專利名稱：一種超臨界CO₂條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Q₁₀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備輔酶Qh)的方法，特別涉及一種在超臨界C02條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Qu)的方法。
背景技術(shù)：
超臨界C02作為一種反應(yīng)和萃取介質(zhì)，條件溫和，有較大的擴(kuò)散系數(shù)，溶解能
力和介電常數(shù)對(duì)溫度和壓力敏感，且無毒、不燃、經(jīng)濟(jì)，不產(chǎn)生溶劑殘留，因此可以作為酶催化反應(yīng)良好的反應(yīng)介質(zhì)。
輔酶Qu)由于其特殊的生理生化功能而被廣泛應(yīng)用于臨床、保健等領(lǐng)域，近幾年隨著對(duì)其研究的深入，其應(yīng)用領(lǐng)域、需求量等都在擴(kuò)大。目前生產(chǎn)輔酶Qu)的方法主要有組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵及轉(zhuǎn)化法。前兩種由于原料和成本條件限制而未被廣泛應(yīng)用，微生物轉(zhuǎn)化法因反應(yīng)條件溫和、速度快且底物無毒無害而備受關(guān)注，但不足之處在于易受產(chǎn)物抑制而降低產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備輔酶Qw的方法。
本發(fā)明所提供的制備輔酶Qw的方法，是將粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培養(yǎng)基中，在溫度為25-35°C、壓力為5-20MPa的超臨界C02的環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，得
到輔酶Q1Q。其中，接入所述培養(yǎng)基的粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比可以為茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的濕菌重=(10-50) rag: lg。
接入所述培養(yǎng)基的粟酒裂殖酵母菌與所述培養(yǎng)基的質(zhì)量配比可以為粟酒裂殖酵母菌的濕菌重培養(yǎng)基=1:(1-4)。
上述粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比具體可以為茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的濕菌重=10 mg: lg。
上述粟酒裂殖酵母菌與所述培養(yǎng)基的質(zhì)量配比具體可以為粟酒裂殖酵母菌的
濕菌重培養(yǎng)基=1: 4。
上述培養(yǎng)基可以為任一種可以培養(yǎng)粟酒裂殖酵母菌的培養(yǎng)基。
所述超臨界co2的溫度具體可以為3rc。
3所述發(fā)酵的時(shí)間可以為8-24h。所述發(fā)酵的時(shí)間具體可以為20h。所述發(fā)酵結(jié)束后，以0.2-0. 5MPa/min的速度卸壓。
本發(fā)明方法利用超臨界C02的擴(kuò)散系數(shù)高及溶解能力良好的特點(diǎn)，以增加輔酶Q^前體——茄尼醇的溶解度，另外，由于輔酶Qu)不易溶于水，在常規(guī)發(fā)酵條件下克服產(chǎn)物抑制的方法有限，而超臨界C02可通過改變溫度和壓力而具有溶解輔酶Q1Q的能力。因此本發(fā)明方法充分利用超臨界C02的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)物抑制作用，且給酵母提供了高厭氧環(huán)境，改變了微生物的呼吸鏈供氧方式，從而促進(jìn)了輔酶Qm的合成；而且本發(fā)明方法中添加了茄尼醇作為輔酶Qu)合成的底物，提高了輔酶Qw合成的速度及產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法制備得到的輔酶Qu)產(chǎn)量比一般發(fā)酵方法提高60%-162%。


圖1為輔酶Q,。標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜。
圖2為樣品中輔酶QwHPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、超臨界C02條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Qu)一、菌的培養(yǎng)
將粟酒裂殖酵母菌(6: p/^^，購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生
物中心，產(chǎn)品目錄號(hào)2. 1794)接種到斜面活化培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中28。C培養(yǎng)24h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，28。C搖床培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后以10%的接種量接種到5個(gè)分別盛有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ral三角瓶中，在200r/min的轉(zhuǎn)速下、28"C搖床培養(yǎng)18h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期。
斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.0，瓊脂2%，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
液體活化培養(yǎng)基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， p服.O，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，MgS041.0g/L ， K2HP04 3H20 1. Og/L ， KH2P041. Og/L，其余為水，pH5. 0。 121°C滅菌15min。
二、 超臨界C02條件下利用粟酒裂殖酵母菌制備輔酶Q,。
將步驟一得到的發(fā)酵液離心(3000g， 10min)，收集菌體并用質(zhì)量濃度為0. 85%生理鹽水洗滌兩遍，離心后稱量濕重。(本實(shí)驗(yàn)采取的濕重的測(cè)定方法為將細(xì)胞離心(3000g， 10min)后，倒去上清液后在濾紙上倒置2min后稱重。)取一定質(zhì)量的菌，將其接入4倍于濕菌菌體質(zhì)量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入茄尼醇，使茄
尼醇與菌體的濕菌重配比為茄尼醇菌體濕菌重40mg : lg;然后將反應(yīng)體系放入超臨界C02裝置中，調(diào)整溫度為3rC，壓力升至9MPa，保持該壓力和溫度下轉(zhuǎn)化20h后，以0. 25MPa/min的速度卸壓。
