專利名稱：：一種利用等離子體對微生物進行誘變育種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物誘變育種的方法，特別涉及一種利用等離子體誘變微生物的方法。技術(shù)背景微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，能否提高發(fā)酵工業(yè)效率、降低產(chǎn)品成本，關(guān)鍵在于能否選育出優(yōu)質(zhì)的微生物菌種，因此微生物育種工作變得越來越重要。隨著研究的不斷進展，目前已有很多不同水平的微生物育種技術(shù)出現(xiàn)并逐步成熟。其中，誘變育種已經(jīng)在改造微生物菌種、解決育種工作某些特殊問題及開發(fā)新產(chǎn)品等領(lǐng)域中取得了快速的進展，其不僅可以克服常規(guī)育種周期長、進程慢、難以獲得高效變異品種的缺點，而且與基因工程相比，誘變育種操作簡單，尤其對于改造那些具有復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的菌種來說，更具有效率和成本優(yōu)勢，因此，誘變育種一直是發(fā)酵工業(yè)中一種很重要的育種手段。迄今為止，工業(yè)微生物誘變育種的方法主要有化學(xué)誘變、物理誘變或兩者復(fù)合誘變?；瘜W(xué)誘變是利用化學(xué)誘變劑改變DNA的結(jié)構(gòu)從而引起微生物的遺傳變異。目前普遍使用的化學(xué)誘變劑包括堿基類似物、烷化劑、脫氨劑、移碼誘變劑、羥化劑等?；瘜W(xué)誘變的優(yōu)點在于具有專一性，對基因的某些部位具有毒性，且用量少，操作設(shè)備簡單。但是此方法的缺點也同樣明顯，因90%的化學(xué)誘變劑都是致癌物質(zhì)或者極毒藥品，對人體及環(huán)境均有危害，所以使用時必須非常謹慎；而且此方法的誘變穩(wěn)定性差，不適合具有復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的微生物的改造。物理誘變又稱為輻射誘變，可以分為電離輻射和非電離輻射，它們都是以量子為單位的、可以發(fā)射能量的射線。電離輻射中的X射線和"Co產(chǎn)生的Y射線都是高能電磁波，它們可以在照射過程中把物質(zhì)分子或原子上的電子擊中而產(chǎn)生正離子，而快中子雖不直接產(chǎn)生電離，但在穿過物質(zhì)時能把原子核中的質(zhì)子撞擊出來而產(chǎn)生電離；電離輻射主要引起基因突變和染色體畸變。非電離輻射中的紫外線在穿過物質(zhì)時可以使分子或原子中的內(nèi)層電子能級提高，不產(chǎn)生電離；非電離輻射主要使DNA形成二聚體。其它的輻射還包括激光誘變技術(shù)、太空誘變技術(shù)等。物理誘變的后代變異率低，效果不夠理想，穩(wěn)定性低，不適合具有復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的微生物的改造，而且有些物理誘變?nèi)缣照T變等，其成本非常高，使處理品種類型和數(shù)量都受到嚴重的限制。近年來等離子體應(yīng)用于微生物誘變育種的研究也開始起步。等離子體是與物質(zhì)的固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)并存的物質(zhì)第四態(tài)，是一種正離子和電子的密度大致相等的電離氣體。等離子體具有特殊的光、熱、聲、電等物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，己經(jīng)在臭氧合成、紫外光源的制備、高功率C02激光器的制造等很多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。等離子體作為一種物理滅菌手段，具有快速、低溫、操作簡便、無毒性以及殺滅效果好等優(yōu)點。將等離子體用于生物誘變育種還是一個嶄新的技術(shù)，相關(guān)報道甚少。由于微生物對熱的敏感性，能夠用于微生物突變的等離子體還限于冷等離子體。當(dāng)前，在低氣壓條件下可以產(chǎn)生大面積的非平衡冷等離子體，但由于真空腔的存在，一方面使得設(shè)備的制造和維護費用大大增加，另一方面也使得處理微生物的整個過程變得復(fù)雜近來。近年興起的一種離子束注入誘變技術(shù)就是一種在低壓條件下的非平衡等離子體，其主要通過高電壓將氣體電離形成離子，然后通過加速電場獲得帶有高動能的離子，由此作用于目標(biāo)生物而引起誘變效應(yīng)，其最早用于農(nóng)業(yè)育種，目前在微生物育種上也取得一定進展。但離子束注入技術(shù)對靶室的真空度要求非常嚴格，整套設(shè)備很龐大，樣品的拿取非常麻煩，而且離子束溫度很高(40(TC)，故對微生物殺傷率很大，而且在操作過程細胞中的水分很快失去，造成微生物的死亡，從而降低了誘變效率，以上這些都嚴重的制約了離子束注入技術(shù)在工業(yè)微生物育種上的應(yīng)用。目前能夠產(chǎn)生可以作用于微生物的冷等離子體的發(fā)生裝置主要有介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器以及采用裸露金屬電極結(jié)構(gòu)的等離子體發(fā)生器等。中國發(fā)明專利CN1478892A報道了用等離子體改造微生物的方法，但該專利中使用的是真空高壓放電等離子體，處理對象只針對酵母菌，而且處理時間較長，數(shù)小時至數(shù)百小時。