專利名稱：生理時鐘調(diào)控蛋白lhy在培育耐逆植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生理時鐘調(diào)控蛋白LHY在培育耐逆植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
逆境脅迫下植物的基因表達(dá)譜會發(fā)生變化，對擬南芥的研究表明，約30%的基 因表達(dá)量變化超過2倍(transcriptome Changes for Arabidopsis in Response to Salt, Osmotic, and Cold Stressl. Joel A. Kreps， Yajun Wu， Hur-Song Chang， Tong Zhu， Xun Wang， and Jeff F. Harper Plant Physiology, December 2002， Vol. 130， pp. 2129-2141)，包括如下蛋白的編碼基因1)直接參與植物脅迫 應(yīng)答的離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(脯氨酸和甜菜堿等)合成酶； 2)參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子(蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子)， 如DREB類轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region /leucine zipper raotif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有堿性螺方定-環(huán) -螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家 族等。
Z7^屬于MYB類DNA結(jié)合蛋白的編碼基因，是植物生理時鐘調(diào)控基因。植物生 理時鐘調(diào)控基因調(diào)控光周期誘導(dǎo)的開花、胚軸的生長、子葉的運動以及氣孔的開關(guān) 等。Z^y與另一個基因7<%7—起構(gòu)成調(diào)控擬南芥光、暗周期生理節(jié)律的負(fù)反饋基因 環(huán)，處于植物生理調(diào)控的相對上游位置，迄今為止，被認(rèn)為調(diào)控植物的開花時期，
過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時期延遲，營養(yǎng)生長時期延長(Light-regulated translation mediates gated induction of the Arabidopsis clock protein LHY. The EMB0 Journal,2003， 22(4) : 935-944)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供生理時鐘調(diào)控蛋白LHY在培育耐逆植物中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供了一種培育耐逆植物的方法，是將生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基 因?qū)胫参锛?xì)胞，得到耐逆植物。
所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有生理時鐘調(diào)控功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
來源于擬南芥的植物生理時鐘調(diào)控蛋白LHY (GenBank Accession Number AJ006404)由645個氨基酸殘基組成，見序列表的序列1，序列1中自氨基端第27 位至第83位氨基酸殘基是MYB類DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在所述結(jié)構(gòu)域以 外進(jìn)行的不多于三十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA 分子
1) 其編碼序列是序列表中序列2自5'末端第60-1997位脫氧核糖核苷酸所示 的DNA分子；
2) 其核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子；
3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
4) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼所述蛋白的DNA 分子。
上述嚴(yán)格條件可為在5XSSC， 5XDenhardt， S溶液，0. 05mg/mL魚精DNA， 50% 去離子甲酰胺溶液中，在65T下雜交，然后在室溫用2XSSC，0. 1% SDS，在42。C用 0. 25XSSC， 0. 1% SDS各洗膜15分鐘、兩次。
來源于擬南芥的植物生理時鐘調(diào)控蛋白的編碼基因(GenBank Accession Number AJ006404)由1938個脫氧核苷酸組成，為序列表的序列1自5'末端第 60-1997位脫氧核糖核苷酸。
