專利名稱：用于篩選和鑒定低豐度小rna表達(dá)譜的新型小rna芯片的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種新型的小RNA的寡核苷酸探針和使用所述寡核苷酸探針制備的小RNA芯片，并且涉及一種能夠富集低豐度、低分子量(＜40nt)的小RNA的方法。本發(fā)明可以顯著提高基因芯片檢測(cè)細(xì)胞/組織中低豐度的小RNA的靈敏度和特異性。本發(fā)明的小RNA芯片可用于制備鑒定和比較細(xì)胞分化前后小RNA的變化，通過檢測(cè)小RNA表達(dá)譜而鑒定細(xì)胞/組織的特異性，以及診斷和評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的來源和分化程度的試劑盒。

背景技術(shù)：
小RNA，核酸的長(zhǎng)度在21-35個(gè)核酸堿基之間的非蛋白質(zhì)編碼核酸序列，廣泛存在于各種生物體中。目前小RNA至少可以分為六類微核酸(miRNA)，小的非編碼核酸(tncRNA)，短的干擾核酸(siRNA)，重復(fù)結(jié)合的小干擾核酸(rasiRNA)，小的調(diào)節(jié)核酸(smRNA)以及與Piwi相互作用的核酸(piRNA)[1，2]。在上述六類核酸中miRNA被研究的最為廣泛[3]。這些miRNA是從蛋白編碼基因的內(nèi)含子或外顯子以及非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化而來。目前已有幾百個(gè)miRNA被克隆并被測(cè)序[4，5]。從小RNA發(fā)現(xiàn)的歷史來看，大多數(shù)小RNA是通過實(shí)驗(yàn)方法鑒定的[6，7，8]，而且通過使用焦磷酸測(cè)序(pyrosequence)技術(shù)越來越多的小RNA，包括miRNA，siRNA以及21U-RNA被鑒定出來。雖然克隆和測(cè)序是鑒定新的小RNA最常用的方法，但低豐度的小RNA卻常被漏掉[9]。經(jīng)典克隆測(cè)序的方法要求大量的總RNA，而在樣品數(shù)量有限的情況下得到相當(dāng)量的總RNA會(huì)遇到困難。為了避免上述局限性，人們發(fā)展了許多預(yù)測(cè)小RNA的方法[10-13]，這包括計(jì)算機(jī)篩選，芯片檢測(cè)，比較基因組分析以及從已經(jīng)存在的小RNA基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)它與啟動(dòng)子，終止子結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因?yàn)楹呙芏群塑账岬幕蛐酒呀?jīng)表現(xiàn)出檢測(cè)mRNA表達(dá)的強(qiáng)大威力，因而用基因芯片檢測(cè)并確證小RNA的表達(dá)有可能獲得成功。出于上述目的有些研究人員已經(jīng)發(fā)展出利用組合方法鑒定新的miRNA的方法，例如Bentwich[13]通過綜合運(yùn)用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和芯片分析發(fā)現(xiàn)了一些新的miRNA。其它幾個(gè)獨(dú)立的研究組也報(bào)道微矩陣芯片是高通量探測(cè)miRNA表達(dá)譜的有效的，靈敏的，而且是專一的檢測(cè)方法[14-23]。但以往的芯片檢測(cè)探針為20個(gè)左右的寡核苷酸，與樣品中的小RNA相互作用的強(qiáng)度不夠高，對(duì)于低分子量和低豐度的小RNA的檢測(cè)中存在著漏檢的問題，同時(shí)目前采用的檢測(cè)探針容易受樣品中的小RNA前體的干擾。因而提高探針檢測(cè)小RNA的靈敏度和專一性以及提供高質(zhì)量的小RNA純化樣品，提高小RNA尤其是分子量低于40個(gè)堿基的實(shí)驗(yàn)樣品是進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的具有重要生物功能的小RNA需要克服的主要技術(shù)瓶頸。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠通過綜合使用小RNA的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，小RNA的富集技術(shù)以及通過包括用特定方法制備的探針的小RNA芯片的高通量檢測(cè)，鑒定從人蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)生成的小RNA分子，提高檢測(cè)小RNA信號(hào)的靈敏度以及提高對(duì)樣本中低豐度小RNA的檢測(cè)能力。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種能高效結(jié)合成熟小RNA的新型寡核苷酸探針，如圖1所示，以及制備這種探針的方法。