專利名稱：：一種培育耐逆植物的方法及其專用dna片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育耐逆植物的方法及其專用DNA片段。技術(shù)背景我國(guó)是一個(gè)嚴(yán)重干旱、缺水的國(guó)家，也是世界上荒漠化和沙化面積大、分布廣、危害嚴(yán)重的國(guó)家之一。為了提高水資源的利用率、治理荒漠化土地，迫切需要培育節(jié)水耐旱經(jīng)濟(jì)作物。隨著對(duì)生命活動(dòng)機(jī)制研究的深入和基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段培育耐旱植物已經(jīng)成為當(dāng)今植物基因工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在旱、寒、鹽、熱等逆境條件下植物體內(nèi)面臨多重挑戰(zhàn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并積累了大量有害物質(zhì)；膜系統(tǒng)和蛋白質(zhì)變性；細(xì)胞與外界環(huán)境之間離子或水的動(dòng)態(tài)平衡無(wú)法維持；植物生長(zhǎng)所需的水分、養(yǎng)分及能量無(wú)法供應(yīng)等。往往是旱、熱或是寒、旱多重逆境共存，因此提高植物的耐逆性應(yīng)是提高植物的綜合耐逆能力。人們注意到當(dāng)線蟲Aphelenchusavenae緩慢進(jìn)入脫水狀態(tài)時(shí)，其干重的20%轉(zhuǎn)化為海藻糖(Anhydrobiosisinnematodes:carbohydrateandlipidmetabolismduringdehydration.J.Exp.Zool.1975，，193，335±342.)，在其它微生物和復(fù)蘇植物中也觀察到了耐逆與海藻糖積累的關(guān)聯(lián)性。從嗜熱菌thermus菌種中分離出能耐受6%NaCl的17個(gè)菌株，但如這些菌株的海藻糖合成基因發(fā)生缺失突變，則菌株無(wú)法在2%NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(DistributionofGenesforSynthesisofTrehaloseandMarmosylglycerateinThermusspp.andDirectCorrelationofTheseGeneswithHalotolerance.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2005，71(5):2460—2466)。海藻糖是一種由兩個(gè)葡萄糖分子以a，a-1，l糖苷鍵相連而成的非還原二糖，在生物界中廣泛存在。研究表明海藻糖能清除有害的氧自由基(Banaroudj，N.，Lee，D.H.，andGoldberg,A.L(2001)Trehaloseaccumulationduringcellularstressprotectscellsandcellularproteinsfromdamagebyoxygenradicals.J.Biol.Chem.，276,24261±24267)，保護(hù)蛋白和磷脂膜抗氧化脅迫((2001)TrehaloseisrequiredfortheacquisitionoftolerancetoavarietyofstressesinthefilamentousfungusAspergillusnidulans.Microbiology147:1851-1862)。另外，海藻糖具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，能嵌入膜磷脂的頭部極性分子之間，與多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合減少磷脂分子的橫向運(yùn)動(dòng)(OnthedecreaseinlateralmobilityofphospholipidsbysugarsBiophysJBioFAST，2006)，維持細(xì)胞膜在高滲透壓下的穩(wěn)定狀態(tài)，阻止細(xì)胞內(nèi)膜變性，抑制膜融合、降低相變溫度、保持膜的流動(dòng)性。同時(shí)，海藻糖的羥基和蛋白的極性基團(tuán)可通過氫鍵相互作用，在缺水或高溫情況下有助于維持蛋白的立體構(gòu)象。體外實(shí)驗(yàn)證明海藻糖能保護(hù)蛋白構(gòu)象并有利于其體外復(fù)性(ArchBiochemBiophys.2005Dec1;444(1):52-60.Trehaloseandglycerolstabilizeandrenatureyeastinorganicpyrophosphataseinactivatedbyveryhightemperatures)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明海藻糖不僅能防止蛋白的高溫變性，同時(shí)能阻止已部分變性蛋白的聚集，使其保持一定的折疊構(gòu)象，以利于分子伴侶對(duì)它重新修復(fù)激活(Multipleeffectsoftrehaloseonproteinfoldinginvitroandinvivo.MolCell.1998Apr;l(5):639-48.)。近幾年的研究顯示海藻糖和其前體6-磷酸-海藻糖還可直接與某些蛋白相互作用，改變其活性，啟動(dòng)植物的耐非生物脅迫和抗病機(jī)制。酵母內(nèi)高濃度的海藻糖能夠提高酵母熱激轉(zhuǎn)錄蛋白hsfl的轉(zhuǎn)錄活性從而激活酵母的一部分耐熱機(jī)制(MolCellBiol.2006Dec4;Thenaturalosmolytetrehaloseisapositiveregulatoroftheheat-inducedactivityofyeastheatshocktranscriptionfactor)。在添加了海藻糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥，有35個(gè)基因的表達(dá)增強(qiáng),包括與抗逆境、抗病信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因如過氧化物酶、脯氨酸脫氫酶、類衰老基因SG2和一些與磷酸化調(diào)控和鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因，同時(shí)還有與糖代謝、利用相關(guān)的基因如Atkinll等(TrehaloseMediatedGrowthInhibitionofArabidopsisSeedlingsIsDuetoTrehalose_6-PhosphateAccumulation,PlantPhysiology,2004，135:879-890)。高濃度的海藻糖促進(jìn)淀粉的合成并抑制淀粉的降解。淀粉合成的限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是四聚體異構(gòu)酶，由大小亞基構(gòu)成。小亞基起催化作用，大亞基APL3和APL4起調(diào)控作用。海藻糖能提高APL3和APL4基因的表達(dá)(DifferentialPatternofExpressionandSugarRegulationofArabidopsisthalianaADP-glucosePyrophosphorylase-encodingGenesTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY2005，280(9):8143-8149)，抑制淀粉降解基因SEX1和P-淀粉酶基因BMY8/BAM3的表達(dá)(PlantMolBiol.2007Jan;63(2):195-206.Epub2006S印23.ABI4mediatestheeffectsofexogenoustrehaloseonArabidopsisgrowthandstarchbreakdown.)