劑為-GUS基因和GFP基因引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；rragDNApolymerase、IPTG、X-gal、dNTP(寶生物工程大連有限公司)；瓊脂糖(Promega公司)；卡那霉素(Ka畫ycin，Km)(Amresco公司)；潮霄素(Hygromycin，Hy)(Roche公司)；壯觀霉素(Spectacularadriamycin)(Sigma公司)；氯霉素(Chloramphenicol)(Amresco公司)；組織培養(yǎng)及其它所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。下述實(shí)施例中主要儀器設(shè)備為-低溫冷凍離心機(jī)(BECKMANALLegra21R，美國)；紫外分光光度儀(UNICAMHE入I0S，英國)；PCR擴(kuò)增儀(PTC-100,MJRearch，美國);紫外檢測儀(STS—20.WM);凝膠成像分析系統(tǒng)(DC120EDASKODAK,美國)；電泳儀(IIOO—型，DYY-A型，DYY-III型，國產(chǎn));各種玻璃儀器(培養(yǎng)皿、三角瓶、玻璃刮鏟等)搖床(HZS—H，國產(chǎn))；微量移液器(Gilson，法國)；電熱手提式蒸汽壓力鍋(YXQ，SG46'280型，國產(chǎn))；超凈工作臺(SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺；國產(chǎn))培養(yǎng)箱(DHP-9162型;國產(chǎn))。下述實(shí)施例中用到的溶液和培養(yǎng)基的組成如下1、配卡那霉素(kan)、潮霉素(Hyg):用滅菌蒸餾水配制濃度為50mg/ml的母液，經(jīng)0.22Mm濾膜過濾滅菌，用1.5ml離心管分裝，-20。C保存?zhèn)溆谩?、配頭孢霉素(Cef):用滅菌蒸餾水配制濃度為250mg/ml的母液，經(jīng)0.22Mni濾膜過濾滅菌，用1.5ml離心管分裝，-20C保存?zhèn)溆谩?、配乙酰丁香酮(AS):先用少量甲醇溶解，后用滅菌蒸餾水配制濃度50mg/ml的母液，經(jīng)0.22Mm濾膜過濾滅菌，用1.5ml離心管分裝，-20C保存?zhèn)溆谩?、配利福平(Rif):用滅菌蒸餾水配制濃度為50mg/ml的母液，經(jīng)0.22Hm濾膜過濾滅菌，用1.5ml離心管分裝，-20°0保存?zhèn)溆谩?、YEB培養(yǎng)基其組成和含量為蛋白胨5g/1，酵母粉lg/1，牛肉膏5g/1，蔗糖5g/l，MgS04，7H200.493g/l，其余為水。pH值7.0，121。C高壓滅菌20min。YEB固體培養(yǎng)基中加0.8%瓊脂，YEB液體培養(yǎng)基不加瓊脂。6、MS培養(yǎng)基其組成及含量如表l所示，培養(yǎng)基中附含30gl—'蔗糖和6gl一1瓊脂，PH5.6，液體MS培養(yǎng)基中不加瓊脂，120C高壓滅菌20rain。表l、MS培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>7、幾種主要培養(yǎng)基(單位mg/1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MSI):MS+6-BA0.5mg/l+NM0.02mg/l;芽分化培養(yǎng)基(MS2):MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l;增殖及壯苗培養(yǎng)基(MS3):MS+6-BA0.5mg/l;生根培養(yǎng)基(MS4):1/2MS+IBA0.1mg/l;其它培養(yǎng)基根據(jù)研究目的的不同附加不同濃度的潮霉素(Hyg)、頭孢霉素(Cef)、乙酰丁酰酮(AS)。8、CTAB提取緩沖液:NaCl1.4mol/l，Tris-HC10.lmo1/1(pH8.5)，CTAB2%(w/v)，EDTA-2Na0.02mol/l。pH值7.5，高壓滅菌20min。9、TE緩沖液Tris-HC110mM(pH8.0)，EDTA0.lmM(p朋.O)。10、50XTAE緩沖液Tris242g/l，冰醋酸57.lml，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ml，加水定容至1L。11、3MNaAc(PH5.2):稱取40.824gNaAc3H20或無水NaAc24.6g，溶于30ml水中，加HAc調(diào)pH至5.2，用水定容至100ml。實(shí)施例1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)小對葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件的篩選一、不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響將小對葉葉片用自來水沖洗l-2小時(shí)，然后用0.1%升汞泡2min，再用無菌蒸餾水沖洗5-6次；將滅過菌的葉片切成0.5cniX0.5cm的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1上，分別預(yù)培養(yǎng)0、1、2、3、4、5天，再用農(nóng)桿菌菌液侵染，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其它的遺傳轉(zhuǎn)化條件均相同。30天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率，50天后統(tǒng)計(jì)其不定芽率及抗性芽率。結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，葉盤經(jīng)過1-3天預(yù)培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)化是比較適宜的，其中預(yù)培養(yǎng)2天的效果最好。未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)化率較低，分析原因是幼嫩的無菌苗葉片經(jīng)過切割，己經(jīng)受到較大的傷害，甚至少數(shù)出現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，當(dāng)馬上用農(nóng)桿菌對其進(jìn)行侵染時(shí)，其難以抵抗農(nóng)桿菌的傷害，以至葉盤迅速褐化死亡。