這種探針由三個(gè)部分組成共有序列1，與成熟小RNA雜交的序列專一性寡核苷酸部分2(即，雜交序列2)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)3，探針的總長(zhǎng)度為40-70個(gè)堿基，其中能識(shí)別成熟小RNA的雜交序列2的長(zhǎng)度為15-35個(gè)堿基，其特征在于，DNA探針部分2的5’端還連接著10-30個(gè)堿基的高GC含量的無義鏈DNA序列(發(fā)夾結(jié)構(gòu)3)，例如，但不限于，CCGGCCTATTATGGCCGG(本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所舉例中的序列，包括各種能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列)，此序列能形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在探針部分2的3’端連有一段共同的核苷酸序列1，例如，但不限于，TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA。當(dāng)用于本文時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述“共有序列1”或“共同的核苷酸序列1”是指按照常規(guī)方法在大部分的寡核苷酸探針中都可以使用的寡核苷酸序列，也可以叫作“通用序列”。在每條寡核苷酸探針的與芯片基質(zhì)相連端(探針的3’端)帶有氨基連接基團(tuán)，能夠和涂布在基因芯片的載體(例如，玻璃片)表面的有機(jī)硅聚合物通過Schiff堿反應(yīng)固定在芯片表面，從而容易點(diǎn)樣到涂有有機(jī)硅的載體(例如，玻璃板)上而制成基因芯片。
另外，所述寡核苷酸探針中能夠與成熟小RNA形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸中的每一個(gè)核苷酸可以是自然無修飾的，也可以是經(jīng)不同化學(xué)方法修飾的，如肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧修飾的核苷酸。
與現(xiàn)有技術(shù)的寡核苷酸探針(其不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)3，為直鏈探針)相比較，本發(fā)明的寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)在于，除了共有序列1和專一性雜交序列2之外，在探針部分2的5’端還連接著發(fā)夾結(jié)構(gòu)3(即，10-30個(gè)堿基的高GC含量的能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈DNA序列)。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)3形成較大的發(fā)夾環(huán)，其優(yōu)點(diǎn)在于，使得所述寡核苷酸探針提供了較大的空間阻抑作用，避免與小RNA的前體或更長(zhǎng)的同源片段雜交，提高了探針針對(duì)小于40nt的小RNA的特異性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的寡核苷酸探針的方法，其包括在常規(guī)直鏈探針的5’端連接上發(fā)夾結(jié)構(gòu)3。
在檢測(cè)新的小RNA時(shí)，該探針制備方法的新穎性在于選擇了通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)獲得的或已鑒定的潛在小RNA的正義鏈和反義鏈DNA序列，該序列只能與成熟的小RNA片段雜交，形成互補(bǔ)的二聚體，而不能與小RNA的前體或更長(zhǎng)的同源片段雜交形成互補(bǔ)的二聚體。這是因?yàn)檩^大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用。所以這種DNA探針可以提高探針與待檢測(cè)樣品中的互補(bǔ)小RNA的特異性結(jié)合，降低非特異性背景信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度，更適合于檢測(cè)樣本中的低豐度的成熟的小RNA(圖5和6)。這樣成功地去除了小RNA前體的影響。