中國專利CN1888063A報道用大氣壓冷等離子體進行微生物誘變，但該專利中使用的等離子體發(fā)生裝置為常規(guī)的介質(zhì)阻擋放電等離子體發(fā)生器，工作電壓很高(l-100kv)，樣品需要放置在電極板之間進行處理，主要作用因素為等離子體激發(fā)過程中產(chǎn)生的紫外線以及帶電粒子，處理后必須避光培養(yǎng)，而且此技術(shù)主要作用為紫外線效應(yīng)，因而誘變效率相對較低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種等離子體誘變微生物的方法。本發(fā)明所提供的等離子體誘變微生物的方法，是用以中性活性粒子為作用粒子的等離子體射流輻照待誘變微生物，得到突變的微生物。本發(fā)明的以中性活性粒子為作用粒子的等離子體射流可由現(xiàn)有的大氣壓條件下的氣體放電冷等離子體源產(chǎn)生，例如介質(zhì)阻擋放電等離子體源、電暈放電等離子體源或射頻大氣壓輝光放電等離子體源；產(chǎn)生等離子體射流時所用的放電氣體可以是氦氣、氬氣、氮氣、氧氣和空氣中的一種或其任意混合，所加的電壓可為lkHz-100腿z、小于等于lkV的射頻電壓。在用所述等離子體射流誘變微生物時，等離子體射流的溫度可為10-90°C;可以通過調(diào)節(jié)外加電源的功率調(diào)節(jié)射流溫度。所述待誘變微生物距離所述等離子體射流可以小于等于2cm。所述待誘變微生物的輻照時間可以小于15分鐘。待誘變微生物可為固體培養(yǎng)基上的菌落，或者101-109CfU/ml的菌懸液或者孢子懸浮液。其中，所述待誘變微生物可以為原核微生物、真核微生物、古細菌等，例如細菌或放線菌。所述放線菌具體可為阿維鏈霉菌(5Yre/7foy^ces3yei7W'tj7^s);所述細菌具體可為發(fā)孢甲基彎菌(淑力j^。w'應(yīng)f"'c力卿。".咖)。本發(fā)明中所述等離子體射流誘變微生物的方法，起主要誘變作用的是等離子體射流中的中性活性粒子。主要作用粒子為中性粒子的等離子體射流具有以下優(yōu)點得到的正向突變菌株活性更高，生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力更強，遺傳穩(wěn)定性高；誘變周期短、誘變效率高；可誘變微生物種類豐富，如原核^[生物、真核微生物、古細菌等，既可以是微生物菌落，也可以是菌懸液或者孢子懸浮液；處理后的微生物不需要避光培養(yǎng)，進一步簡化了實驗操作；整個操作簡單、安全、無污染，設(shè)備和實驗成本低等特點，將在工業(yè)微生物誘變育種領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。本發(fā)明方法是在大氣壓、低電壓條件下產(chǎn)生的等離子體射流，其溫度低，避免了射流溫度高而引起大量微生物樣品致死的現(xiàn)象；本發(fā)明方法中所使用的放電氣體種類多，大大豐富了激發(fā)態(tài)活性粒子的種類，因其具有更為豐富的物理和化學(xué)效應(yīng)，所以可以獲得更為豐富的突變株。圖1為質(zhì)粒DNA處理后的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為阿維菌素標(biāo)準樣品HPLC分析曲線。圖3為阿維鏈霉菌(Str印tomycesavermitilis)原始出發(fā)菌株發(fā)酵結(jié)果HPLC分析曲線。圖4為阿維鏈霉菌等離子誘變后所得菌株(Str印tomycesavermitilis，LEBTH245CGMCCNo.2154)發(fā)酵結(jié)果HPLC分析曲線。圖5為發(fā)孢甲基彎菌(Methylosinustrichospori咖)LEB-5CGMCCNo.2173及發(fā)孢甲基彎菌(ifet力^osi77iAsz^z'c力as/^ri娜)0B3b的生長曲線。圖6為傳代培養(yǎng)發(fā)孢甲基彎菌(〃e^^ow'/7Mz^z'c力o邵on'腳)LEB-5CGMCCNo.2173的對數(shù)生長中期的菌體光密度及甲烷單加氧酶活性。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。使用同軸電極放電裝置進行誘變，該裝置為中國專利ZL200620023045.1中所示裸露電極的圓型大氣壓放電冷等離子體發(fā)生器系統(tǒng)。誘變條件為1、外加電源為射頻電源，外加電壓為小于等于lkv，一般操作在200v、頻率為1kHz-IOO腿Z的射頻電壓。2、產(chǎn)生等離子體的放電氣體為氦氣、氬氣、氮氣、氧氣和空氣其中的一種或任意混合。3、載片的材質(zhì)為金屬(如銅、不銹鋼等)、玻璃、塑料、硅片等，所用載片的直徑為5-12mm。不同材質(zhì)的載片的誘變效果無明顯差異。4、射流溫度為10-90°C。溫度可以通過調(diào)節(jié)功率的方式進行調(diào)節(jié)。5、帶有樣品的載片距射流出口小于等于2cm。6、輻照時間為小于等于15min。7、誘變樣品的濃度為10'-l(fcfu/ml，優(yōu)選為106cfu/ml，向載片上的滴加量為10-1000ul，優(yōu)選為10-50ul。利用誘變的具體實驗步驟如下1、樣品載片的制備1)菌懸液或孢子懸浮液的制備將菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后取培養(yǎng)液以5000-10000r/rain的速度離心2分鐘，收集沉淀并用緩沖液、無菌水或生理鹽水洗錄2-3次，將其稀釋至101-109cfu/ml的菌懸液，優(yōu)選為106cfu/ral，制得菌懸液。在無菌條件下，將固體平板上的孢子菌落挑入裝有0.5-5ml緩沖液、無菌水或生理鹽水的試管中，優(yōu)選為2ml，用玻璃棒攪拌，振蕩使孢子分散均勻制得孢子懸浮液；或者在斜面試管中加入0.5-5ml緩沖液、無菌水或生理鹽水，優(yōu)選為2ml，使用接種鏟將培養(yǎng)基表面孢子刮下，再用玻璃棒攪拌，并振蕩使孢子分散均勻制得孢子懸浮液。將制得的孢子懸浮液稀釋至濃度為101-109cfu/ml，優(yōu)選為106cfu/ml。