而對于預(yù)培養(yǎng)2天的葉盤，其切口邊緣的細(xì)胞對所受的傷害己經(jīng)開始修復(fù)，同時(shí)細(xì)胞也開始旺盛地分裂，形成較多的感受態(tài)細(xì)胞，此時(shí)，對農(nóng)桿菌的侵染較敏感，有利于T-DNA的整合，因此轉(zhuǎn)化率相對較高。但是，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間超過4天時(shí)，葉盤的切口己經(jīng)基本愈合，創(chuàng)傷產(chǎn)生的小分子酚類物質(zhì)等基因誘導(dǎo)物減少，處于轉(zhuǎn)化的不敏感期，從而不利于農(nóng)桿菌的侵染及外源基因的整合，使轉(zhuǎn)化率降低。_表2、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對小對葉轉(zhuǎn)化的影響_預(yù)培養(yǎng)時(shí)/d外植體數(shù)不定芽誘導(dǎo)率(％)抗性芽率(％)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、不同農(nóng)桿菌菌液濃度對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。同時(shí)，適宜的菌液濃度，也說明農(nóng)桿菌處于生長的指數(shù)期，酶系活躍，代謝旺盛，此時(shí)用于轉(zhuǎn)化，可以得到較高的轉(zhuǎn)化率。菌液濃度越大，附著于外植體傷口的農(nóng)桿菌的數(shù)量越多，侵染外植體的機(jī)率就越大。但是菌液濃度過高，會使葉片上附著的農(nóng)桿菌過多，經(jīng)過共培養(yǎng)會導(dǎo)致菌體過量生長，最終會致使葉盤褐化死亡；而菌液濃度過低，葉盤附著的農(nóng)桿菌過少，減少了T-DNA整合的機(jī)率，從而大大降低了轉(zhuǎn)化率。取對數(shù)生長期的、0D柳值分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0七種不同濃度的農(nóng)桿菌菌液，用七種不同濃度的農(nóng)桿菌菌液分別侵染小對葉無菌苗，其它轉(zhuǎn)化條件均相同，通過比較共培養(yǎng)后的不定芽誘導(dǎo)率以及抗性芽率，選擇最適合的ODe。。值作為侵染的最佳濃度。結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，當(dāng)菌液濃度0D6。。值在0.4-0.6的范圍內(nèi)時(shí)效果比較好，其中OD6oo值為0.5時(shí)抗性芽率最高、效果最好。當(dāng)菌液濃度的OD目值為0.8及以上時(shí)，農(nóng)桿菌對葉盤的傷害加大，得到的抗性芽率較低甚至沒有；當(dāng)菌液濃度的ODeoo值低于0.3時(shí)，抗性芽率最低。表3、；R桿菌菌液對小對葉轉(zhuǎn)化的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、不同侵染時(shí)間對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的長短對小對葉葉盤轉(zhuǎn)化也有一定影響。若小對葉葉盤在菌液中浸泡的時(shí)間過長，會因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐，且在篩選培養(yǎng)時(shí)抑制農(nóng)桿菌的生長困難。而浸泡的時(shí)間過短，農(nóng)桿菌還末充分附著到葉盤傷口面，減少了農(nóng)桿菌的結(jié)合機(jī)率，從而降低轉(zhuǎn)化率。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉片用相同濃度的農(nóng)桿菌菌液侵染，侵染時(shí)間設(shè)置成不同梯度，分別為3、5、7、10、15、20min，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其它轉(zhuǎn)化條件均相同，觀察不同侵染時(shí)間對葉片外植體生活力的影響，統(tǒng)計(jì)抗性芽率。結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，侵染時(shí)間為5-IO分鐘時(shí)，效果比較好，其中侵染7分鐘的效果最好。當(dāng)侵染時(shí)間為3min時(shí)，抗性芽率為0%，不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化；當(dāng)侵染時(shí)間延長到7min時(shí)，抗性芽率有顯著的提高；而隨著時(shí)間的延長，最終得到的抗性芽率并不高，呈現(xiàn)下降趨勢，一方面可能是因?yàn)榍秩緯r(shí)間的延長雖然能提高葉盤的接菌量，有利于提高轉(zhuǎn)化效率，但在菌液中浸泡時(shí)間越長，葉片受菌液傷害的程度就越嚴(yán)重，葉片再生就越困難；另一方面可能是因?yàn)檗r(nóng)桿菌的繁殖速度很快，培養(yǎng)后期易出現(xiàn)農(nóng)桿菌過度生長殺死葉盤的現(xiàn)象。與侵染7min的處理相比，侵染15min處理的葉盤受害程度嚴(yán)重，出現(xiàn)切口變褐、壞死，邊緣部位呈熱水浸漬狀傷害，個(gè)別葉片明顯失綠。這些葉盤在后續(xù)培養(yǎng)過程中，難以存活。表4、不同的侵染時(shí)間對小對葉轉(zhuǎn)化的影響浸染時(shí)間(min)外植體數(shù)不定芽誘導(dǎo)率(％)抗性芽率(％)312022.500.00512021.674.17712025.007.501012020.833.331512014.171.67201200.000.00四、不同共培養(yǎng)時(shí)間對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化影響很大，因?yàn)檗r(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都是在共培養(yǎng)期間完成的。