所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基因可通過任何方法導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，如通 過圖1所示的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)。
所述耐逆性具體可為耐鹽和/或耐旱。
本發(fā)明還保護(hù)圖1所示的表達(dá)載體。
含有圖1所示的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述重組菌具體可將圖1所示的表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404得到。 光合作用的光采集反應(yīng)(light-harvesting reactions)中的ll個基因和光 合體系反應(yīng)中心的10個基因都受到生理時鐘的調(diào)控。參與植物碳、氮、硫合成、 代謝消耗和運輸儲藏途徑的基因也受到生理時鐘的調(diào)控，如6個參與糖分解和氧化戊糖磷酸鹽路徑的基因，2個參與將葡萄糖轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷路徑的基因，9個參
與氮的調(diào)節(jié)的基因，5個參與硫消化代謝的基因等。因此可以說植物生理時鐘調(diào)控
基因也調(diào)控了植物細(xì)胞的糖、氮、硫等的基礎(chǔ)代謝過程。發(fā)明人認(rèn)為植物的耐逆和 植物細(xì)胞基礎(chǔ)代謝這兩個生理調(diào)控過程是密切關(guān)聯(lián)的。
實驗表明，編碼LHY蛋白基因的過量表達(dá)能增強植物對逆境，特別是旱/鹽脅 迫的耐逆性，表明LHY蛋白在植物耐逆機制中發(fā)揮重要作用，也證明了植物的耐逆 和基礎(chǔ)代謝這兩個生理調(diào)控過程密切關(guān)聯(lián)。同時LHY蛋白的過量表達(dá)還能提高植物 的生物總量。將LHY蛋白應(yīng)用于植物育種，培育轉(zhuǎn)基因植物，可以增強植物的耐逆 性和提高植物的生物總量，具有深遠(yuǎn)的理論意義及廣泛的實踐意義。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā).明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為￡#}1直物表達(dá)載體物理圖譜
圖2為zwr轉(zhuǎn)基因擬南芥在正常培養(yǎng)條件下的生長狀況
圖3為Z^F轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱實驗結(jié)果
圖4為z^r轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽實驗結(jié)果
圖5為^5T轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR驗證照片
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例中采用的試驗方法均為常規(guī)方法，參見以下文獻(xiàn)Sambrook and Russell" Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2001); Cloning: A Practical Approach, 〃 Volumes I and II(D. N. Glover，ed. ， 1985); 〃王 關(guān)林、方宏筠，"植物基因工程"第二版，2002年第2版。
實施例1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
一、LHY編碼基因的獲得
1、 提取RNA
液氮研碎-70。C保存的擬南芥(AraZ^/opsis t力a"a朋)葉片，每0. lg的葉片 中加入lml TRIZ0L RNA提取液(鼎國生物技術(shù)公司)，提取總RNA。將得到的總 RNA用DNase酶(Prmega， America)消化，去除殘存的DNA，用分光光度計(Eppendorf 公司，德國)檢測樣品中總RNA的濃度。
2、 LHY編碼基因的獲得根據(jù)NCBI上的Zv77基因序列(GenBank Accession Number AJ006404)設(shè)計一 對引物如下
LHY-S: 5， -GGGATACTTTACTTGTTAGAGAGGATTTG;
LHY-A: 5，-AAGATATTGATAAAAATGTGGATGT 。 .取5Pg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 以得到的cDNA片段為模板進(jìn)行PC財廣增反應(yīng)。
25WPCR反應(yīng)體系為:0. 1PgcDNA、 1. 5raMMgCl2、 20mM Tris-HC1 (pH8. 4) 、 50raM KCl、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2MM引物L(fēng)HY-S和O. 2MM引物L(fēng)HY-A、 lU的Taq聚合酶(上 海申能博彩生物技術(shù)公司)。
在PCR-熱循環(huán)儀(E卯endorf公司，德國)中進(jìn)行PCR循環(huán)94°C預(yù)變性5分鐘； 再94。C 30秒，52°C 30秒，72°C 2分鐘，共30個循環(huán)；最后72。C IO分鐘。