本發(fā)明的第二方面提供應(yīng)用本發(fā)明第一方面的寡核苷酸探針而制備的小RNA芯片。本發(fā)明第一方面的寡核苷酸探針的3’端帶有氨基連接基團(tuán)，能夠和涂布在基因芯片的載體(例如，玻璃片)表面的有機(jī)硅聚合物通過Schiff堿反應(yīng)固定在芯片表面，從而容易點(diǎn)樣到涂有有機(jī)硅的載體(例如，玻璃板)上而制成基因芯片。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的小RNA芯片可用于制備鑒定和比較不同細(xì)胞之間，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間或細(xì)胞分化前后小RNA的變化，通過檢測(cè)小RNA表達(dá)譜而鑒定細(xì)胞/組織的特異性，以及診斷和評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的來源和分化程度的試劑盒。
本發(fā)明的第三方面在于改良了小RNA樣品純化和富集方法。目前分離樣品中的總RNA以及mRNA的常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序[15-21]并不適合低豐度、低分子量的小RNA的純化與回收，其實(shí)驗(yàn)成本高，純化的產(chǎn)量低，而每次芯片檢測(cè)需要至少1μg的小RNA，按照常規(guī)方法通常需要進(jìn)行3-5次純化，才能滿足進(jìn)行芯片雜交檢測(cè)的實(shí)際需要，增加了實(shí)驗(yàn)的勞動(dòng)和時(shí)間成本。然而，按照本發(fā)明的方法，采用兩步法可以獲得高純度、高回收率(至少1μg)的小RNA，尤其是低分子量，堿基數(shù)小于40的小RNA(本發(fā)明的兩步法在下文稱為“聯(lián)合方法”)。
然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的小RNA分子的純化、富集方法還可以用來純化和富集長(zhǎng)度為40-200nt的小RNA。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，小RNA純化、回收的第一步可以采用商品化的miRNA提取試劑盒，如美國(guó)Ambion公司的mirVana(貨號(hào)為1560)，先從樣品中富集堿基數(shù)為200以及更小的小RNA，將洗脫出來的小RNA組分用乙醇沉淀法回收，然后將該沉淀組分在直徑為4厘米，高度為4厘米的玻璃管電泳柱(見圖2)內(nèi)進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳的電流和電壓根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)，以達(dá)到能將小于40的小RNA與大于40的RNA片段完全分離的目的。電泳儀可為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的產(chǎn)品，例如，BioRed的PowerPac，以分離收集堿基數(shù)低于40的小RNA。但是，本發(fā)明不局限于直徑為4厘米和高度為4厘米的玻璃管電泳柱，其直徑和高度范圍為1cm到10cm，選擇的原則是一次性獲得1μg左右的小RNA分子。所獲得的小RNA用RNA定量試劑盒，如美國(guó)Invitrogen公司的RiboGreenTM試劑盒(貨號(hào)R-11490)進(jìn)行定量。用該方法可一次性獲得足量的短的小RNA，以便用于進(jìn)一步的RNA標(biāo)記和雜交分析。



圖1.新型小RNA檢測(cè)探針的結(jié)構(gòu)示意圖。探針的藍(lán)色部分表示芯片上的每一條DNA探針中的相同的共有序列部分1，黑線部分表示每一條探針中的專一性雜交寡核苷酸序列2，綠色部分是每一條探針中相同的能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列3。該探針的3’端通過氨基與芯片載體的活性基團(tuán)連接。
圖2.改進(jìn)的小RNA柱狀電泳裝置的正視圖。圖2A，制膠裝置圖；圖2B，電泳裝置圖。
圖3.本發(fā)明實(shí)施例1中采用的實(shí)驗(yàn)步驟、主要方法以及某些實(shí)驗(yàn)參數(shù)的流程圖。實(shí)施例1中包括新的小RNA預(yù)測(cè)，樣品的富集和純化，小RNA標(biāo)記，芯片雜交以及小RNA表達(dá)譜的分析。
圖4.用美國(guó)Ambion公司的mirVana miRNA分離試劑盒獲得的小RNA的電泳分析。用mirVana miRNA分離試劑盒將從細(xì)胞中分離純化的總RNA(TOT)進(jìn)一步分離純化為堿基數(shù)高于200(HMW)以及低于200(LMW)的RNA組分。圖4A和4B給出了1微克RNA的各樣品經(jīng)1.2％的變性瓊脂糖凝膠(圖4A)和15％變性聚丙烯酰胺凝膠(圖4B)的電泳圖。
圖5.用改良的大直徑(4厘米)的玻璃管電泳，從低于200(LMW)的RNA組分中分離純化出低于40nt的RNA用于進(jìn)一步的分子雜交試驗(yàn)。圖5給出了分別來自A549和HLF細(xì)胞的10微克RNA的各樣品的RNA印跡(Northern Blot)雜交圖。圖中30nt大小的雜交帶顯示來自兩種不同富集方法(即，純化低于200nt的小RNA的常規(guī)方法和純化低于40nt的小RNA的本發(fā)明的聯(lián)合方法)的差異。