2)樣品載片的制備在無菌條件下，將上述l)中制得的菌懸液或孢子懸液，滴加在載片(該載片的直徑可為5-12mm，可由金屬、玻璃、塑料、硅片等制成)上，滴加量為10-1000ul，優(yōu)選為10-50ul。3)樣品載片的風(fēng)千處理在無菌條件下，將上述2)所制得的液體載片置于冷風(fēng)下風(fēng)干。冷風(fēng)溫度為0-5(TC，優(yōu)選為室溫；風(fēng)干時間為小于或等于2h，優(yōu)選為40min;最終風(fēng)干至載片表面無明顯液滴，樣品含水量為60%-99%。2.誘變操作1)將載物臺上的載片放置區(qū)域用75%酒精擦拭；2)將步驟l制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為小于等于5era;3)打開工作氣體閥門。工作氣體即放電氣體為純氦氣、純氬氣、純氮氣、純氧氣和空氣中的一種或其任意組合。4)打開外加電源，外加電壓為小于等于lkV、頻率在lkHz-100腿z的射頻電壓'，5)通過調(diào)節(jié)外加電源的功率調(diào)節(jié)射流溫度至10-90°C;6)對樣品進行輻照。輻照時間為小于或等于15min。3、分離和篩選將步驟2中經(jīng)過誘變處理的載片置于裝有0.5-10ml(優(yōu)選為2ml)滅菌液體的具塞試管中，劇烈振蕩，以將載片上的菌體或孢子洗脫。無菌液體為無菌水、緩沖液或液態(tài)培養(yǎng)基。將所得的孢子或菌體懸浮液做5個10倍梯度稀釋，取100-1000pl稀釋前及稀釋后的5個濃度梯度的菌懸液或孢子液分別涂布于篩選平板上，優(yōu)選為200pl。篩選平板根據(jù)目標(biāo)設(shè)計配制。將涂布后的平板置于原始菌株最適培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。篩選條件可以是底物耐受型、抗生素耐受型、噬菌體耐受型、產(chǎn)物耐受型、表型突變型、營養(yǎng)缺陷型、溫度敏感型、滲漏缺陷型、細胞膜透性突變型等。在培養(yǎng)后致死率在90%-99.99%的平板上根據(jù)所設(shè)計篩選條件挑選單菌落；在無菌條件下將其轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)；將擴大培養(yǎng)后的菌體轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，再在無菌條件下將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。測量發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物的含量；根據(jù)所測得的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或者質(zhì)量確定目的菌株。下面結(jié)合具體的實施例來進一步說明本誘變方法。實施例l、利用等離子體對DNA進行處理該實例中所使用的DNA如下pUC119，3162bp，從TaKaRa生物公司購買(貨號D3318或D3319)。該實施例中具體實驗步驟如下1)樣品載片制備將pUC119或pUC118質(zhì)粒用無菌水稀釋，取5yL溶液滴加于清潔的載片上，備用o2)樣品處理a、將載臺上的載片放置區(qū)域用75%酒精擦拭，然后封閉；b、將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2-4mra;c、打開工作氣體閥門。工作氣體即放電氣體為氦氣；d、打開外加電源，外加電壓為200V、13.56MHz的射頻電壓；e、此時射流溫度至30士3°C;f、樣品進行輻照。輻照時間分別為30s，lmin，3min，5min，7min;采用UV透過率為88%的石英片遮擋等離子束，照射時間3、5、10min。3)處理后樣品的檢測分析按照上述方法每次處理載片一個。處理后的樣品用5yL無菌水進行溶解，所得處理后溶液通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。結(jié)果如圖l所示，其中泳道l、2分別代表標(biāo)記物和對比組，泳道3-7分別為氦等離子體射流處理0.5、1、3、5和7分鐘的樣品，8-10泳道為經(jīng)UV透過鏡片遮擋后的射流等離子束處理3、5和10分鐘的樣品。由圖1可見，由于等離子體射流中活性粒子的作用，pUC119質(zhì)粒的雙鏈結(jié)構(gòu)可以在處理很短的時間內(nèi)(小于3min)被破壞，而等離子體射流中的紫外線卻很難起到此作用。微生物產(chǎn)生遺傳變異的根本原因在于DNA的改變，本結(jié)果揭示出，等離子體誘變主導(dǎo)因素是等離子束中的活性粒子，而非紫外線。實施例2、利用等離子體誘變阿維鏈霉菌(5Yrepto/^cesayei727i"7h)該實施例中所使用的培養(yǎng)基如下固體培養(yǎng)基高氏I培養(yǎng)基。12rc髙壓滅菌i5分鐘。種子培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯淀粉30g，麥芽膏(北京萊博生物實驗材料研究所20070610)2g，大豆蛋白胨(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，02-31)2g，CoCl26H205mg，余量為水；所述種子培養(yǎng)基的pH為7.0-7.2。121。C高壓滅菌15分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯淀粉50g，酵母粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-14)12g，MgS047H200.5g，K2HP043H200.5g，KC14g，CaC032g，CoCl26H205mg，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0-7.2。