當(dāng)農(nóng)桿菌侵染小對葉葉盤后，農(nóng)桿菌附著在創(chuàng)傷的植物細(xì)胞上，并不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16h之后才能誘發(fā)菌株產(chǎn)生腫瘤，這一段時(shí)間稱為"細(xì)胞調(diào)節(jié)期"。因此共培養(yǎng)時(shí)間必須長于16h，但若共培養(yǎng)時(shí)間太長，由于農(nóng)桿菌的過度生長，植物細(xì)胞會因受到毒害而死亡。若共培養(yǎng)時(shí)間過短，又不能完成轉(zhuǎn)化過程。只有合宜的共培養(yǎng)時(shí)間才會使農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上正常增殖，并順利地在葉盤與培養(yǎng)基的接觸部位形成肉眼可見的菌落，從而保證遺傳轉(zhuǎn)化過程的完成。將經(jīng)過相同條件進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的葉盤，分別共培養(yǎng)0、2、4、6、8天，然后再進(jìn)行其它遺傳轉(zhuǎn)化步驟，除共培養(yǎng)時(shí)間不同外，其余遺傳轉(zhuǎn)化步驟均相同，60天后統(tǒng)計(jì)抗性芽率。結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，不經(jīng)共培養(yǎng)直接轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基中，雖然可以得到很高的不定芽誘導(dǎo)率，但是抗性芽率為0%;隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，葉盤轉(zhuǎn)化效率明顯提高，在共培養(yǎng)4天時(shí)，抗性芽率最高，為6.67%，共培養(yǎng)6天時(shí)，效果也比較好，抗性芽率為3.33%;在共培養(yǎng)8天時(shí)，農(nóng)桿菌生長過于旺盛，在選擇培養(yǎng)時(shí)難以抑制，使葉盤嚴(yán)重受傷，不定芽誘導(dǎo)率和抗性芽率降至0%，不利于轉(zhuǎn)化體的獲得。表5、不同的共培養(yǎng)時(shí)間對小對葉3睹化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>五、脫菌培養(yǎng)中抗菌素濃度的確定(一)頭孢霉素(Cef)抑制農(nóng)桿菌濃度的確定農(nóng)桿菌浸染植物后，一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是要抑制農(nóng)桿菌的過度生長，必須利用一種抗生素來殺死農(nóng)桿菌，阻止農(nóng)桿菌對遺傳轉(zhuǎn)化的破壞作用，即需要脫菌培養(yǎng)。在脫菌培養(yǎng)過程中，必須有一個(gè)適合的抑菌劑濃度范圍，保證抑菌劑在能夠有效地抑制農(nóng)桿菌菌株生長的前提下，最大限度地降低對植物外植體生長的影響。Cef對農(nóng)桿菌有很好的抑制作用。實(shí)驗(yàn)方法如下在9ml含有不同濃度Cef的YEB液體培養(yǎng)基中分別加入lml相同濃度的農(nóng)桿菌菌液，于28'C，180r/min振蕩培養(yǎng)，其中，YEB液體培養(yǎng)基中Cef的濃度(mg/l)分別為100、200、250、300、350、400、450、500，其余實(shí)驗(yàn)條件均相同，向9ml不含有抗生素Cef的YEB母液中加入lral農(nóng)桿菌菌液以作為陽性對照，以10ml不含有抗生素Cef且不含有農(nóng)桿菌的YEB母液作為陰性對照，每種濃度重復(fù)3次。培養(yǎng)16小時(shí)后，在波長600nm下用紫外分光光度計(jì)測定其紫外吸收值ODe。。，并計(jì)算三個(gè)重復(fù)樣品值的算術(shù)平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，振蕩培養(yǎng)后，陽性對照管變混濁，陰性對照管清亮透明，濃度為100mg/1、200mg/lCef的實(shí)驗(yàn)管比陰性對照管稍微混濁，250mg/lCef的實(shí)驗(yàn)管稍微有一點(diǎn)點(diǎn)混濁，當(dāng)Cef濃度為300mg/l-500mg/l時(shí)，菌液的平均ODe。。值都非常低，均能抑制農(nóng)桿菌菌株的生長，因此濃度為300mg/l-500mg/l的Cef為抑制農(nóng)桿菌的濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)頭孢霉素Cef對小對葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響抑菌劑不僅對農(nóng)桿菌有殺傷或抑制作用，而且對植物細(xì)胞也具有一定的生物效應(yīng)。不同濃度的Cef對愈傷組織誘導(dǎo)影響有明顯差異，低濃度時(shí)能促進(jìn)外植體分化形成愈傷組織，但高濃度時(shí)能抑制甚至完全抑制外植體愈傷組織的分化。將小對葉無菌葉片接種于加有不同濃度Cef的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1中，除培養(yǎng)基中Cef濃度不同外，其余實(shí)驗(yàn)條件均相同。Cef共設(shè)8個(gè)濃度梯度(mg/1):100、200、250、300、350、400、450、500，以未加抗生素的培養(yǎng)基為對照。每瓶接種10個(gè)外植體，每種濃度接種4瓶，培養(yǎng)溫度控制在(25士2)'C，光照強(qiáng)度1800Lx，光照時(shí)間12h.d—1。每10天換一次培養(yǎng)基。20天后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖l所示，表明，外植體培養(yǎng)20天后，大部分葉片能夠形成愈傷組織，各種濃度Cef的培養(yǎng)基差異不大，同時(shí)所形成的愈傷組織的大小、顏色與對照組相比也都無明顯差別。雖然隨著Cef濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率有下降趨勢，但是這種趨勢并不明顯，只是在Cef濃度為500mg/l時(shí)的誘導(dǎo)率稍低了一些。