圖6.傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測(cè)探針的特異性比較。其中，“傳統(tǒng)的”為傳統(tǒng)的直鏈探針(不包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)3)，其不但能與成熟的(Mature)(＜40nt)小RNA片段雜交，形成互補(bǔ)的二聚體，也能與小RNA的前體(Precursor)(＞60nt)或更長(zhǎng)的同源片段雜交形成互補(bǔ)的二聚體；“改進(jìn)的”為本發(fā)明的探針，因?yàn)檩^大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用，其只能與成熟的(＜40nt)小RNA片段雜交，形成互補(bǔ)的二聚體，而不能與小RNA的前體或更長(zhǎng)的同源片段雜交形成互補(bǔ)的二聚體。所以這種DNA探針可以提高探針與待檢測(cè)樣品中的互補(bǔ)小RNA的特異性結(jié)合，降低非特異性背景信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度，更適合于檢測(cè)樣本中的低豐度的成熟的小RNA。
圖7.單獨(dú)用mirVana miRNA試劑盒以及用本發(fā)明的聯(lián)合方法分離的小RNA進(jìn)行基因芯片檢測(cè)小RNA表達(dá)譜的比較。總RNA用mirVanamiRNA試劑盒分為堿基數(shù)高于200的高分子量組分(HMW)和堿基數(shù)低于200的低分子量組分(LMW)。隨后低分子量組分進(jìn)一步分為兩個(gè)組分，其中一個(gè)組分的RNA大于40個(gè)堿基，另一組分的RNA小于40個(gè)堿基(Enrich(富集))。為了評(píng)價(jià)這兩種操作在小RNA芯片分析上的差異，40-200nt的低分子量RNA(圖7A，LMW)和小于40nt-RNA(圖7B)經(jīng)熒光探針標(biāo)記后在小RNA芯片上進(jìn)行雜交。圖7A和圖7B的雜交掃描譜的前三行給出的某些強(qiáng)信號(hào)點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)中的不同對(duì)照。圖7C給出了這兩張芯片中相應(yīng)探針處信號(hào)強(qiáng)度的定量比較。
圖8.小RNA芯片技術(shù)能夠檢測(cè)骨髓干細(xì)胞分化前后小RNA的差異表達(dá)。骨髓干細(xì)胞分化前(BMSC)(圖8A)和分化后(HSC)(圖8B)的總RNA分為堿基數(shù)低于200的大分子量組分和堿基數(shù)低于40的低分子量組分。低分子量組分經(jīng)熒光探針標(biāo)記后在小RNA芯片上進(jìn)行雜交。圖8C給出了這兩張芯片中相應(yīng)探針處信號(hào)強(qiáng)度的定量比較。
圖9.小RNA基因芯片技術(shù)可區(qū)分不同細(xì)胞類型的小RNA表達(dá)譜。從骨髓干細(xì)胞(BMSC)(藍(lán)色)，人纖維母細(xì)胞(HLF)(黃色)和A549細(xì)胞(紅色)分離的總RNA純化成高分子量RNA和低分子量RNA(LWM)。低分子量RNA經(jīng)標(biāo)記后雜交，并計(jì)算出三種不同細(xì)胞類型的雜交總熒光強(qiáng)度信號(hào)(圖9A)。圖9B給出了每一種細(xì)胞中可鑒定的小RNA的數(shù)目，并分解成在三種細(xì)胞中共同出現(xiàn)的，在每?jī)煞N細(xì)胞中共同出現(xiàn)的以及僅在某一種細(xì)胞中出現(xiàn)的小RNA的數(shù)目。圖9C給出了三種不同細(xì)胞中小RNA表達(dá)譜的熒光強(qiáng)度分布。

具體實(shí)施例方式 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例僅是用于舉例說明的目的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的精神和范圍由后附的權(quán)利要求所限定。本領(lǐng)域有關(guān)的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開的技術(shù)方案，進(jìn)行不背離本發(fā)明的精神和范圍的修改和變動(dòng)，這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1 用基因芯片檢測(cè)方法從人基因組中的內(nèi)含子以及蛋白編碼區(qū)鑒定小RNA 雖然本實(shí)施例僅限于小RNA基因芯片檢測(cè)的探針制備和用于低豐度小RNA的純化、富集的方法，為便于說明本發(fā)明的應(yīng)用，本實(shí)施例介紹一個(gè)比較完整的小RNA的高通量測(cè)定來檢測(cè)經(jīng)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析可能存在的小RNA。圖3給出了從人基因組中的內(nèi)含子以及蛋白編碼區(qū)鑒定小RNA的實(shí)驗(yàn)流程圖。