12rC高壓滅菌15分鐘。該實施例中具體的實驗步驟如下1)樣品載片制備將阿維鏈霉菌(5Yre/^o7Z^cesaKe/7W'z^hi)接種于固體培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)5-8天，此時固體斜面培養(yǎng)基表面已富含孢子；將2ral滅過菌的生理鹽水加入到固體培養(yǎng)基上，用接種鏟將表面孢子刮下，然后充分振蕩試管，使孢子分散均勻，制得孢子懸浮液；用生理鹽水將制得的孢子懸浮液稀釋至105—6Cfu/ml。取105—6Cfu/ml的孢子懸浮液50ul，將其滴加在滅菌冷卻后的載片上，然后將其置于無菌工作臺冷風(fēng)室溫風(fēng)干，整個操作過程在無菌條件下進行。風(fēng)干約40min后，金屬載片表面不見明顯液滴，此時樣品含水量約為80%。2)樣品誘變a、將載臺上的載片放置區(qū)域用75%酒精擦拭，然后封閉；b、將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2-4mm;c、打開工作氣體閥門。工作氣體即放電氣體為氦氣；d、打開外加電源，外加電壓為200V、13.56細z的射頻電壓；e、此時射流溫度至30土3°C;f、樣品進行輻照。輻照時間為3min。按照上述方法每次處理載片一個。3)誘變菌株的篩選將處理后的載片置于裝有2ml生理鹽水的具塞試管中，劇烈振蕩，將載片上的孢子洗脫，并使其分散均勻，制得孢子懸浮液。取上述孢子懸浮液200ul，涂布于用于篩選的固體培養(yǎng)基上，28"C培養(yǎng)5d;在致死率90%以上的平板上挑取表型(菌落顏色，皺褶等)明顯變化的菌株，在無菌條件下將其轉(zhuǎn)接入固體斜面培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，編號，28'C下培養(yǎng)5-8天；種子培養(yǎng)在無菌條件下，將其轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)在無菌條件下，將上述種子培養(yǎng)液以2%(V:V)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28"C發(fā)酵培養(yǎng)10d。阿維菌素的提取取5mL發(fā)酵液，5000rpm離心5min，棄去上清液，加入2mL丙酮，劇烈振蕩2rain，間隔10min，繼續(xù)振蕩2min，反復(fù)4次；再加入3mL乙酸乙酯，劇烈振蕩2min，間隔10min繼續(xù)振蕩2min，反復(fù)4次；靜置10min，提取上清液50nl加入到2mL甲醇中，振蕩混勻，作為液相樣品。阿維菌素含量的檢測采用高效液相色譜法進行檢測，色譜條件為AgilentTC-C184.6X200mm，流速1.OmL/min，柱溫35。C，流動相甲醇水(80:20)，紫外檢測波長為245nm。并設(shè)未誘變的原始菌株為對照。阿維菌素標(biāo)準品由河北威遠生化有限公司提供，有效成分阿維菌素Bla純度>99%。在以上色譜條件下，阿維菌素Bla標(biāo)準品的保留時間為11.3分鐘(圖2);阿維鏈霉菌(6Yre;^o/^cesarer/wYi^s)原始出發(fā)菌株發(fā)酵結(jié)果HPLC分析曲線如圖3所示，其中，12min處峰為阿維菌素有效成分Bla;阿維鏈霉菌等離子誘變后所得菌株(5Yre;^，yc"are/yw'z^^s，LEBTH245CGMCCNo,2154)發(fā)酵結(jié)果HPLC分析曲線如圖4所示，其中，12min處峰為阿維菌素有效成分Bla。由圖3、4對比可以看出，誘變株的發(fā)酵產(chǎn)物中Bla的絕對含量和相對含量(Bla在所有阿維菌素8種組分中的量)都較出發(fā)菌株高。結(jié)果表明處理時間3niin時，致死率達到90%以上，從其涂布的平板上挑取的IO株菌中，其中3株為正向突變，分別記作1#、2#、3#，其生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力分別較原種提高了60%，47%，37%。生產(chǎn)阿維菌素Bla的能力提高為6(m的菌叫作除蟲鏈霉菌(5Yrep"/Byces3Fer肌'z^7")LEBTH245(即阿維鏈霉菌)，己于2007年09月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，保藏號為CGMCCNo.2154。實施例3、等離子體誘變發(fā)孢甲基彎菌(#eM_^as^ws^ri'c力ospari^7)0B3b(ATCC55314)一、等離子體誘變發(fā)孢甲基彎菌(let力j^ow'/^^ric力o邵oW咖)0B3b(ATCC55314)本實驗中所使用的培養(yǎng)基的組成如下腿S(Higgins'nitrateminimalsalt)液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有0.85克NaN03，0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS047H20，0.007克CaCl22H20，11,2毫克FeS047H20，2.5毫克CuS045H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S04溶液，余量為水；所述NMS培養(yǎng)基的pH為7.0。121"C高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為lmmol/L。