PCR擴增后得到了約2kb的DNA片段，用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有 限公司)回收該片段并測序(三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司)。測序結(jié)果表明，該片段大 小為2044bp，核苷酸序列如序列表中的序列l(wèi)所示，含有Z^堪因序列(序列l(wèi)的第 60位至第1997位核苷酸)。
將得到的DNA片段插入質(zhì)粒pUC18 (Genbank Accession L09136)的S/ a I位點， 得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pUC18: :ATLHY。
二、植物表達(dá)載體構(gòu)建
1、 pBI121m的構(gòu)建
1) SWXI和JZ oI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA2300 (Genebank: AF234315)，回收約 780bp長的35S啟動子，將其連接到經(jīng)S。力I-酶切的具有相同互補末端的質(zhì)粒 pUC18上，得到質(zhì)粒pUC18-35S。
2) 歷/ din和Wal雙酶切步驟1)得到的質(zhì)粒pUC18-35S，回收795bp小片段， 與同樣酶切的pBI121(Genebank: AF485783)載體骨架連接，將得到的重組質(zhì)粒命 名為pBI121ml。
3) 5"鵬I和5"acI雙酶切pBI121，將得到的含有wsA基因的1887bp片段經(jīng)補 平處理后插入質(zhì)粒pUC18的6"鵬I位點上，得到pUC18-卵sA。
4) S鵬I和feci雙酶切步驟3)得到的質(zhì)粒pUC18-《mA，將得到的1895bp片段 插入同樣酶切的pBI121ml的載體骨架中，將得到的重組質(zhì)粒命名為pBI121m。
二、植物表達(dá)載體pBI121m: :ATLHY的構(gòu)建勤刀I和5"鵬I雙酶切質(zhì)粒pUC18: :ATLHY，回收2. 04kb的Z^T基因片段，插入 到同樣雙酶切的質(zhì)粒pBI121m上，將得到的重組質(zhì)粒命名為pBI121m::ATLHY,質(zhì)粒 pBI121m: :ATLHY的結(jié)構(gòu)如圖1所示，基因受到啟動子35S的控制，終止子為Tnos。
將pBI121m: :ATLHY轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，得到含有pBI121m: :ATLHY的農(nóng)桿菌 菌株，將該菌株命名為TpBI-ATLHY。
實施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及轉(zhuǎn)基因植株耐逆性
一、 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
分別用TpBI- ATLHY農(nóng)桿菌侵染擬南芥"raZ)Wo戸z;y ^///朋a)，以獲得轉(zhuǎn) 基因植株，具體操作如下
擬南芥按常規(guī)方法培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照時間16/8小時，光照強度不低于
5000Lux，溫度22攝氏度，濕度70%。
培養(yǎng)介質(zhì)為按l: l混勻的蛭石和草炭土，每周澆一次"花無缺"營養(yǎng)液(每2 升水加1克，上海永通化工有限公司)，幼苗生長約25天后，第一個花序長到高8 厘米左右時從基部掐除，再過一周時間二次抽薹，花蕾剛要露白時用農(nóng)桿菌進(jìn)行侵 染。農(nóng)桿菌使用濃度0D600 1.2-1.4，菌液4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，以等體 積的5%蔗糖溶液懸浮，測其0D600值，換算后用5%的蔗糖稀釋至浸染時的使用濃 度0D600 0.8，加入萬分之三體積的Silwet L-77溶液，混勻后進(jìn)行浸染，浸染方 法采取"蘸花法"，即用槍頭吸取農(nóng)桿菌液滴蘸花絮。遮光24小時后重新正常生 長。5-6天后進(jìn)行第二次侵染，共浸染3次。侵染結(jié)束后約一個月左右收種。
所得T1代種子在抗性培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因苗，方法為70%酒精表面消毒1 分鐘，次氯酸鈉溶液(5。/。次氯酸鈉+0.5。/。SDS)，消毒15分鐘，無菌水洗滌5遍， 播種于1/2MS固體培養(yǎng)基(加卡那霉素30mg/l +羧卞125mg/l) 。 4"C冰箱放置3 天后置于正常培養(yǎng)間光照培養(yǎng)，十天后將抗性苗移至蛭石和草炭土的營養(yǎng)基質(zhì)中， 常規(guī)培養(yǎng)，兩個半月后收種為T2代種子。
將用上述方法篩選得到的T2代植株的種子培育成小苗，共得到了 30個株系的 轉(zhuǎn)^^基因擬南芥。
在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)兩個月，觀察并拍照，見圖2。圖2中，左為轉(zhuǎn)zwr基 因擬南芥，右為野生型擬南芥。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Z^7基因擬南芥營養(yǎng)生長長勢明顯優(yōu) 于野生型擬南芥，生殖生長延后。
二、 耐旱試驗將30個株系的轉(zhuǎn)LY7基因擬南芥和未篩選的野生型擬南芥進(jìn)行耐旱實驗。具 體方法如下