1.芯片的制備 從人編碼基因的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了21000條內(nèi)含子序列(http://www.meduohio.edu/bioinfo/eid/index.html)，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)具有生成小RNA可能的內(nèi)含子序列有1256條，從中隨機(jī)選出536條序列，這些序列的宿主基因包括多種功能基因如與轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路、代謝調(diào)節(jié)等有關(guān)。采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3900型高通量DNA合成儀合成這些序列。利用上述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈做為小RNA俘獲探針的一部分(即，專一性寡核苷酸序列2)，該部分的核苷酸的平均長(zhǎng)度為25個(gè)堿基，它的3’端與共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15個(gè)堿基組成的無義鏈寡核苷酸(即，發(fā)夾結(jié)構(gòu)3)，使得每一條核苷酸探針的總長(zhǎng)度約為50個(gè)堿基。將每條探針的3’端進(jìn)行氨基修飾，使之能夠和玻璃板上的聚合硅發(fā)生共價(jià)反應(yīng)從而固定到芯片表面。然后將這些探針分別在用于制備芯片的玻璃板上平行點(diǎn)樣三次，每張芯片上共含4080個(gè)探針點(diǎn)樣點(diǎn)，其中的864個(gè)探針點(diǎn)為不同的對(duì)照探針。對(duì)照探針包括內(nèi)源性和外源性的陽(yáng)性和陰性探針，其中tRNA，let-7，U6和U2 snRNA(序列見表1)作為內(nèi)源性陽(yáng)性探針，另外還合成了多個(gè)外源性陰性探針(序列見表1)。
表1.實(shí)施例1中所用的一些探針(包括一些陽(yáng)性探針和陰性探針)的序列。


芯片的制備采用涂有有機(jī)硅的Corning GAPS-2玻璃板(目錄號(hào)#40003，供應(yīng)商Corning Inc.，美國(guó))為支持材料，并用SmartArray點(diǎn)樣機(jī)(型號(hào)SmartArray-48，供應(yīng)商CapitalBio Corp，中國(guó))點(diǎn)樣，每個(gè)探針點(diǎn)的直徑為150μm，相鄰探針點(diǎn)中心間的距離為240μm，點(diǎn)完探針樣品后讓玻璃片在室溫下干燥24小時(shí)，然后按下述方法清洗掉未共價(jià)結(jié)合的DNA和點(diǎn)樣緩沖液把玻璃片放在一個(gè)燒杯中并在燒杯中放一個(gè)攪拌子，在25℃用0.2％的SDS洗滌兩次，每次5分鐘，然后在50℃用蒸餾水洗兩次，每次5分鐘，再在25℃用0.1M四氫硼二鈉溶液洗滌5分鐘，用0.2％SDS洗滌三次，每次1分鐘，用蒸餾水洗2次，每次1分鐘。將玻璃片室溫下于空氣中徹底晾干后用于雜交檢測(cè)。
本實(shí)施例中的小RNA芯片可以進(jìn)一步制成試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的小RNA芯片，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的檢測(cè)所需要的各種試劑。
2.低豐度小RNA的純化和標(biāo)記 人的A549腫瘤細(xì)胞系(ATCC No.HTB-22，美國(guó))作為純化低豐度小RNA材料的一個(gè)例子。按照美國(guó)Invitrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)操作說明書，收集2×105個(gè)細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水洗滌后用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，混合在其中的基因組DNA用美國(guó)Ambion公司的不含RNase的DNase I分解去除。RNA的純化量用紫外260nm的光吸收測(cè)量。RNA的純度通過測(cè)量樣品在260nm和280nm處的光吸收的比值來評(píng)價(jià)。