微量元素貯存液的組成為ZnS(WH20，0.2042克/升;MnS044H20，0.223克/升；H3B03，0.062克/升;Na城2H20，0.048克/升;CoCl26H20，0.048克/升；KI，0.083克/升。所述微量元素貯存液的溶劑為水。醒S固體培養(yǎng)基是在每升上述麗S液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂得到的。具體的實驗步驟如下1、樣品載片的制備以II型甲烷氧化菌中的發(fā)孢甲基彎菌(ifez^^ow'/W5"^Vc力^panf鵬)0B3b(ATCC55314)為出發(fā)菌株。向裝有30mL麗S液體培養(yǎng)基的lOOmL帶擋板的密閉玻璃培養(yǎng)瓶中接入1.2mLOD,為0.312的發(fā)孢甲基彎菌(ife";^asi/2Mfn'c力o邵oW咖)0B3b的懸浮液，即接種量為4%(V/V)，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內(nèi)空氣30mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲垸至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)；在溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為150rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為12mm的條件下振蕩培養(yǎng)，每24h重新充入混合氣體(空氣甲垸=1:1，V/V)至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)，離心收集生長至對數(shù)生長期的發(fā)孢甲基彎菌(ifez^j^ow'加stric力ospon'〃歷)0B3b，將其重懸于PBS磷酸緩沖溶液中，制得出發(fā)菌株發(fā)孢甲基彎菌(yl/efA77owVmstric/wspow'M)0B3b的懸浮液，其0D,為0.9、細胞干重為1.8g/L。PBS磷酸緩沖溶液的組成為NaCl8g/L，KC10.2g/L，Na2HP041.44g/L，KH2P(^0.24g/L;所述PBS磷酸緩沖溶液的pH為7.2。取上述出發(fā)菌株發(fā)孢甲基彎菌(#ez^F_7asi/7〃sm'c力o邵ori，)0B3b的懸浮液50uL，滴加在滅菌冷卻后的不銹鋼載片上，載片直徑10mm，然后將載片置于無菌工作臺，室溫自然風(fēng)干至載片表面無明顯液滴。全部操作過程在無菌條件下進行。2、誘變操作a、將載臺上的載片放置區(qū)域用75%酒精擦拭，然后封閉；b、將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2mm;c、打開工作氣體閥門。工作氣體即放電氣體為純氦氣；d、打開外加電源，外加電壓為200V、13.56MHz的射頻電壓;e、此時的射流溫度為30±3°C;f、將樣品進行輻照。輻照時間為3min。按照上述方法每次處理載片一個3、誘變菌株的篩選將步驟2中經(jīng)等離子體誘變處理后的載片分別置于裝有l(wèi)mlPBS磷酸緩沖溶液的離心管中，劇烈振蕩，以將載片上的菌體洗脫。取所得的菌體懸浮液200ul，涂布于用于篩選的麗S固體培養(yǎng)基平板上。涂布后的平板置于3(TC、空氣和甲烷體積比為l:l的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天。挑取平板上的菌落分別接入10mlNMS液體培養(yǎng)基中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內(nèi)空氣45mL，然后用己滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲烷至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓，在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為12mm的條件下振蕩培養(yǎng)，每24h重新充入混合氣體(空氣甲垸=1:1，V/V)至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)。通過測量其對數(shù)生長期的菌體濃度及所產(chǎn)生的甲烷單加氧酶的活性來驗證是否是目的誘變菌株。結(jié)果得到一株對數(shù)生長期的菌體濃度為1612-1786mg細胞干重/L發(fā)酵液、甲垸單加氧酶的活性為452-1492U/mg細胞干重的菌株，該正向突變菌的編號為LEB-5，已于2007年09月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，保藏號為CGMCCNo.2173。二、檢測發(fā)孢甲基彎菌(ife^j^ow'/7M^r2'c/osporj'鵬)LEB-5的特性(一)、利用發(fā)孢甲基彎菌(#ez^j^ow'/7^tWc力o印ori湖)LEB-5CGMCCNo,2173發(fā)酵生產(chǎn)甲垸單加氧酶本實驗中所使用的培養(yǎng)基的組成如下NMS(Higgins，nitrateminimalsalt)液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有O.85克NaN03，0.53克KH2P04，2.17克Na2HP04，0.17克K2S04，0.037克MgS047H20，0.007克CaCl22H20，11.2毫克FeS047H20，2.5毫克CuS045H20，2毫升微量元素貯存液，0.5毫升H2S04溶液，余量為水；所述NMS培養(yǎng)基的pH為7.0。