。在葉綠體內(nèi)6-磷酸-海藻糖T6P的積累，會(huì)還原活化ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，從而加速生成淀粉的前體物質(zhì)ADP-葡萄糖(Trehalose6-phosphateregulatesstarchsynthesisviaposttranslationalredoxactivationofADP-glucosepyrophosphorylasePNAS，2005，102(31):11118-11123)。淀粉的積累降低植物可代謝糖的濃度，減緩植物的垂直生長(zhǎng)，節(jié)約碳源和其它的資源，有利于逆境條件下植物的生存。海藻糖或是6-磷酸-海藻糖還可能通過調(diào)節(jié)氮代謝提高生物的耐逆性。大腸桿菌的GlnD能感知細(xì)胞內(nèi)谷胺酰胺濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)與氮的吸收利用相關(guān)基因的表達(dá)。而GlnD的突變表達(dá)體(只表達(dá)蛋白N末端的37-40%)能部分抑制大腸桿菌otsBA或otsA::Tn10突變體的低耐逆性。該突變體在高鹽濃度而氮源充足的條件下，GlnD的下游信號(hào)傳導(dǎo)基因Gink的表達(dá)被調(diào)高，而GlnD野生型細(xì)菌在這一環(huán)境下Glnk表達(dá)量不變(JOURNALOFBACTERIOLOGY,June2006，p.4218-4226Vol.188,No.12TransposonMutationsinthe5，EndofglnD，theGeneforaNitrogenRegulatorySensor,ThatSuppresstheOsmosensitivePhenotypeCausedbyotsBALesionsinEscherichiacoli)。海藻糖主要有三種合成途徑，應(yīng)用廣泛的是(TPS-TPP)途徑。磷酸海藻糖合成酶(TPS)催化葡萄糖基團(tuán)從NDP-葡萄糖(UDP-/ATP-/CTP-/TTP-)轉(zhuǎn)移到6-磷酸-葡萄糖上，產(chǎn)生6-磷酸-海藻糖和NDP(UDP/ATP/CTP/TTP)。磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)催化6-磷酸-海藻糖的脫磷酸反應(yīng)，最終生成海藻糖。TPP很可能是受海藻糖反饋抑制的酶，隨著海藻糖濃度的升高，TPP酶活性降低，生物體內(nèi)海藻糖前體T6P的濃度就會(huì)升高。除微生物和一些復(fù)蘇植物外，自然界一般植物體內(nèi)海藻糖的濃度低于O.15毫克/克干重。Karim等人克隆了酵母的TPS基因并采用葉綠體定位策略，成功地獲得了耐旱的轉(zhuǎn)基因煙草(Improveddroughttolerancewithoutundesiredsideeffectsintransgenicplantsproducingtrehalose.PlantMol.Biol.,67:371-386)，但從酵母、昆蟲、鏈霉菌等細(xì)胞中分離的磷酸海藻糖合成酶只能特異地利用UDP-葡萄糖或GDP-葡萄糖中的一種作為底物合成6-磷酸-海藻糖，而葉綠體中大量存在著ADP-葡萄糖。非致病性菌恥垢分枝桿菌的TPS能利用所有天然存在的NDP-葡萄糖(ADP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、TDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖)作為葡萄糖供體，其中UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖和GDP-葡萄糖為最適底物(Trehalose-phosphatesynthaseofMycobacteriumtuberculosis.Cloning,expressionandpropertiesofrecombinantenzyme.Eur.J.Biochem.，2002，269(24):6091-6100)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育耐逆植物的方法及其專用DNA片段。本發(fā)明提供了一種融合蛋白，包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和磷酸海藻糖合成酶，所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于所述融合蛋白的氨基端，所述磷酸海藻糖合成酶位于所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。所述融合蛋白還可包括磷酸海藻糖磷酸酶，所述磷酸海藻糖磷酸酶位于所述磷酸海藻糖合成酶的羧基端。所述葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可來(lái)自雙子葉植物或單子葉植物；如來(lái)自擬南芥，其序列為序列表中的序列6，編碼基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄?。所述磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酶來(lái)自恥街分支桿菌。所述融合蛋白具體可為下述a)、b)、c)或d)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)；c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；d)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。所述融合蛋白中，在序列4自氨基末端第582至586位氨基酸殘基為連接肽(GSGSG)，編碼序列為序列表的序列3自5，端第1772至1786位核苷酸(GGATCAGGTTCTGGA)。上述b)或d)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'端第29至1771位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變得到。上述d)中的融合蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3自5'端第29至2536位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變得到。所述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼基因具體可為如下l)至6)的DNA分子之一-1)其編碼序列是序列表中序列1自5'末端第29-1771位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；4)其編碼序列是序列表中序列3自5'末端第29-2536位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在5XSSC，5XDenhardt，S溶液，0.05mg/mL魚精DNA，50%去離子甲酰胺溶液中，在65。C下雜交，然后在室溫用2XSSC，0.1%SDS，在42"C用0.25XSSC,0.1%SDS各洗膜15分鐘兩次。