因此表明Cef對小對葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響不大，結(jié)合Cef的抑菌實(shí)驗(yàn)，確定以450mg/l的Cef作為脫菌濃度。六、篩選培養(yǎng)中選擇壓和不同篩選方法對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響(一)篩選培養(yǎng)中選擇壓的確定1、抗生素種類及濃度設(shè)置抗生素卡那霉素(Kanamycin，Kan)(Amresco公司)、潮霉素(Hygromycin,Hyg)(Roche公司)。配制參考Sambrook等的方法，母液質(zhì)量濃度均為50mg.L兩種抗生素濃度梯度設(shè)置如下卡那霉素0、5mg.L—1、7mg.L—\10mg.L—'、12mg.L一1、15mg.L—\20mg.L一1、25mg.L—1;潮霉素0、3mg.L—\5mg.L—'、7mg.L—\8mg.L—\9mg.L—'、10mg.L—1、12mg.L—1，2、抗生素對小對葉離體葉片分化的影響用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒在構(gòu)建時(shí)已經(jīng)嵌合了抗生素抗性標(biāo)記基因,可以使被轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株對該抗生素產(chǎn)生抗性，能正常生長、發(fā)育，并分化成植株；而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞因?yàn)闆]有抗生素抗性標(biāo)記基因，所以不能在附加抗生素的培養(yǎng)基上生長、發(fā)育。植物基因工程中，對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選時(shí),首先要根據(jù)用于侵染的菌株所攜帶的抗生素抗性標(biāo)記基因的不同，而使用不同種類的抗生素?？股氐氖褂脻舛纫虿煌闹参锊牧隙?。若濃度過高，會殺死已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；而濃度過低又會使大量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞得以生長。因此，在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化之前對待轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行抗生素敏感性測定，是建立遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的必然條件。實(shí)驗(yàn)方法如下取培養(yǎng)2周的小對葉無菌苗葉片，切成0.5cmX0.5cm的小塊，接種于MS1培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)后，再分別接種于添加不同濃度梯度的二種抗生素的MS2培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，以誘導(dǎo)分化出芽。除抗生素種類及濃度不同外，其余實(shí)驗(yàn)條件均相同。每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)選用30個(gè)外植體。觀察不同抗生素種類及其不同濃度對葉片不定芽誘導(dǎo)的影響，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(1)不同濃度的卡那霉素對小對葉離體葉片分化的影響結(jié)果如表7和圖2所示。表明，卡那霉素對小對葉葉片的分化有抑制作用，且隨著濃度的提高作用增強(qiáng)，葉片的褐化程度也越嚴(yán)重，產(chǎn)生白化芽也越多。當(dāng)卡那霉素濃度為12mg.L—'時(shí)，葉片出芽率大幅度下降，僅為5.56%，15mg.L—i的卡那霉素已能完全抑制不定芽的發(fā)生。濃度為20mg.L—1或以上時(shí)葉片切口處均無愈傷組織分化，20天后葉片呈黃褐色，全部死亡。研究結(jié)果表明卡那霉素篩選的適宜濃度為15mg.L一1。表7、卡那霉素對小對葉離體葉片分化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)不同濃度的潮霉素對小對葉離體葉片分化的影響潮霉素對許多種植物都產(chǎn)生很髙的毒性，因?yàn)樗且环N很強(qiáng)的細(xì)胞生長抑制劑，它抑制核糖體上肽鏈的延長，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。潮霉素對小對葉離體葉片分化的影響結(jié)果如表8和圖3所示，結(jié)果表明，小對葉葉片分化對潮霉素特別敏感，8mg.L—'的潮霉素對葉片愈傷組織的形成及芽分化已產(chǎn)生明顯的抑制作用，20天后濃度大于9mg.L…的外植體葉片開始出現(xiàn)萎縮、失綠、褐化現(xiàn)象，且隨著濃度的升高，葉片褐化程度明顯增加。10mg.L—i的潮霉素已能完全抑制葉片愈傷組織和不定芽的分化，是適宜的篩選濃度。濃度為12mg.L—i及以上時(shí)外植體葉片全部死亡。表8、潮霉素對小對葉離體葉片分化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)小對葉離體葉片對二種抗生素的敏感程度比較二種抗生素對小對葉葉片分化的抑制程度不同。當(dāng)葉片分別接種到含有相同濃度的二種抗生素的培養(yǎng)基上時(shí)，其分化的生長狀態(tài)明顯不同(圖4)。當(dāng)抗生素濃度為IOmg.L—'時(shí)，含有卡那霉素的培養(yǎng)基上的葉片褐化死亡的程度比較嚴(yán)重，而且分化率也較低，僅為30%;含有潮霉素的培養(yǎng)基上的葉片已全部死亡。應(yīng)用MicrosoftExcel表格，繪制出抗生素與小對葉離體葉片分化率的回歸圖，見圖4?；貧w曲線的方程分別為卡那霉素yi3.21-4.23x;潮霉素y二98.15-9.34x?；貧w方程斜率的絕對值反映的是抗生素對植物的危害程度的大小，斜率的絕對值越大，說明該抗生素對外植體的分化抑制作用越強(qiáng)烈。