以未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系和經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系作為對(duì)照。
三、 輔酶Qw的提取及檢測(cè)
1、 提取方法步驟二的轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將菌體離心(3000g， 10min)，收集菌體，分離上清，收集的菌體用質(zhì)量濃度為0.85%的生理鹽水洗滌兩遍，菌體懸浮于25ml磷酸緩沖液(pH5. 0)30min，加入38 u 1巰基乙醇，于搖床中作用3h(37。C，200rpm)，然后加入蝸牛酶(拜爾迪生物技術(shù)公司)作用lh (其中濕菌重與蝸牛酶質(zhì)量配比為100: 3)，超聲波粉碎儀在冰浴條件下破碎細(xì)胞(超聲條件超聲功率為500w，超聲60次，超聲時(shí)間5s，間隔時(shí)間6s)，加入等體積(約25ml)石油醚萃取，取上層，用去離子水洗至中性，無水硫酸鈉脫水至澄清，氮吹濃縮干燥(37'C水浴)，加入10ml無水乙醇清洗，收集清洗液，4X:冰箱冷析，除去固醇等雜質(zhì)，過0.45um濾膜，待測(cè)。
2、 檢測(cè)方法色譜柱為Spherisorb C18fe， 150mmX4.6mm， 5ym，色譜柱填充料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱溫22-23°C。采用無水乙醇水(98: 2)為流動(dòng)相，流速為lml/min，進(jìn)樣量20 u 1，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm。
標(biāo)準(zhǔn)品輔酶Qu)的保留時(shí)間為12. 408min，樣品中輔酶Q!。保留時(shí)間為12. 039min。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的圖譜分別如圖1和圖2所示。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。樣品中輔酶Qu)的峰面積分別為1066.63、1054.72、 1037.86。結(jié)果測(cè)得輔酶Qi。產(chǎn)量為0. 41mg/g(濕菌重)，比對(duì)照未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的方法產(chǎn)量增加了 161.8%，比經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但未添加茄尼醇的方法提高了 128. 4%。實(shí)施例2、超臨界C02條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Q1Q
一、 菌的培養(yǎng)
將粟酒裂殖酵母菌(5: proz^，購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，產(chǎn)品目錄號(hào)2. 1794)接種到斜面活化培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中35i:培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，35。C搖床培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，然后以5%的接種量接種到5個(gè)分別盛有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在250r/min的轉(zhuǎn)速下、35。C搖床培養(yǎng)24h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期。
斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物P/。， p朋.5，瓊脂2%，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
液體活化培養(yǎng)基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.5，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L ，酵母膏12g/L，MgS041.2g/L ， K2HP04 3H20 1. 2g/L ， KH2P041. 2g/L，其余為水，pH5. 5。 121。C滅菌15min。
二、 超臨界C02條件下利用粟酒裂殖酵母菌制備輔酶Qh)
將步驟一得到的發(fā)酵液離心(3000g， 10min)，收集菌體并用質(zhì)量濃度為0. 85%生理鹽水洗滌兩遍，離心后稱量濕重。(本實(shí)驗(yàn)采取的濕重的測(cè)定方法為將細(xì)胞離心(3000g， 10min)后，倒去上清液后在濾紙上倒置2min后稱重。)取一定質(zhì)量的菌，將其接入4倍于濕菌菌體質(zhì)量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入茄尼醇，使茄尼醇與菌體的濕菌重配比為茄尼醇菌體濕菌重-50mg : lg;然后將反應(yīng)體系放入超臨界C02裝置中，調(diào)整溫度為35t:，壓力升至20MPa，保持該壓力和溫度下轉(zhuǎn)化24h后，以O(shè). 5MPa/min的速度卸壓。
以未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系和經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但
未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系作為對(duì)照。
三、 輔酶Q,。的提取及檢測(cè)提取及檢測(cè)方法同實(shí)施例1中三所述相同。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。樣品中輔酶Qu)的峰面積分別為505.95、470.77、 491.11。結(jié)果測(cè)得輔酶Qw產(chǎn)量為0.20mg/g(濕菌重)，比對(duì)照未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的方法產(chǎn)量增加了 78. 9%，比經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但未添加茄尼醇的方法提高了 62. 6%。實(shí)施例3、超臨界C02條件下微生物轉(zhuǎn)化制備輔酶Q,。
一、 菌的培養(yǎng)
菌的培養(yǎng)步驟同實(shí)施例1中步驟一所述相同。
將粟酒裂殖酵母菌(6: z^o歷力，購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生