含有所述基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)盒中除上述編碼基因外還可以含有序列表中序列1自5'末端第1775-2577位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子或含有序列表中序列3自5'末端第2537-2921位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述融合蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述融合蛋白編碼基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的融合的蛋白編碼基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述表達(dá)載體具體可為如圖1所示的表達(dá)載體或如圖2所示的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種培育耐逆植物的方法，是將所述融合蛋白的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，得到耐逆性增強(qiáng)的植物?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法將所述融合蛋白的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，如通過如圖1所示的表達(dá)載體或如圖2所示的表達(dá)載體將所述融合蛋白的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，得到耐逆性增強(qiáng)的植物。所述耐逆性具體可為耐鹽和/或耐旱。本發(fā)明提供了一種融合蛋白，包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和磷酸海藻糖合成酶，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽位于融合蛋白的氨基端，磷酸海藻糖合成酶位于葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的羧基端。融合蛋白還可包括磷酸海藻糖磷酸酶，磷酸海藻糖磷酸酶位于磷酸海藻糖合成酶的羧基端。將本發(fā)明的融合蛋白的編碼基因?qū)胫参镏?，可以顯著提高植物的耐逆性。本發(fā)明的融合蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤湍嬷参锲贩N，特別是培育耐非生物脅迫如耐干旱和/或耐鹽植物品種，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為質(zhì)粒pCAMBIA2300::fuTPS的結(jié)構(gòu)圖圖2為質(zhì)粒pCAMBIA2300::dTPSP的結(jié)構(gòu)圖圖3為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300::dTPSP植株的干旱和鹽處理后的照片圖4為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300::dTPSP植株的電泳鑒定具體實(shí)施例方式細(xì)菌基因組DNA的提取采用SDS裂解法，植物基因組DNA的提取采用CTAB法，具體參見SambrookandRussell"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2001);Cloning:APracticalApproach,〃VolumesIandII"(D.N.Glover，ed.，1985)。細(xì)胞總RNA的提取采用TRIZ0LRNA提取液(鼎國(guó)生物技術(shù)公司)，并按供應(yīng)商提供的方案進(jìn)行總RNA的提取。將得到的總RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除殘存的DNA，以分光光度計(jì)(Eppendorf公司，德國(guó))檢測(cè)樣品中總RNA的濃度。取5Pg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA片段為模板進(jìn)行如下所示的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。除非有特殊說明，PCR反應(yīng)體系為:0.lPg模板DNA、1.5mMMgCl2、20raMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.2mMdNTP混合物、0.2MM正向引物和0.2MM反向引物，以及l(fā)U的pfu高保真DNA聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國(guó))中進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)94。C預(yù)變性4分鐘，94'C變性30秒，按各特定溫度復(fù)性，復(fù)性時(shí)間30秒，72"C延伸，延伸時(shí)間各反應(yīng)特定，30個(gè)循環(huán)，最后72。C、10分鐘。本發(fā)明中所用的引物均為上海生工公司合成。本發(fā)明中所用的引物如下Pl:5，-TCTCCGGAGAGTGGCCACGAA-3，P2:5，-GAAGCTCCCGGAGTCGGACTCG-3，；P3:5，-TCAGTCACACAAAGAGTAAAGAAGA-3';P4:5，-GGAATCGGTAAGGTCAGGAAGGT-3，；P5:5，-CCGACTCCGGGAGCTTCTAGTAATTTCCCTTTGCTT-3，；P6:5，-TTCTGTGGTATTTGAGCATTTCG-3，；P7:5，-CGTGGCCACTCTCCGGAGAGGAATCGGTAAGGTCAG-3';P8:5，-CCTTCCTGACCTTACCGATTCCTCTCCGGAGAGTGGCCACGAAAC-3，Pll:5，-CGCCGTGCGCCGCGGCGCATAGTCACGCCGGCTCATATTAGG--3，；P12:5，-TAAGGGCAGCCCATACAAATG-3，；P13:5，-GCCGGTGAATTCGCTGAGCA-3，；P14:5，-ACTCATTCCAGAACCTGATCCGAAGCTCCCGGAGTCGGACTC--3，；P15:5，-TTCGGATCAGGTTCTGGAATGAGTCTTTCGGGGGATCTGCAG--3，；P16:5'-TGCTCGAAGAGAAGCGCATCA-3'。以下實(shí)施例中所用的擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型野生擬南芥。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、培育耐逆植物一、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆恥垢分枝桿菌基因組約7Mb，環(huán)狀，全基因組序列測(cè)定已完成(GenbankAccessionNC—008596)。其中磷酸海藻糖合成酶基因長(zhǎng)1512bp，編碼503個(gè)氨基酸(GenbankAccessionABK71484)。參照生物學(xué)模式菌株恥柜分枝桿菌(#7co^"e/:/,s/ze^7^i's)的序列人工合成1506bp的片段的磷酸海藻糖合成酶基因(三博遠(yuǎn)志)，測(cè)序表明該片段為不含起始密碼子和終止密碼子的磷酸海藻糖合成酶基因序列，與基因庫(kù)中序列吻合，將該磷酸海藻糖合成酶基因片段命名為TPS(其序列是自序列1的5'末端第266-1771位核苷酸)。