121"C高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為lmmol/L。微量元素貯存液的組成為ZnS047H20，0.2042克/升；MnS044H20，0.223克/升;H3B03，0.062克/升;Na2Mo042H20，0.048克/升;CoCl26H20，0.048克/升；KI，0.083克/升；所述微量元素貯存液的溶劑為水。醒S固體培養(yǎng)基是在每升上述NMS液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂得到的。具體實驗步驟如下1、菌株活化將發(fā)孢甲基彎菌(vlfetA^o^z77Mz^z'c力o印orj'咖)LEB-5接種于蘭S固體培養(yǎng)基上，劃線后置于3(TC、空氣與甲烷的體積比為l:l的環(huán)境中培養(yǎng)6天。2、種子培養(yǎng)挑取平板上的菌落接入裝有10ml羅S液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內(nèi)空氣45mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2nm的氣體過濾器(Sartorius，Midisart2000)向瓶中注入甲烷至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)，在溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為150rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為12腿的條件下振蕩培養(yǎng)，每24h重新充入混合氣體(空氣甲垸=1:1，V/V)至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)，制得種子培養(yǎng)液。3、發(fā)酵培養(yǎng)取lml步驟2中生長至對數(shù)生長期(72h)、OD,為0.2、細胞干重為1.52g/L的種子培養(yǎng)液，在無菌條件下將其接入裝有30ml麗S液體培養(yǎng)基的100ml培養(yǎng)瓶中，加蓋橡膠塞，密封；用已滅菌的醫(yī)用注射器抽取瓶內(nèi)空氣30mL，然后用已滅菌的濾膜孔徑為0.2um的氣體過濾器(Sartorius,Midisart2000)向瓶中注入甲垸至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)，在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為12mm的條件下振蕩培養(yǎng)，每24h重新充入空氣和甲烷的混合氣體至瓶內(nèi)恢復(fù)大氣壓(一個大氣壓)，該混合氣體中空氣和甲垸的體積比為1:1。每隔24小時測定一次OD,，并繪制生長曲線。實驗設(shè)三次重復(fù)，并以原始菌株即未經(jīng)誘變的發(fā)孢甲基彎菌(#eW7hW/7Mtrj'c力卿o".咖)0B3b為對照。結(jié)果如圖4所示，發(fā)孢甲基彎菌(#ez^j^ow'/〃s^ric力osporj'腳)LEB-5CGMCCNo.2173的對數(shù)生長期為72-120小時，在144小時達到最高生長量；發(fā)孢甲基彎菌(#e^^ow'/7Mzm'c力os;xv7'MZ7)0B3b的對數(shù)生長期為72-120小時，在96小時達到最高生長量。在各個生長階段，發(fā)孢甲基彎菌(#e^^o^V2tAs^rj'c力o砂orj'娜)LEB-5CGMCCNo.2173的生長量均明顯高于發(fā)孢甲基彎菌(ife^r/ow'/n^Wc力o5joarz'咖)0B3b。其中，OD,和細胞干重的換算關(guān)系為細胞干重=1.42+0.48XOD6。。。換算結(jié)果表明發(fā)孢甲基彎菌(ifetA7^W/7WS^ric/zosporf咖)LEB-5CGMCCNo.2173培養(yǎng)至72、96、120、144小時的菌體含量分別為1634士12mg細胞干重/L發(fā)酵液、1714土17mg細胞干重/L發(fā)酵液、1725±23mg細胞干重/L發(fā)酵液和1732士24mg細胞干重/L發(fā)酵液；發(fā)孢甲基彎菌(船z^^os^〃sthc力o"on'腿)0B3b培養(yǎng)至72、96、120、144小時的菌體含量分別為1248士15mg細胞干重/L發(fā)酵液、1342士llmg細胞干重/L發(fā)酵液、1461士14mg細胞干重/L發(fā)酵液、1471士8mg細胞干重/L發(fā)酵液。4、酶活測定根據(jù)甲垸單加氧酶催化丙烯生成環(huán)氧丙烷的反應(yīng)來測定酶活，具體按照下述文獻中所描述的方法測定BurrowsK.J.，CornishA.，etal，Substratespecificitiesofthesolubleandparticulatemethanemonooxygermsesofife^yJosi;7ws^ricAospariMz0B3b.丄Gen.Microbiol.1984(130):3327—3333。其中，甲垸單加氧酶的酶活定義為在3(TC下，每分鐘催化l微摩爾(ymol)丙烯轉(zhuǎn)化為環(huán)氧丙垸所需的酶量，即lU4umo1環(huán)氧丙烷/分；酶的比活單位定義為lmg細胞干重中所含的酶活力單位，即lU/mg細胞干重。具體方法如下將發(fā)孢甲基彎菌(ifez^j^o^V"sz^z'c力o邵on'咖)LEB-5和發(fā)孢甲基彎菌(ifez^j^asi/7iAz^7'c力as/ori咖)0B3b培養(yǎng)72、96、120、144小時的發(fā)酵液于12000rpm離心，收集菌體，棄去上清液，將菌體重懸于含20raMHC00Na和5mMMgCl2的20mM磷酸緩沖液中至菌液0De。。