從圖4可看出，小對葉對二種抗生素的敏感程度為潮霉素〉卡那霉素。(4)Hyg對小對葉試管苗生根的影響植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，尤其是以器官發(fā)生途徑再生植株的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，往往會產(chǎn)生較多的嵌合體或假轉(zhuǎn)化體。因此，在轉(zhuǎn)化苗生根時(shí)施用適當(dāng)濃度的選擇劑對于轉(zhuǎn)基因植株的進(jìn)一步篩選具有重要作用。將長勢一致的小對葉試管苗，分別接種于添加不同濃度Hyg(O,3，5，7，8,9，lOrag/1)的生根培養(yǎng)基MS4中，觀察不同濃度的選擇劑對試管苗生根及生長的影響，以確定生根時(shí)篩選轉(zhuǎn)化苗的合適選擇壓力，除生根培養(yǎng)基中潮霉素濃度不同外，其余實(shí)驗(yàn)條件均相同。每種濃度接種5瓶，每瓶接10個(gè)外植體。20天后，統(tǒng)計(jì)試管苗的生根率、平均根數(shù)及平均根長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示，表明，試管苗對Hyg特別敏感，僅3mg/l的Hyg即可使試管苗的生根受到一定影響，生根率下降到64%，且生根條數(shù)和根的長度都受到抑制；而當(dāng)Hyg濃度增加為7mg/l時(shí)，試管苗生根能力則立即下降到12%，幼苗的生長也明顯減慢；9mg/1以上的Hyg使試管苗完全不能生根，而且隨著Hyg濃度的增加，幼苗逐漸停止生長，葉片黃化，芽的生長點(diǎn)死亡。因此，在生根時(shí)，為進(jìn)一步篩選小對葉轉(zhuǎn)化苗，Hyg的濃度應(yīng)確定在9mg/1。表9、不同濃度的潮霉素對z」、對葉試管苗生根的影口<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(二)不同選擇方法對小對葉離體葉片分化的影響轉(zhuǎn)化芽的選擇采用三種方法一是前期選擇，共培養(yǎng)后的葉盤直接轉(zhuǎn)入含有Hygl0mg/1的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化芽的再生；二是延遲選擇，共培養(yǎng)后的葉盤先在不含Hyg的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，再轉(zhuǎn)入Hygl0mg/1的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)；三是后期選擇，共培養(yǎng)后的葉盤接種在不含Hyg的培養(yǎng)基中，直到分化出不定芽，然后再轉(zhuǎn)到HyglOmg/l的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。這三種方法獲得的再生芽在含有Hygl0mg/1的繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選。以上3種選擇培養(yǎng)過程中，各種培養(yǎng)基中均加入Cef450mg/1以抑制農(nóng)桿菌的生長。50天后統(tǒng)計(jì)抗性芽率。當(dāng)外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，整合與表達(dá)以及表達(dá)量的積累都需要有一個(gè)過程。因此，加入篩選壓的時(shí)間及共培養(yǎng)后延遲多長時(shí)間進(jìn)行篩選都會影響到轉(zhuǎn)化的成敗。共培養(yǎng)后先在無Hyg，只含有Cef的分化培養(yǎng)基上延遲篩選分化一段時(shí)間后，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，這可以讓剛侵染過的植物細(xì)胞生理狀態(tài)在無Hyg篩選時(shí)有機(jī)會恢復(fù)，并且能分裂增殖，而其后再轉(zhuǎn)入較髙濃度的Hyg篩選培養(yǎng)基中，又能使非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞受到抑制，有利于提高轉(zhuǎn)化率。但是隨著延遲篩選時(shí)間的延長，葉盤在篩選培養(yǎng)基中的再生率逐漸升高，但超過一定時(shí)間，假抗性愈傷組織也隨之增加，影響后期的鑒定工作量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hyg的延遲篩選可有效提高抗性愈傷和芽苗的比率，轉(zhuǎn)化的外植體在轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基時(shí)，如果立即加入Hyg，即使在很低的濃度下，絕大多數(shù)外植體也會白化死亡，愈傷組織誘導(dǎo)率很低，而且也很難分化出Hyg抗性芽。這可能是由于在轉(zhuǎn)化的最初階段，在含Hyg的選擇培養(yǎng)基上，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于數(shù)量少、生長能力弱，對Hyg抗性還不強(qiáng)，難以生長獲得轉(zhuǎn)化體。延遲篩選時(shí)間過長則會因?yàn)榉寝D(zhuǎn)化細(xì)胞的大量活躍生長，對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長處于劣勢，因此雖然愈傷誘導(dǎo)率很高，但隨著進(jìn)一步篩選培養(yǎng)，很多外植體都會褐化死亡，也難以有效分化出抗性芽苗來。實(shí)驗(yàn)確定一般以延遲7天篩選為佳。七、乙酰丁香酮(AS)對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響乙酰丁香酮是一類酚類化合物，根據(jù)農(nóng)桿菌感染植物的作用機(jī)制，AS對Vir區(qū)基因的活化具有重要的作用，有助于提高農(nóng)桿菌對植物的轉(zhuǎn)化效率。理論上，T-DNA的轉(zhuǎn)移發(fā)生在共培養(yǎng)階段，侵染過程一般認(rèn)為不會發(fā)生T-DNA的轉(zhuǎn)移，較多的研究者認(rèn)為在共培養(yǎng)階段添加AS更能提高轉(zhuǎn)化效率。