二、擬南芥RuBisCO基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA片段的獲得1、N端片段的獲得根據(jù)擬南芥RuBisCO基因(GenbankAccession麗—202369)序列分析，合成引物P3和P4，以擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過55。C復(fù)性30秒，72"延伸30秒PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到265bp的DNA片段，測(cè)序結(jié)果表明該片段為擬南芥RuBisC0基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，將該片段命名為AtTP(其序列是自序列1的5'末端第1-265位核苷酸)。2、下游序列的獲得依據(jù)擬南芥基因組序列信息合成引物P5和P6，以擬南芥基因組DNA為模板，通過55。C復(fù)性30秒，72。C延伸l分鐘PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到823bp的DNA片段，測(cè)序結(jié)果表明該片段含有擬南芥RuBisC0基因的下游序列，將該片段命名為AtTrbcS(其序列是自序列1的5'末端第1755-2577位核苷酸)。三、融合基因的獲得合成PCR反應(yīng)融合引物P7和P8。以P3、P7為引物，AtTP為模板，通過55°C復(fù)性30秒，72"C延伸30秒PCR擴(kuò)增得到約284bpDNA片段；同時(shí)以P8、P2為引物，TPS為模板，通過55。C復(fù)性30秒，72°C、2分鐘PCR擴(kuò)增得到1528bpDNA片段。將兩片段回收，分別取O.lpg混合，作為模板，在不加入引物的條件下，65°。復(fù)性30秒，72X:延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P3和P2，56。C復(fù)性30秒，72。C延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1771bp的DNA片段。取0.1ug該片段和O.lygAtTrbcS，混合作為模板，在不加引物的條件下，65"C復(fù)性30秒，72'C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P3和P6，56'C復(fù)性，72"C延伸2分鐘30秒，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。將得到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，DNA片段如序列表中的序列l(wèi)所示，將該DNA片段命名為fuTPS，序列表中序列1的第29至1771位核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸。fuTPS包含了完整的TPS基因片段(序列l(wèi)第266-1771位核苷酸)，同時(shí)在5'端融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片段(序列1的29-265位核苷酸)，以及3，端融合了RuBisCO基因終止區(qū)的DNA片段(序列1的1775-2577位核苷酸)。將fuTPS連接到質(zhì)粒pBluescriptIIKS(-)(GenbankAccessionNumberX52329)的5i^I-^i/7cII位點(diǎn)處，將得到的重組質(zhì)粒命名為pBS::fuTPS。四、融合基因fuTPS植物表達(dá)載體的構(gòu)建^sfXI和酶切質(zhì)粒pCAMBIA2300(GenbankAccessionNumberAF234315)，回收787bp的35S啟動(dòng)子片段，將787bp的35S啟動(dòng)子片段插入pUC18(GenbankAccessionNumberL09136)的5^1和酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pUC18::35S。隨后和酶切質(zhì)粒pBS::fuTPS，得到約2600bp的含有fuTPS的片段，將該片段插入到X&I和酶切的pUC18::35S上，得到重組質(zhì)粒pUC18::35S-fuTPS。ffi/dl11-A^M酶切pUC18::35S-fuTPS，回收約3.4kb的35S-fuTPS片段，插入到經(jīng)過同樣酶切的pCAMBIA2300上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2300::fuTPS(圖1)。fuTPS受到35S啟動(dòng)子控制，終止子為擬南芥RuBisCO基因終止區(qū)。將質(zhì)粒pCAMBIA2300::fuTPS轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，得到菌株LBA4404/TPS，用于植物組織的侵染。五、培育耐逆植物1)轉(zhuǎn)基因植株的獲得擬南芥按常規(guī)方法培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間16/8小時(shí)，光照強(qiáng)度不低于5000Lux，溫度22攝氏度，濕度70%。培養(yǎng)介質(zhì)為按l:l混勻的蛭石和草炭土，每周澆一次"花無(wú)缺"營(yíng)養(yǎng)液(每2升水加1克，上海永通化工有限公司)，幼苗生長(zhǎng)約25天后，第一個(gè)花序長(zhǎng)到高8厘米左右時(shí)從基部掐除，再過一周時(shí)間二次抽薹，花蕾剛要露白時(shí)進(jìn)行侵染。農(nóng)桿菌使用濃度0D6001.2-1.4，菌液4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，以等體積的5%蔗糖溶液懸浮，測(cè)其0D600值，換算后用5y。的蔗糖稀釋至浸染時(shí)的使用濃度OD6000.8，加入萬(wàn)分之三體積的SilwetL-77溶液，混勻后進(jìn)行浸染，浸染方法采取"蘸花法"，即用槍頭吸取農(nóng)桿菌液滴蘸花絮。遮光24小時(shí)后重新正常生長(zhǎng)。5-6天后進(jìn)行第二次侵染，共浸染3次。侵染結(jié)束后約一個(gè)月左右收種。所得T1代種子在抗性培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因苗，方法為70%酒精表面消毒5分鐘，次氯酸鈉溶液(5。/。次氯酸鈉+0.5。/。SDS)，消毒15分鐘，無(wú)菌水洗滌5遍，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基(加卡那霉素30mg/l+羧卞125mg/l)。4。C冰箱放置3天后置于正常培養(yǎng)間光照培養(yǎng)，十天后將抗性苗移至蛭石和草炭土的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，常規(guī)培養(yǎng)，兩個(gè)半月后收種為T2代種子。將用上述方法篩選得到的T2代轉(zhuǎn)基因植株的種子培育成小苗，進(jìn)行耐旱試驗(yàn)。共得到了30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPS基因擬南芥。