物中心，產(chǎn)品目錄號(hào)2. 1794)接種到斜面活化培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中3(TC培養(yǎng)16h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，25°。搖床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，然后以1%的接種量接種到5個(gè)分別盛有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在150r/min的轉(zhuǎn)速下、25。C搖床培養(yǎng)16h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期。
斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%， pH5.5，瓊脂2%，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
液體活化培養(yǎng)基葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%， pH5.5，其余為水；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨8g/L，酵母膏8g/L， MgS040. 8g/L ， K2HP04.3H20 0. 8g/L ， KH2P04 0. 8g/L，其余為水，pH4. 8。 121。C滅菌15min。
二、 超臨界C02條件下利用粟酒裂殖酵母菌制備輔酶Qk)
將步驟一得到的發(fā)酵液離心(3000g， 10min)，收集菌體并用質(zhì)量濃度為0. 85%生理鹽水洗滌兩遍，離心后稱量濕重。(本實(shí)驗(yàn)采取的濕重的測(cè)定方法為將細(xì)胞離心(3000g，10min)后，倒去上清液后在濾紙上倒置2min后稱重。)取一定
質(zhì)量的菌，將其接入l倍于濕菌菌體質(zhì)量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入茄尼醇，使茄尼醇與菌體的濕菌重配比為茄尼醇菌體濕菌重30mg : lg;然后將反應(yīng)體系放
入超臨界C02裝置中，調(diào)整溫度為25。C，壓力升至5MPa，保持該壓力和溫度下轉(zhuǎn)化8h后，以0.2MPa/min的速度卸壓。
以未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系和經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但未添加茄尼醇的轉(zhuǎn)化體系作為對(duì)照。
三、 輔酶Qt。的提取及檢測(cè)提取及檢測(cè)方法同實(shí)施例1中三所述相同。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。樣品中輔酶Qw的峰面積分別為588.82、585.55、 549.37。結(jié)果測(cè)得輔酶Q^產(chǎn)量為0. 21mg/g(濕菌重)，比對(duì)照未經(jīng)超臨界C02作用且未添加茄尼醇的方法產(chǎn)量增加了 82. 9%，比經(jīng)超臨界C02外場(chǎng)作用但未添加茄尼醇的方法提高了 62. 6%c
權(quán)利要求
1、一種制備輔酶Q10的方法，是將粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培養(yǎng)基中，在溫度為25-35℃、壓力為5-20MPa的超臨界CO2的環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，得到輔酶Q10。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接入所述培養(yǎng)基的粟酒裂殖酵 母菌和所述茄尼醇的配比為茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的濕菌重=(10-50) nig: lg。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于接入所述培養(yǎng)基的粟酒裂 殖酵母菌與所述培養(yǎng)基的質(zhì)量配比為粟酒裂殖酵母菌的濕菌重培養(yǎng)基=1: (1-4)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述粟酒裂殖酵母菌和所 述茄尼醇的配比為茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的濕菌重=40 mg: lg。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2、 3或4所述的方法，其特征在于所述粟酒裂殖酵母菌與所述培養(yǎng)基的質(zhì)量配比為粟酒裂殖酵母菌的濕菌重培養(yǎng)基=1: 4。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述超臨界C02的溫度為31°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述超臨界C02的壓力 為暨a。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的時(shí)間為8-24h。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的時(shí)間為20h。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵結(jié)束后，以 0. 2-0. 5MPa/min的速度卸壓。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備輔酶Q₁₀的方法。本發(fā)明所提供的制備輔酶Q₁₀的方法，是將粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培養(yǎng)基中，在溫度為25-35℃、壓力為5-20MPa的超臨界CO₂的環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，得到輔酶Q₁₀。本發(fā)明方法充分利用超臨界CO₂的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)物抑制作用，且給酵母提供了高厭氧環(huán)境，改變了微生物的呼吸鏈供氧方式，從而促進(jìn)了輔酶Q₁₀的合成；而且本發(fā)明方法中添加了茄尼醇作為輔酶Q₁₀合成的底物，提高了輔酶Q₁₀合成的速度及產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法制備得到的輔酶Q₁₀產(chǎn)量比一般發(fā)酵方法提高60％-162％。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101591685SQ200810114118
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者萍 劉, 孫君社, 霄 肖 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)