在其它實(shí)驗(yàn)條件均相同的情況下，分別采用以下方法添加AS:(l)侵染時(shí)加入不同濃度的AS,即用液體MS重懸溶液懸浮農(nóng)桿菌時(shí)加入不同濃度的AS;(2)在共培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基中加入不同濃度的AS;(3)在侵染液和共培養(yǎng)基中均加入不同濃度的AS。以不加AS為對照，觀察三種處理對不定芽誘導(dǎo)率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表IO所示，結(jié)果表明，在不添加AS的處理中，抗性芽誘導(dǎo)率很低，僅為1.67%;在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入AS要好于在菌液中加入AS;在菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中都添加AS的效果最好，且菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS濃度均為lOOnig/L,抗性芽誘導(dǎo)率高達(dá)7.5%。表10、乙酰丁香酮對小對葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)向小對葉中轉(zhuǎn)入GUS基因和GFP基因本實(shí)施例的遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下先將小對葉無菌苗葉片，切成0.5cmX0.5cra的小塊，接種于MS1培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行浸染，將材料放入用愈傷組織液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1稀釋到一定0D值的菌液中，期間不斷輕輕晃動浸染瓶，使材料切口充分與菌液接觸。取出后用滅菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入到脫菌培養(yǎng)基中，一周后再轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基中，每10天繼代一次。40天后可看到有篩選到的抗性分化芽。待篩選的抗性芽長到2-3cm左右時(shí)，切下單芽苗轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，繼而得到完整植株。一、重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建載體pC扁IA1303(CAMBIA)(GenBank序列號為AF234299，參考文獻(xiàn)JOURNALPlantMol.Biol.1994,25(6),989~994)。將載體pCAMBIA1303導(dǎo)入農(nóng)桿菌通過電擊轉(zhuǎn)化法將載體pCAMBIA1303導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，電擊轉(zhuǎn)化儀為GenePulserXCell(Bio-Rad)，方法參照電擊轉(zhuǎn)化儀操作手冊。陽性重組農(nóng)桿菌的篩選方法挑選在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基(含0.8%瓊脂)生長的單菌落，得到含有載體pCAMBIA1303的重組農(nóng)桿菌，命名為重組根癌農(nóng)桿菌(Ato7e/a"e/^)LBA4404/pCAMBIA1303。菌株的保存在已滅菌的1.5ml離心管中加入700ml培養(yǎng)過夜的重組根癌農(nóng)桿菌(At咖e/3CJ'e/s)LBA4404/pC細(xì)IA1303菌液和700ml25%的甘油，放入-80。C冰箱中長期保存；若不需長期保存，可放入4'C冰箱保存，每半個(gè)月活化一次。二、遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(一)根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)用接種環(huán)刮取步驟一獲得的重組根癌農(nóng)桿菌".Z^/Be/a"e7^)LBA4404/pCAMBIA1303后直接在含有50mg/L卡那霉素(Kan)的YEB固體培養(yǎng)基上劃線；將平板倒置于28'C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至產(chǎn)生單菌落；挑取一個(gè)農(nóng)桿菌單菌落，接種于30ml含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，放入28°C、180r/min恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過夜；取3ml農(nóng)桿菌菌液，加入到30ml含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，在相同的條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期；將30ml對數(shù)生長期的菌液離心，收集菌體，用含有100mg/LAS的MSi液體培養(yǎng)基重懸，并使其紫外吸收值0D6。。的值為0.5，以作為接種外植體的菌液。(二)小對葉外植體的預(yù)培養(yǎng)將小對葉葉片用自來水沖洗l-2小時(shí)，然后用0.1%升汞泡2min，再用無菌蒸餾水沖洗5-6次；將滅過菌的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1上，在溫度控制在(25士2)。C、光照強(qiáng)度1800Lx、光照時(shí)間12h/d的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)2天，選取切口開始形成愈傷組織的用于接種。(三)重組農(nóng)桿菌侵染小對葉外植體將步驟(二)中制備的小塊小對葉外植體浸泡在步驟(一)中制備的接種外植體的菌液中，侵染時(shí)間是7min;然后將接種菌體后的外植體放在無菌吸水紙上吸干外植體非傷面的菌液，以備共培養(yǎng)。