2)耐旱試驗(yàn)將步驟l)得到的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPS基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐旱實(shí)驗(yàn)。具體方法如下將經(jīng)過卡那篩選的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPS基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥，每個(gè)株系各7株，同時(shí)對(duì)稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系設(shè)3個(gè)重復(fù)。常規(guī)管理，澆水3次后停止?jié)菜?，三周后?fù)水，一周后觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥全部枯死，而轉(zhuǎn)TPS基因擬南芥的30個(gè)株系中，有2個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因植株存活，且大部分葉片保持綠色，植株生長(zhǎng)良好。3)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定將在步驟2)的試驗(yàn)中存活的2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定。取這2個(gè)株系的T2代植株的葉片和非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片，分別提取基因組DNA。提取基因組DNA采用用CTAB法(SteinerJJ，PoklerabaCJ，F(xiàn)jellstromRG,ElliottLF.，Arapidone—tubegenomicDNAextractionprocessforPCRandRAPDanalyses.NucleicAcidsRes.1995Jul11;23(13):2569-70.)。分別以500ng提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25W，含有500ng基因組DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HC1(pH8.4)、50mMKCl、0.2mMdNTP混合物、0.2MM引物P3和0.2MM引物P2、1U的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國(guó))中進(jìn)行PCR循環(huán)先94"C、5分鐘；再94。C、30秒，52°C、30秒，72°C、1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C、IO分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。上述2個(gè)株系轉(zhuǎn)TPS基因擬南芥在預(yù)期位置均有有PCR擴(kuò)增條帶。實(shí)施例2、培育耐逆植物一、磷酸海藻糖合成酶基因和磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆1、磷酸海藻糖合成酶基因的克隆同實(shí)施例1的步驟一。2、磷酸海藻糖磷酸酶基因的克隆恥垢分枝桿菌(#yco^"en'M7^e^M&)的磷酸海藻糖磷酸酶基因?yàn)殚L(zhǎng)750bp，編碼249個(gè)氨基酸(NucleotideAccessionCP000480,ProteinAccessionABK73322)的DNA片段。參照生物學(xué)模式菌株恥柜分枝桿菌(i(KcoZ^c^ri鵬s歷e^s"'s)的序列人工合成750bp的片段的磷酸海藻糖磷酸酶基因(三博遠(yuǎn)志)，測(cè)序表明，該片段為磷酸海藻糖磷酸酶基因片段，與基因庫(kù)中序列吻合，將該擴(kuò)增到的磷酸海藻糖磷酸酶基因片段命名為TPP(其序列是自序列3的5'末端第1787-2536位核苷酸)。二、擬南芥RuBisC0基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA片段和煙草RuBisC0基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA片段的獲得1、擬南芥RuBisCO基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA片段的獲得同實(shí)施例l的步驟二的l。2、煙草RuBisCO基因轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA片段的獲得合成引物P11和P12，以煙草基因組DNA為模板，通過55。C復(fù)性30秒，72°C、30秒PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到407bp的DNA片段.測(cè)序結(jié)果表明，該片段含有煙草RuBisCO基因的3，終止區(qū)和22bp的TPP3，端序列，將該片段命名為NtTrbcS(其序列是自序列3的5'末端第2515至2921位核苷酸)。三、融合基因的獲得合成PCR反應(yīng)融合引物P7和P8。以P3、P7為引物，AtTP為模板，通過55'C復(fù)性30秒，72。C、30秒PCR擴(kuò)增得到284bpDNA片段;同時(shí)以P8、P2為引物，TPS為模板，通過55。C復(fù)性30秒，72°C、2分鐘PCR擴(kuò)增得到1528bpDNA片段。將兩片段回收，分別取O.liig混合，作為模板，在不加入引物的條件下，65卩復(fù)性30秒，72。C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P3和P13，56。C復(fù)性30秒，72°(3延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1510bp的DNA片段，將該片段命名為dTPSPl，連接到質(zhì)粒pBluescriptlIKS(-)的5kal位點(diǎn)，并測(cè)序。序列分析表明dTPSPl包含了TPS基因片段，并融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片段，將該質(zhì)粒命名為pBS::dTPSPl。O.OlugTPS為模板，P1和P14為引物，65"C復(fù)性，72。C延伸2分鐘，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)，得到1527bp的DNA片段。同時(shí)分別取0.1ixgTPP和NtTrbcS，混合作為模板，在不加引物的條件下，65X:復(fù)性30秒，72"C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P15和P12,56'C復(fù)性，72t:延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1153bp的DNA片段。將上述得到的1527bp和1153bpPCR片段分別回收純化，取0.1ug混合，在不加引物的條件下，65"C復(fù)性，72"C延伸2分鐘，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，然后加入引物P16和P12，6(TC復(fù)性30秒，72。C延伸2分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到1740bp的DNA片段，該片段被命名位dTPSP2，被連接到質(zhì)粒pBluescriptIIKS(-)的ffi/KII位點(diǎn)處，并測(cè)序。