260nm/280nm的比值在1.8-2.0之間表示RNA的純化質(zhì)量好。RNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分子量分別為5000個(gè)堿基和1900個(gè)堿基的28S和18S的核糖體RNA而說明(圖4)。出現(xiàn)清晰的28S和18S核糖體核酸條帶表明所純化的RNA保持著高度的完整性，相反如果發(fā)現(xiàn)28S和18S條帶變得彌散，表明所制備的RNA發(fā)生了顯著的降解。為了避免mRNA降解的影響，可以用試劑盒如Sigma公司的CelLytic NuCLEARTM抽提試劑盒(目錄號(hào)N-XTRACT.46)先把細(xì)胞核從細(xì)胞中分離出來?？俁NA可以分別從細(xì)胞核和細(xì)胞漿中提取。然后用美國(guó)Ambion公司的mirVana miRNA試劑盒(目錄號(hào)AM1560)從總RNA中富集大小為200nt及用改良的大直徑(直徑為4厘米)的玻璃管電泳，從低于200(LMW)的RNA組分中分離純化出低于40nt的RNA用于進(jìn)一步的分子雜交試驗(yàn)(圖7)。低分子量小RNA的量可以用美國(guó)Invitrogen公司的RiboGreenTM試劑盒(目錄號(hào)R-11490)進(jìn)行定量。
純化的小RNA經(jīng)T4連接酶和過量的5’-磷酸-胞苷-尿苷-cy3(5′-phosphate-cytidyl-uridyl-Cy3-3′)供體與小RNA受體的3’-羥基定量連接[19，24]，進(jìn)行標(biāo)記。15μl的核酸標(biāo)記反應(yīng)體系中含2μg的低分子量RNA(＜200nt)或200ng的小RNA(＜40nt)，0.5mM ATP，50mM HEPES(pH7.8)，5mM DTT，20mM MgCl2，150mg/ml PEG，10mg/ml BSA，10％DMSO，1000ng的5’-磷酸-胞苷-尿苷-Cy3和3個(gè)活力單位的T4連接酶，25℃反應(yīng)2小時(shí)。
3.陣列雜交和檢測(cè)結(jié)果分析比較 3.1陽(yáng)性對(duì)照探針的檢測(cè)結(jié)果 將標(biāo)記的小RNA與芯片上的寡核苷酸探針用通用的雜交方法[15-21]雜交后，用LuxScan 10K-A芯片掃描儀(型號(hào)LuxScanTM 10K-A，供應(yīng)商CapitalBio Corp，中國(guó))記錄各寡核苷酸探針位置處被標(biāo)記的小RNA熒光探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度，并用計(jì)算機(jī)軟件，如Axon公司的GenePix Pro4.0進(jìn)行分析。和小RNA let-7a(序列見表1)相比，小RNA let-7c(序列見表1)、let-7f(序列見表1)的序列只有一對(duì)堿基不能配對(duì)，而let-7a探針檢測(cè)到的信號(hào)明顯的比let-7c和let-7f探針檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)2.1倍[25]，并且用已被廣泛使用的小RNA探針檢測(cè)到的結(jié)果具有明顯的可重復(fù)性[26，27]。
3.2傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測(cè)探針的特異性比較 參見圖6，比較了傳統(tǒng)的直鏈小RNA探針與新型小RNA檢測(cè)探針的特異性。本發(fā)明的探針只能與成熟的(＜40nt)小RNA片段雜交，形成互補(bǔ)的二聚體，而不能與小RNA的前體(＞60nt)或更長(zhǎng)的同源片段雜交形成互補(bǔ)的二聚體(圖6“改進(jìn)的”)。這是因?yàn)檩^大的發(fā)夾環(huán)的阻抑作用。所以，本發(fā)明的這種DNA探針可以提高探針與待檢測(cè)樣品中的互補(bǔ)小RNA的特異性結(jié)合，降低非特異性背景信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度，更適合于檢測(cè)樣本中的低豐度的成熟的小RNA。相反，傳統(tǒng)的直鏈探針(不包含發(fā)夾結(jié)構(gòu))不但能與成熟的(＜40nt)小RNA片段雜交，形成互補(bǔ)的二聚體，也能與小RNA的前體(＞60nt)或更長(zhǎng)的同源片段雜交形成互補(bǔ)的二聚體(圖6“傳統(tǒng)的”)。可見改進(jìn)后的探針大大提高了小RNA芯片檢測(cè)成熟RNA片段的特異性。