(四)農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將步驟(三)獲得的接種菌體后的外植體置于含有100mg/LAS的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1中，在溫度控制在(25士2)°C、光照強(qiáng)度1800Lx、光照時(shí)間12h/d的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間是4天。(五)脫菌培養(yǎng)將步驟(四)中共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有450mg/1Cef的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1中，在(25士2)。C、光照強(qiáng)度1800Lx、光照時(shí)間12h.d—1的條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。(六)篩選培養(yǎng)將步驟(五)中脫菌培養(yǎng)后的外植體，置于含有10mg.L—力yg及450mg/1Cef的芽分化培養(yǎng)基MS2中，在溫度控制在(25士2)。C、光照強(qiáng)度1800Lx、光照時(shí)間12h/d的條件下繼續(xù)培養(yǎng)以誘導(dǎo)出芽。(七)生根培養(yǎng)將步驟(六)中誘導(dǎo)出的不定芽切入含有9mg/lHyg生根培養(yǎng)基MS4中，在溫度控制在(25士2)°C、光照強(qiáng)度1800Lx、光照時(shí)間12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。(八)轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測1、用CTAB法提取遺傳轉(zhuǎn)化的小對葉的DNA(1)稱取步驟(七)獲得的小對葉葉片0.1g，迅速在液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入到1.5ml的離心管中。(2)加入700W經(jīng)65'C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后置65'C水浴45-60min，每23min搖勻一次。(3)取出置于冰上，待冷卻后加入700W酚氯仿異戊醇，輕輕顛倒混勻，4°C，12000rpm離心10min。(4)取上清，加等體積的氯仿異戊醇，輕緩顛倒混勻，4'C，12000rpra離心10min。(5)取上清(若混濁可重復(fù)3、4步驟1-2次)，加入1/10體積的3MNaAC和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇(或等體積異丙醇)，緩慢混勻，-8(TC純沉15min。(6)4°C，12000rpm離心10min，棄上清，加入70%乙醇洗沉淀1-2次，將離心管倒置于濾紙上，使液體流盡，在空氣中使核酸沉淀干燥。(7)抽干后溶于適量TE或去離子滅菌水中，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?8)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相。結(jié)果如圖5所示。2、PCR擴(kuò)增檢測擴(kuò)增GUS基因的引物為5，GCAACTGGACAAGGCACT3，和5，GCGTCGCAGAACATTACA3，；擴(kuò)增GFP基因的引物為5，ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3'禾卩5'TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA3';引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為模板DNA1W，正向引物1W，反向引物1W,10Xbuffer2.5W，EXTaqDNA聚合酶(5U/W)0.5W，滅菌蒸餾水補(bǔ)充至25W。PCR反應(yīng)程序?yàn)?GUS基因94。C7min反應(yīng)完畢后，取5W擴(kuò)增產(chǎn)物在含EB的0.8呢瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)照相。每次反應(yīng)以pCAMBIA1303的DNA為陽性對照，以未轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303的小對葉DNA為陰性對照，以水為空白對照。結(jié)果表明陽性質(zhì)粒對照和轉(zhuǎn)基因植株均能擴(kuò)增出大小一致的條帶，擴(kuò)增GUS基因的產(chǎn)物為680bp(圖6，其中，M表示Marker;1表示擴(kuò)增pCAMBIA1303的DNA的結(jié)果即陽性對照；2-7表示轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303的植株;8-9表示未轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303的植株即陰性對照；IO表示空白對照)，擴(kuò)增GFP基因的產(chǎn)物為480bp(圖7，其中，M:Marker;1:表示擴(kuò)增pCAMBIA1303的DNA的結(jié)果即陽性對照；2-4:表示轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303的植株；5-7:表示未轉(zhuǎn)入pCAMBIA1303的植株即陰性對照；8:94。C55。C72。C72。C4。CGFP基因94。C94。C50。C72。C72。C4°C表示空白對照。)；而未轉(zhuǎn)任何基因的小對葉不能擴(kuò)增出任何條帶。以上結(jié)果證明外源基因已整合到小對葉細(xì)胞核基因組中。本實(shí)驗(yàn)中，一共將120塊外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中得到能誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)目為9塊，即抗性芽率為7.5%，表明本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)染效率高。