為0.5;然后將菌液裝于總體積為70ml的反應(yīng)瓶中，膠塞密封后用針管抽取20ml空氣，再充入20ml丙烯氣體，于3(TC水浴搖床中反應(yīng)30min。12000rpm離心3min，測定上清液中環(huán)氧丙垸濃度。測定裝置及條件為氣相色譜儀器(島津GC—2010)，色譜柱(型號AT-5，固定液5%苯基聚硅氧烷，95%甲基聚硅氧烷；柱長25m，內(nèi)徑O.32mm，膜厚3.0"m)，進樣器200。C，柱箱50。C，檢測器200。C，載氣&，流速25cm/sec，H230ml/min，空氣300ml/min，進樣量lul。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如表1所示。表l誘變菌及原始菌所生產(chǎn)的甲垸單加氧酶的比活<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注誘變菌為發(fā)孢甲基彎菌(J/ef力j^ow'/7^sz^z'c力aspari〃歷)LEB-5原始菌為發(fā)孢甲基彎菌(#et/j^ow'"ws^rj'c力ospori咖)0B3b(二)、利用發(fā)孢甲基彎菌(ifef力j^ow'/2Z/5"fn'c力ospoh鵬)LEB-5CGMCCNo.2173發(fā)酵生產(chǎn)甲垸單加氧酶本實驗中所使用的培養(yǎng)基的組成如下NMS(Higgins，nitrateminimalsalt)液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有O.5gNaN03，0.2gK,4，1.5gNa2HP04，0.12gK2S04，0.025gMgS047H20，0.002gCaCl22H20，10mgFeS047H20，2.OmgCuS045H20，lml微量元素DC存液，0.lmlH2S04溶液，余量為水；所述麗S培養(yǎng)基的pH為6.8。121'C高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為0.lmM。微量元素貯存液的組成為ZnS047H20，0.1克/升；MnS044H20，0.2克/升；H3B03，0.012克/升；Na2Mo042H20，0.012克/升;CoCl26H20，0.011克/升；KI，0.07克/升；所述微量元素貯存液的溶劑為水。麗S固體培養(yǎng)基是在每升上述麗S液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂得到的。本實驗中培養(yǎng)發(fā)孢甲基彎菌(ifez^^osj'/wsz^z'c力o邵ar7'"/7)LEB-5的過程中，除培養(yǎng)溫度、空氣與甲烷的體積比、振蕩轉(zhuǎn)速及旋轉(zhuǎn)半徑不同外，其余均與(一)中的培養(yǎng)過程相同。本實驗中的培養(yǎng)溫度為27i:，空氣與甲烷的體積比為l:0.5，振蕩轉(zhuǎn)速為130轉(zhuǎn)/分，旋轉(zhuǎn)半徑為10mm。本實驗中甲烷單加氧酶酶活按照(一)中的方法測定。實驗設(shè)三次重復(fù)。分別測發(fā)孢甲基彎菌(#ez^K7a^/7^z^'c力ospori咖)LEB-5CGMCCNo.2173培養(yǎng)至72、96、120、144小時的0D6。。，分別為0.478、0.657、0.733、0.741，將其換算成菌體含量，分別為1649士23mg細胞干重/L發(fā)酵液、1735±34mg細胞干重/L發(fā)酵液、1771土17mg細胞干重/L發(fā)酵液、1775士32mg細胞干重/L發(fā)酵液。分別測發(fā)包甲基彎菌(#"力_^0'/7^"ic力o邵oi^'咖)LEB-5CGMCCNo.2173培養(yǎng)至72、96、120、144小時的酶活，結(jié)果見表2。表2發(fā)孢甲基彎菌LEB-5產(chǎn)生的甲垸單加氧酶的比活生長時間酶比活(小時)(U/mg細胞干重)72475±2396700±121201023±211441112±18(三)、利用發(fā)孢甲基彎菌(7ffe^r/o^/;iAsz^z'c力057ori咖)LEB-5CGMCCNo.2173發(fā)酵生產(chǎn)甲烷單加氧酶本實驗中所使用的培養(yǎng)基的組成如下麗S(Higgins'nitrateminimalsalt)液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有l(wèi).5克NaN03，1.0克KH2P04，2.9克Na2HP04，0.25克K2S04，0.05克MgS047H20，0.010克CaCl22H20，13毫克FeS047H20，3.5毫克CuS045H20，5毫升微量元素IC存液，l毫升H2S04溶液，余量為水；所述麗S培養(yǎng)基的pH為7.2。12rC高壓滅菌15分鐘。H2S04溶液的濃度為5ramol/L。微量元素貯存液的組成為ZnS04'7H20，0.5克/升;MnS044H20，0.25克/升;H3B03，0.092克/升;Na2Mo042H20，0.050克/升；CoCl26H20，0.095克/升;KI，0.09克/升。所述微量元素貯存液的溶劑為水麗S固體培養(yǎng)基是在每升上述蘭S液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂得到的。本實驗中培養(yǎng)發(fā)孢甲基彎菌(ifet力j^osj'/wstrj'c/osporj'腿)LEB-5的過程中，除培養(yǎng)溫度、空氣與甲烷的體積比、振蕩轉(zhuǎn)速及旋轉(zhuǎn)半徑不同外，其余均與(一)中的培養(yǎng)過程相同。