3.3本發(fā)明的純化和富集小RNA的聯(lián)合方法的優(yōu)點(diǎn) 圖7比較了僅用mirVana miRNA試劑盒純化的大小在200nt及其以下的小RNA以及進(jìn)一步用本發(fā)明的聯(lián)合方法純化的大小為40nt及其以下的小RNA與本發(fā)明所制備的寡核苷酸探針雜交的不同結(jié)果。以A549細(xì)胞為例，用mirVana miRNA試劑盒純化的小RNA通過用包括本發(fā)明的探針的小RNA基因芯片檢測(cè)可以獲得66種具有明顯信號(hào)的小RNA(圖7A)，而用聯(lián)合方法純化的小RNA樣品經(jīng)與相同的芯片探針雜交后可以探測(cè)到203種具有顯著信號(hào)的小RNA(圖7B)。用本發(fā)明的聯(lián)合方法所給出的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度也比用前一種方法高出幾倍至10多倍(圖7C)。利用本發(fā)明的寡核苷酸探針可以有效去除堿基數(shù)高于40的小RNA與檢測(cè)探針的雜交，正如用本發(fā)明的聯(lián)合方法所富集的小RNA樣品給出較前一種方法所富集的RNA樣品給出的顯著變強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)(圖7C)所表明的。
實(shí)施例2 檢測(cè)細(xì)胞分化前后基因表達(dá)的差異 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)(來源知情的病人)經(jīng)誘導(dǎo)處理后分化為造血干細(xì)胞(HSC細(xì)胞)[28]。收集分化前和分化后的細(xì)胞，并用實(shí)施例1所述的聯(lián)合方法提取小RNA(＜40nt)后，用包括實(shí)施例1中的小RNA檢測(cè)芯片的試劑盒檢測(cè)分化前和分化后的小RNA表達(dá)譜的變化，如圖8A，圖8B所示。定量分析可以確定其中的13種小RNA(序列見表2，SEQ ID No.1-13)在細(xì)胞分化后被顯著下調(diào)，另外4種小RNA(序列見表2，SEQ ID No.14-17)被顯著上調(diào)，如圖8C所示。

實(shí)施例3 通過檢測(cè)小RNA表達(dá)譜鑒定細(xì)胞/組織的特異性 本實(shí)施例采用三種人源性細(xì)胞分化前的人骨髓干細(xì)胞(BMSC)(來源知情的病人)，人纖維母細(xì)胞(HLF)(ATCC No.CCL-186，美國(guó))和人A549細(xì)胞(ATCC No.HTB-22，美國(guó))。從上述三種細(xì)胞中分離純化小RNA后，采用包括實(shí)施例1中的小RNA檢測(cè)芯片的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并分析檢測(cè)信號(hào)的差異。圖9A顯示BMSC和HLF細(xì)胞中被檢測(cè)到的小RNA的總熒光信號(hào)沒有顯著的差別，而和A549細(xì)胞相比，A549中可被檢測(cè)到的小RNA熒光信號(hào)顯著降低，比較可檢測(cè)到的各小RNA的熒光強(qiáng)度差異可以發(fā)現(xiàn)有10種小RNA(序列見表3，SEQ ID No.36-45)是這三種細(xì)胞所共有的，而有5種小RNA(序列見表3，SEQ ID No.31-35)僅在BMSC細(xì)胞中表達(dá)，另外6種小RNA(序列見表3，SEQ ID No.25-30)僅在HLF細(xì)胞中表達(dá)，有7種小RNA(序列見表3，SEQ ID No.18-24)僅在A549細(xì)胞中表達(dá)，這種特異表達(dá)的小RNA譜可以成為鑒定細(xì)胞/組織特異性的一種實(shí)驗(yàn)方法。
表3.小RNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)。
注釋表3中提供的序列是人工合成的寡核苷酸序列，其與芯片上的探針序列互補(bǔ)，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在廣泛意義上，所述序列包括相應(yīng)的sRNA序列。
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IB083242序列表.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所
<120>用于篩選和鑒定低豐度小RNA表達(dá)譜的新型小RNA芯片的制備方法和應(yīng)用