實(shí)施例3、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)向小對葉中轉(zhuǎn)入GUS基因和GFP基因在本實(shí)施例中，除以下各實(shí)驗(yàn)條件不同外，其余步驟均與實(shí)施例2中所述相同-(1)用于侵染的目的農(nóng)桿菌菌液為處于對數(shù)生長期的、0De。。值為0.4的目的農(nóng)桿菌菌液；所述侵染的時(shí)間優(yōu)選為5分鐘。(2)外植體預(yù)培養(yǎng)l天。(3)共培養(yǎng)5天。通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測GUS和GFP基因是否轉(zhuǎn)入植株中，得到的結(jié)果與實(shí)施例2中一致。在以上條件下，得到的抗性芽率為6.67%。實(shí)施例4、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)向小對葉中轉(zhuǎn)入GUS基因和GFP基因(下限值)在本實(shí)施例中，除以下各實(shí)驗(yàn)條件不同外，其余步驟均與實(shí)施例2中所述相同:(1)用于侵染的目的農(nóng)桿菌菌液為處于對數(shù)生長期的、ODeoo值為0.6的目的農(nóng)桿菌菌液；所述侵染的時(shí)間優(yōu)選為10分鐘。(2)外植體預(yù)培養(yǎng)3天。(3)共培養(yǎng)6天。通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測GUS和GFP基因是否轉(zhuǎn)入植株中，得到的結(jié)果與實(shí)施例2中一致。在以上條件下，得到的抗性芽率為3.33%。權(quán)利要求1、一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟以小對葉的葉片為外植體，用處于對數(shù)生長期的、OD600值為0.4-0.6的目的農(nóng)桿菌菌液侵染所述外植體5-10分鐘；所述目的農(nóng)桿菌菌液的0D600值優(yōu)選為0.5，所述侵染的時(shí)間優(yōu)選為7分鐘。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中還包括在所述侵染之前，對外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的步驟，所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為l-3天，優(yōu)選為2天。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括在所述侵染之后進(jìn)行共培養(yǎng)的步驟，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為4-6天，優(yōu)選為4天。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中還包括在所述共培養(yǎng)之后進(jìn)行脫菌培養(yǎng)的步驟，所述脫菌培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基含有450mg/L的頭孢霉素。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的農(nóng)桿菌含有潮霉素抗性基因。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中在所述脫菌培養(yǎng)后還包括篩選培養(yǎng)的步驟，所述篩選培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述脫菌培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入含有10mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分化得到芽。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述篩選培養(yǎng)方法中還包括如下步驟將所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。8、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的農(nóng)桿菌菌液中含有100mg/L乙酰丁香酮。9、根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有100mg/L乙酰丁香酮。全文摘要本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明所公開的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小對葉遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟以小對葉的葉片為外植體，用處于對數(shù)生長期的、OD₆₀₀值為0.4-0.6的目的農(nóng)桿菌菌液侵染所述外植體5-10分鐘；所述目的農(nóng)桿菌菌液的OD₆₀₀值優(yōu)選為0.5，所述侵染的時(shí)間優(yōu)選為7分鐘。用本發(fā)明方法對小對葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到的抗性芽率為7.5％，表明本方法轉(zhuǎn)化效率高。因此，本發(fā)明方法為使外源基因在小對葉中穩(wěn)定表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，對小對葉的遺傳改良有十分重要的意義。文檔編號C12N15/82GK101338320SQ200810112349公開日2009年1月7日申請日期2008年5月22日優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日發(fā)明者旸關(guān),吳麗爽,王曉萍,郭東林,郭長虹申請人:哈爾濱師范大學(xué)