序列分析表明dTPSP2包含了TPS基因片段靠3'端的一部分，同時(shí)融合了全長(zhǎng)的TPP基因片段以及煙草RuBisCO基因終止區(qū)的DNA片段，該質(zhì)粒被命名為pBS::dTPSP2。I-《/wI雙酶切pBS::TPSP2，回收1.7kb的片段，插入到經(jīng)過同樣酶切的pBS::TPSP1質(zhì)粒上，重組質(zhì)粒被命名為pBS::dTPSP。dTPSP包含了完整的TPS基因片段(序列3第266-1771位核苷酸)，TPP基因片段(序列3第1787-2536位核苷酸)，TPS和TPP基因間的連接肽DNA序列(序列3第1772-1786位核苷酸)同時(shí)在5'端融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA片段(序列3第1-265位核苷酸)，以及3，端融合了RuBisCO基因終止區(qū)的DNA片段(序列3第2537-2921位核苷酸)。四、融合基因dTPSP植物表達(dá)載體的構(gòu)建5WXI和酶切質(zhì)粒pCAMBIA2300(GenbankAccessionNumberAF234315)，回收787bp的35S啟動(dòng)子片段，將787bp的35S啟動(dòng)子片段插入pUC18(GenbankAccessionNumberL09136)的和酶切位點(diǎn)間，得到重組質(zhì)粒pUC18::35S。隨后&el和勤"I酶切質(zhì)粒pBS::dTPSP，得到約3000bp的含有dTPSP的片段，將該片段插入到X&I和《/wl酶切的pUC18::35S上，得到重組質(zhì)粒pUC18::35S-dTPSP。HindlII和Kpnl酶切pUC18::35S-dTPSP，回收約3.8kb的35S-TPSP片段，插入到經(jīng)過同樣酶切的pCAMBIA2300上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2300::dTPSP(圖2)。包含完整的TPS和TPP融合基因并在其5'端融合了擬南芥RuBisCO基因N端編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的dTPSPDNA片段受到35S啟動(dòng)子控制，終止子為煙草RuBisCO基因終止區(qū)。該質(zhì)粒pCAMBIA2300::dTPSP轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中，得到菌株LBA4404/TPSP，用于植物組織的侵染。五、培育耐逆植物1)轉(zhuǎn)基因植株的獲得擬南芥按常規(guī)方法培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間16/8小時(shí)，光照強(qiáng)度不低于5000Lux，溫度22攝氏度，濕度70%。培養(yǎng)介質(zhì)為按l:l混勻的蛭石和草炭土，每周澆一次"花無(wú)缺"營(yíng)養(yǎng)液(每2升水加1克，上海永通化工有限公司)，幼苗生長(zhǎng)約25天后，第一個(gè)花序長(zhǎng)到高8厘米左右時(shí)從基部掐除，再過一周時(shí)間二次抽薹，花蕾剛要露白時(shí)進(jìn)行侵染。農(nóng)桿菌使用濃度OD6001.2-1.4，菌液4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，以等體積的5%蔗糖溶液懸浮，測(cè)其OD600值，換算后用5%的蔗糖稀釋至浸染時(shí)的使用濃度006000.8，加入萬(wàn)分之三體積的SilwetL-77溶液，混勻后進(jìn)行浸染，浸染方法釆取"蘸花法"，即用槍頭吸取農(nóng)桿菌液滴蘸花絮。遮光24小時(shí)后重新正常生長(zhǎng)。5-6天后進(jìn)行第二次侵染，共浸染3次。侵染結(jié)束后約一個(gè)月左右收種。所得T1代種子在抗性培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因苗，方法為70%酒精表面消毒5分鐘，次氯酸鈉溶液(5y。次氯酸鈉+0.5。/oSDS)，消毒15分鐘，無(wú)菌水洗滌5遍，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基(加卡那霉素30mg/l+羧卞125mg/1)。4匸冰箱放置3天后置于正常培養(yǎng)間光照培養(yǎng)，十天后將抗性苗移至蛭石和草炭土的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，常規(guī)培養(yǎng)，兩個(gè)半月后收種為T2代種子。將用上述方法篩選得到的T2代轉(zhuǎn)基因植株的種子培育成小苗，進(jìn)行耐旱和耐鹽試驗(yàn)。共得到了30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥。2)耐旱試驗(yàn)將步驟1)得到的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐旱實(shí)驗(yàn)。具體方法如下將經(jīng)過卡那篩選的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥，每個(gè)株系各7株，同時(shí)對(duì)稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系設(shè)3個(gè)重復(fù)。常規(guī)管理，澆水3次后停止?jié)菜?，三周后?fù)水，一周后觀察并拍照。轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的耐旱實(shí)驗(yàn)照片見圖3A。圖3A中，下為轉(zhuǎn)基因植株，上為對(duì)照植株，以白牌隔開。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非轉(zhuǎn)基因擬南芥全部枯死，而轉(zhuǎn)TPSP擬南芥有的株系植株恢復(fù)生長(zhǎng)良好。3)耐鹽試驗(yàn)將步驟1)得到的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐旱實(shí)驗(yàn)。具體方法如下將經(jīng)過篩選的30個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥，每個(gè)株系各6株，同時(shí)對(duì)稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系設(shè)3個(gè)重復(fù)。第一周澆"花無(wú)缺"營(yíng)養(yǎng)液加上100mMNacl鹽水，第二周和第三周澆"花無(wú)缺"營(yíng)養(yǎng)液加上200mMNacl鹽水。第四周觀察并拍照。轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)空載體植株的照片見圖3B。圖3B中，下為轉(zhuǎn)基因植株，上為對(duì)照植株，以白牌隔開。非轉(zhuǎn)基因擬南芥漸漸死亡，而轉(zhuǎn)TPSP擬南芥有的株系雖植株生長(zhǎng)受影響，但植株仍保持綠色。4)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定在步驟2)和步驟3)的試驗(yàn)中均存活的轉(zhuǎn)基因株系為4個(gè)。