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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)低豐度小RNA的寡核苷酸探針，其特征在于，從5’端到3’端依次由下述三部分組成第一部分為共同的無義寡聚核苷酸(1)，第二部分為能與成熟小RNA雜交的序列專一性寡聚核苷酸(2)，第三部分為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3)，其是由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針具有下述特征之一所述寡核苷酸探針的總長(zhǎng)度在40-70個(gè)堿基之間，所述寡核苷酸探針中能夠與成熟小RNA雜交的寡聚核苷酸(2)的長(zhǎng)度在15-40堿基之間，或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3)的長(zhǎng)度在10-30堿基之間。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸探針，其中所述第一部分的共同的無義寡核苷酸(1)為TTTTTTTTTT或AAAAAAAAAAA，所述第三部分的由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸(3)為CCGGCCTATTATGGCCGG，或者所述第二部分的能夠與成熟小RNA形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸(2)中的每一個(gè)核苷酸是無修飾的，或者是經(jīng)不同化學(xué)方法修飾的，如肽核苷酸(PNA)、閉鎖核苷酸(LNA)、或甲氧-或乙氧-修飾的核苷酸。
4.一種制備權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸探針的方法，其包括在常規(guī)直鏈探針的5’端連接上發(fā)夾結(jié)構(gòu)(3)。
5.一種用于篩選和鑒定低豐度小RNA表達(dá)譜的小RNA芯片，其包括權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針。
6.一種試劑盒，其包括按照權(quán)利要求5所述的小RNA芯片。
7.按照權(quán)利要求6所述的試劑盒的應(yīng)用，其用于檢測(cè)不同細(xì)胞之間、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間或細(xì)胞分化前后基因表達(dá)的差異，或者通過檢測(cè)小RNA表達(dá)譜而鑒定細(xì)胞/組織的特異性，或者診斷和評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的來源和分化程度。
8.按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)分化前后，表達(dá)水平被顯著下調(diào)的小RNA包括SEQ ID No.1-13，表達(dá)水平被顯著上調(diào)的小RNA包括SEQ ID No.14-17。
9.按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，在分化前的人骨髓干細(xì)胞(BMSC)、人纖維母細(xì)胞(HLF)和A549細(xì)胞中都表達(dá)的小RNA包括SEQ ID No.36-45，僅在BMSC細(xì)胞中表達(dá)的小RNA包括SEQ ID No.31-35，僅在HLF細(xì)胞中表達(dá)的小RNA包括SEQ ID No.25-30，僅在A549細(xì)胞中表達(dá)的小RNA包括SEQ ID No.18-24。
10.一種適合于基因芯片檢測(cè)的小RNA分子的純化和富集方法，其特征在于聯(lián)合使用提取小RNA的分離柱和玻璃管電泳柱來富集長(zhǎng)度＜40nt的小RNA的實(shí)驗(yàn)方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型的小RNA芯片，用于篩選和檢測(cè)那些已被鑒定或預(yù)測(cè)的內(nèi)源性shRNA、miRNA和/或其它類型的小RNA，和介紹專用于小RNA的寡核苷酸探針的制備以及低豐度小RNA的純化和富集方法。該短小核苷酸捕獲探針由三部分組成；第一部分為共同序列(1)，第二部分為能與成熟小RNA雜交的寡核苷酸(2)，第三段為由高CG含量組成的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無義鏈核苷酸(3)。樣品中低豐度的小于40nt的小RNA可通過聯(lián)合使用小RNA分離柱和大管徑制備電泳來富集。該方法可靈敏地檢測(cè)到細(xì)胞/組織中低豐度表達(dá)的小RNA分子，可用于鑒定和比較細(xì)胞分化前后小RNA的變化，以及診斷和評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的來源和分化程度。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101608232SQ20081011518
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者殷勤偉, 趙春華, 張洪杰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所