本實驗中的培養(yǎng)溫度為33'C，空氣與甲烷的體積比為l:1.5，振蕩轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，旋轉(zhuǎn)半徑為15mm。本實驗中甲垸單加氧酶酶活按照(一)中的方法測定。實驗設(shè)三次重復(fù)。分別測發(fā)孢甲基彎菌(#e^^ow'/Mfric力ospori'娜)LEB-5CGMCCNo.2173培養(yǎng)至72、96、120、144小時的0D6。。，分別為0.428、0.637、0.731、0.737，將其換算成菌體含量，分別為1625土12mg細胞干重/L發(fā)酵液、1726土13mg細胞干重/L發(fā)酵液、1775土9mg細胞干重/L發(fā)酵液、1775±llmg細胞干重/L發(fā)酵液。分別測發(fā)孢甲基彎菌(i/^力/2oi做s^^'c力o印ori咖)LEB-5CGMCCNo.2173培養(yǎng)至72、96、120、144小時的酶活，結(jié)果見表3。表3發(fā)孢甲基彎菌LEB-5產(chǎn)生的甲烷單加氧酶的比活生長時間酶比活(小時)(U/mg細胞干重)72483±1296714±141201123±171441352±15(四)、發(fā)孢甲基彎菌(ifez^7"w^"s^ric/w邵ari咖)LEB-5的遺傳穩(wěn)定性檢測取lml(—)中生長至對數(shù)生長中期即96h的發(fā)孢甲基彎菌(#"A^aV7Mtric力o矽^i湖)LEB-5CGMCCNa.2173的種子培養(yǎng)液，在無菌條件下將其接種于裝有30ml蘭S培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，按照(一)中的方法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期96h時(第一代)；從中取lml菌液，在無菌條件下將其接種于裝有30mlNMS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，按照實施例2中的方法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期96h時(第二代)；如此再繼續(xù)傳代培養(yǎng)8代。測定1-10代每代生長至對數(shù)生長中期(96h)的菌體光密度及甲垸單加氧酶的活性，測定方法如同(一)中所述，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明在傳代培養(yǎng)的1-IO代中，每代生長至對數(shù)生長中期(96h)的菌體光密度ODeoo都保持在O.62-0.65的一個很穩(wěn)定的范圍內(nèi)，發(fā)孢甲基彎菌(ifez^j^o幻'72Mtric力o印ori咖)LEB-5生產(chǎn)的甲垸單加氧酶的活性也都保持在693-730U/mg細胞干重的一個很穩(wěn)定的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種等離子體誘變微生物的方法，是用以中性活性粒子為作用粒子的等離子體射流輻照待誘變微生物，得到突變的微生物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述等離子體射流的溫度為10-90。C。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待誘變微生物距離所述等離子體射流小于等于2cm。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述待誘變微生物的輻照時間為小于15分鐘。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待誘變微生物為原核微生物、真核微生物或古細菌。6、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待誘變微生物為菌落、孢子懸浮液或者菌懸液。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述待誘變微生物為細菌或放線菌。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述放線菌為阿維鏈霉菌(5Yre/tci/^cesaFer歷i;所述細菌為發(fā)包甲基彎菌(^ez^j^Zosinws全文摘要本發(fā)明公開了一種等離子體誘變微生物的方法，是用以中性活性粒子為作用粒子的等離子體射流輻照待誘變微生物，得到突變的微生物。本發(fā)明方法中，起主要誘變作用的是等離子體射流中的中性活性粒子，具有以下優(yōu)點得到的正向突變菌株活性更高，生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力更強，遺傳穩(wěn)定性高；誘變周期短、誘變效率高；可誘變微生物種類豐富，如原核微生物、真核微生物、古細菌等，既可以是微生物菌落，也可以是菌懸液或者孢子懸浮液；處理后的微生物不需要避光培養(yǎng)，進一步簡化了實驗操作；整個操作簡單、安全、無污染，設(shè)備和實驗成本低等特點，將在工業(yè)微生物誘變育種領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。文檔編號C12N13/00GK101624591SQ200810116220公開日2010年1月13日申請日期2008年7月7日優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日發(fā)明者楠丁,包成玉,昊吳,孫文廷,果李,李和平,森王,王立言,緱仲軒,趙洪新,邢新會,黃子亮申請人:清華大學(xué)