取這4個(gè)株系T2代植株的葉片和非轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片，分別提取基因組DNA。提取基因組DNA采用用CTAB法(SteinerJJ，PoklembaCJ,FjellstromRG,ElliottU7.，Arapidone-tubegenomicDNAextractionprocessforPCRandRAPDanalyses.NucleicAcidsRes.1995Jul11;23(13):2569-70.)。分別以500ng提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25W，含有500ng基因組DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HC1(pH8.4)、50raMKCl、0.2mMdNTP混合物、0.2MM引物P3和0.2MM引物P2、1U的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國(guó))中進(jìn)行PCR循環(huán)先94。C、5分鐘；再94'C、30秒，52°C、30秒，72°C、1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72"C、10分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。結(jié)果見圖4，圖4中，泳道1-6泳道分別為1:1Kbmarker;2:非轉(zhuǎn)基因植株；3-6:轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示，上述4個(gè)株系的轉(zhuǎn)TPSP基因擬南芥在預(yù)期位置均有有PCR擴(kuò)增條帶。序列表〈110〉北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司<120>—種培育耐逆植物的方法及其專用DNA片段〈130〉CGG應(yīng)Y81387<160>6<210〉1〈211〉2577〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1tcagtcacacggcttcctctatgctctcttccgctaictat60ggUgcctctccggctcaggccactatggtcgctxctttcaacggactteiagtcctccgc120tgccttcccagccacccgca3ggctaacaacgacattacttccatcacaagcaacggcgg180aagagtt肌ctgcatgcaggtgtggcctccgattgg犯agaagaagtttgagactctctc240ttaccttcctgaccttaccgattcctctccggagagtggccacgeiaBccatctccgggac300ctccgacttcgtggtggtcgccaaccggctaccggtcgatctggagcggctgcccgacgg360caccacgcgatggaagcggagccccggtggcctggtgaccgcactggagccgctgctgcg420caagcggcgcggctcctggatcggctgggccggcgtcgccgacagtgacgeiggaaccgat480cgtccaggacggtctgcagctgcaccccgtgcggttgtcggccgacgacgtcgcgaagta540ctacgaaggtttctccaacgccaccctgtggccgctctaccacgacctgatcgtcaaacc600Cg3gtaCC3Ccgcgagtggtggg3CCggt3tgtcg鄉(xiāng)tcaaccgccgattcgccg鄉(xiāng)c660ggicggcgcgcgcggcagccgagggtgccacggtctggatccaggactaccagctgcagct720ggtgcccaag3tgctgcgcatgctgcgccccgatgtgaccatcggcttcttcctgcacat780cccgttcccgccggtcgagctgttcatgcagatgccgtggcgcaccgagatcgtggaagg840cctgctcggcgccgacctggtcgggttccacctgcccggcggcgcgc柳acttcctggt900<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><211〉581〈212〉PRT〈213〉人工序列<400>2MetAla1GinAlaPheProAsnGly50LysLys65ProGluSerSerThrAla35GlyMet20ThrMet5ValLeuSerSerAlaThrMetValAlaSer10GlyAlaProPheArgLysAlaArgValAsnPheGluThrSerGlyValAlaAsnThrArgLeuLeu130AspSer145ValArgTrp115ArgArg100LysHis85LeuLeu70GluCys55SerAsn40MetAsn25AsnLeuLysSerAsplieThrGinValTrpTyrLeuProThrlieSerProValAspArgLysArgArgAspGluGluSerProLeuSerAsnAlaThrLeu180Ala165TrpPro150AspGly135lieGly120SerLeu105GlyGly90GluAsp75ThrPro60LeuSer45ProSer30lieProAla15AlaAlaThrSerlieGlyLysThrAspSerAspPheArgLeuProLeuValThrTrplieGlyValGinAspAspValAlaProLeuTyrHis185Lys170AspGly155TyrTrp140LeuAla125AlaAsp110LeuSerSer80ValVal95GlyThrGluProGlyValAlaGinLeuTyrGluGlyLeulieValLys190HisPro160PheSer175ProGluTyrHisArgGluTrpTrpAspArgTyr200AlaAlaArg195AlaThrAlaGlu210GinAspTyrGin225ProAspValThrGluLeuPheMet260LeuGlyAlaAsp275ValAlaArgAla215LeuGinLeu230lieGlyPhe245GinMetProValGluValAsnArg205GluGlyAlaThrVal220ValProLysMetLeuArgMet235lieProPheProPheLeuHis250ThrPheLeu290SerVal305ThrValAspGlyArgAlaLeuAsp370LeuLeu385LeuAlaGlyLysLysGlu355TyrLeuValValAla340LeuThrTrpArg265LeuValGlyPheHis280LeuValSerArgArg295ArgSerArg310GlyAlaPhe325ArgAsnArgPheGlyProlieAlalie345GlyAsnProArgLys360AspValLeuGlyGluSer330ArglieGluAsplieGlu420LysGlylie375GluGluLysArglie390ThrProSerArgGlu405ArgGinValArgLysArgAspArgValGlu410GlyHislie425ArgPheTrplieLeuArg240ProVal255GlyLeuGlulieValGlu270ProGlyGlyAlaGinAsn285AlaAsnThrSerArgAla300ValGinValGly315lieAspSerAlaPheArg320GluLeu335GinlieGinArgAlaArg350MetLeuGlyValAspArg365LeuArgAlaLeuSerGlu380AspThrValLeu395SerTyrlieAlaAsnGlyGluTyr430ValGin400MetArg415GlyGluValGlyHisProlieValHisTyrLeuHisArgProlieProArgAsp445LeuValThrProGluLeu465SerLeu450ArgHis435lieAlaPhePheTyr440AlaAspGlyAspLeuGlyAlaGluLeuArg500LysValLysAsp515ArgLysAsp545ThrArg530ArgTrpGlyA印AspSerGlyMetAlaSerSer580ArgArgGly565PheVal455LeuValAlaAlaAspValMetAsn470AlaLeuValLeuAspLysMet460TyrValAlaCysGly485GinAlaTyrLeulieGluAlaAla520ArgGlu475GluPheThrGlySer490AsnProHisAspVal505ValAsnGinAsnAlaLeu535PheLeuSer550ValThrGlyGluArgGinValAspAlaSer570Pro525AlaLeu510GluHisLeu540AlaAlaThrLeu555ThrProAlaProAla495GluGluAspGlyGlu575Arg■AlaGlyGlyValGlu560Ser<210〉3<211>2921〈212〉DNA<213>人工序列〈400>3tcagtcacacaaagagtaaagaagaacaatggcttcctctatgctctcttccgctactat60ggttgcctctccggctcaggccactatggtcgctcctttcaacggacttaagtcctccgc120tgccttcccagccacccgcaaggctaacaacgacattacttccatcacaagcaacggcgg180tgC3tgC3ggtgtggcctccgattggaaagaagaagtttgagactctctc240ttaccttcctgaccttaccgattcctctccggagagtggccacgeiaaccatctccgggac300ctccgacttcgtggtggtcgccaaccggctaccggtcgatctggagcggctgcccgacgg360caccacgcgatggaagcggagccccggtggcctggtgaccgcactggagccgctgctgcg420caagcggcgcggctcctggatcggctgggccggcgtcgccgacagtgeicgaggaaccgat■cgtccaggacggtctgcagctgcaccccgtgcggttgtcggccgacgacgtcgcg犯gta540ctacgaaggtttctccaacgccaccctgtggccgctctaccacgacctgatcgtcaaacc600cgagtacc3ccgcg叫tggtgggaccggtatgtcgsggtcaaccgccgattcgccgaggc660gacggcgcgcgcggcagccgsgggtgccacggtctggatccaggactaccagctgcsgct720ggtgccc犯gatgctgcgcatgctgcgcccCg3tgtg3CCatcggcttcttcctgcacat780cccgttcccgccggtcgagctgttcatgcagatgccgtggcgcaccgagatcgtgg犯gg840cctgctcggcgccgacctggtcgggttccacctgcccggcggcgcgcagaacttcctggt■gctctcgcgccggctggtcggcgcc犯cacgtcgcgcgccagcgtcggcgtacggtcgcg960cttcggtgaggtgcaggtcggcttccgcaccgtcaaggtcggcgccttccccatctcgat1020cgactcggccgaactcgacggc肌ggcacgcaaccgcgccatacggcagcgggcccgcca1080gatccgcgccgagctgggcaacccccgc肌gatcatgctgggcgtcgaccgcctcgacta1140C3CC3SgggCatcgacgtgcggctgcgggcactgtccgaactgctcgaagagaagcgcat1200c犯gcgtgacgacaccgtgctggtgcagctcgcgacgcccgigccgggaacgcgtcg卿g1260ctacatcgcgatgcgtgsggacatcgaacgccaggtcggccacatcaacggcgagtacgg1320cgaggtcggccacccgatcgtgcactacctgcaccggccgatcccccgcgacgagctcst1380cgcgttcttcgtcgcggccgacgtcatgctcgtgacgccgttgcgcgacggcatg犯cct1440ggtggccaaggagtacgtggcgtgccgceigcgatctcggcggtgcgctggtgctca_gcg31500attcaccggcgcggcagccgaactgcgccaggcctacctggtcaacccgcacgacctcga1560gggtgtcaaggacaagatcgaggccgcggtccagaagagggc肌gcgccg1620tatgcgtgcgctgcgccgccaggtgctcgcgcacgacgtcgaccggtgggcacgctcatt1680cctcgeicgcgctggccgccaccggcgagacgggcgactccggcgtgacgggcgagtccac1740tcctgcgcccgagtccgactccgggagcttcggatcaggttctggaatgagtctttcggg1800gga_tctgcagcgcgcgctcaccgcggtcgctgccacaccgcacctgctggtcacatccga1860tttcgacggcacactcgcgccgatcgtcaacaaccccgccgacgcgcggccgctcgccga1920tgccgccgaggccctcgccgcactcgcggaactgccgcagaccgcctcggcgctgatctc1980cggacgtgccctcgaggtgctgcgcgcattgtccgggatgccggacacggtgcacctggt2040ggg鄉(xiāng)CC3Cggcgcgg敏tcacctccgggttcggccacgacatcgacaccgctctgct2100gcaacggatcaccgatcggctccacacgatcgcatcgggc鄉(xiāng)cccggtgtcaccgtgga2160gscc犯accggc犯gcgttgcgctgcacgtgcgtaacgcctcgcccgaacacggcgcggc2220cgcgttgaccgaggcacgcacggccgccgcggagtgggacgctcagctcaccgagggcaa2280ggcsgtgctcg組tcgcggttatccagaccg3c犯gggt:gaggcggtcgacatcctgcg2340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基因?qū)ε嘤湍嬷参锲贩N，特別是培育耐非生物脅迫如耐干旱和/或耐鹽植物品種，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。文檔編號(hào)C12N15/62GK101289514SQ200810114960公開日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者茜吳,徐健勇,李欽清,蕾陳申請(qǐng)人:北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司