將經(jīng)過卡那篩選的30個株系的轉(zhuǎn)ZW7基因擬南芥和未篩選的野生型擬南芥， 每個株系各7株，同時對稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)。每個株系設(shè)3個重復(fù)。常規(guī) 管理，澆水3次后停止?jié)菜芎髲?fù)水，一周后觀察并拍照。
耐旱實驗例見圖3。圖3中，左為轉(zhuǎn)Zi^基因擬南芥，右為野生型擬南芥，以 白牌隔開。
實驗結(jié)果顯示，野生型擬南芥全部枯死，而轉(zhuǎn)Z^y基因擬南芥恢復(fù)生長良好。
三、 耐鹽試驗
將30個株系的轉(zhuǎn)Z〃/基因擬南芥和未篩選的野生型擬南芥進(jìn)行耐鹽實驗。具 體方法如下
將經(jīng)過篩選的30個株系的轉(zhuǎn)Z^y基因擬南芥和未篩選的野生型擬南芥，每個 株系各6株，同時對稱地移栽到同一小缽的兩側(cè)。每個轉(zhuǎn)基因株系設(shè)3個重復(fù)。第 一周澆水，第二周和第三周分別澆200mM和300mM的NaCl鹽水。第四周觀察并拍 昭。
"、、o
耐鹽實驗例見圖4。圖4中，左為轉(zhuǎn)Z^7基因擬南芥，右為野生型擬南芥，以 白牌隔開。
結(jié)果顯示，野生型擬南芥漸漸死亡，而轉(zhuǎn)z^y基因擬南芥生長雖然受到影響，
但植株仍保持綠色。
四、 PCR鑒定
在步驟二和步驟三的試驗中均存活的轉(zhuǎn)Z^T基因株系為4個。
取這4個株系T2代植株的葉片和野生型擬南芥的葉片，用CTAB法分別提取基 因組DNA (Steiner JJ， Poklemba CJ， Fjellstrom RG， Elliott LF. ， A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11 ;23(13) :2569-70.)。分別以500ng提取的基因組DNA為 模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物如下
引物F: 5'-CCCACTATCCTTCGCAAGACC (源于35s啟動子序列)-3，；
引物R: 5， -CATGAGAAGCCCACCAAGCA-3'。
反應(yīng)體系為25W，含有500ng基因組DNA、 1. 5raM MgCl2、20mM Tris-HC1 (pH8. 4)、 50raM KCl、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2幽引物F和0.2PM引物R、 1U的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。
在PCR-熱循環(huán)儀(E卯endorf公司，德國)中進(jìn)行PCR循環(huán)先94°C 5分鐘； 再94。C 30秒，52°C 30秒，72°C 1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C IO分鐘。
將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖5所示。圖5中，1: 1Kb Marker; 2:野生型 擬南芥；3-6:轉(zhuǎn)Z^r基因擬南芥。
結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)^^/基因擬南芥的PCR擴增產(chǎn)物有1.2kb的清晰條帶，與預(yù)計的 相同，而野生型擬南芥無1.2kb條帶。序列表
<110>北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司
〈120〉生理時鐘調(diào)控蛋白'LHY在培育耐逆植物中的應(yīng)用
〈130〉 CGGNARY81461
<160〉 2
〈210〉 1 <211〉 645 〈212〉 PRT
<213> 擬南芥屬擬南芥C4ra/ iVopw's ^ a7ia"a) <400> 1
Met Asp Thr Asn Thr 1 5 Pro Tyr Thr lie Thr 20
Glu Arg Phe Leu Glu 35
lie Glu Glu His lie 50
Ala Gin Lys Phe Phe 65
lie Pro Val Cys Gin 85
Lys Arg Lys Pro Asn 100
10
Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Lys Ala 10 Arg
Lys Gin Arg Glu 25 Leu
Trp Gly
Thr
Arg Lys 15
Glu His
Tyr Gly Arg
Ala Leu Arg 40
Lys Thr Ala Val
Gly
Thr 70 Ala
Thr 55
Lys Leu Glu Lys
Leu
Asp Thr Pro Tyr
lie
Pro 105
Glu Asp 30
Ala Trp Gin Arg 45
lie Arg Ser His
Gin 60
Ala Glu Val
Glu 75
lie Pro Pro Pro
Glu 90
Arg Lys Pro
Gly Asn 110
Lys Gly
80 Arg Pro 95
Asn GlyThr Ser Ser Ser Gin Val Ser Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Val Ser 115
Ser Ser Ser Gin
Ser Ala 130
Met Pro Phe Ser Glu 145
Asn Cys Ser Gly
Ser 120
Asn Gin Ala Phe
Leu 135
Thr Ser Thr Gly
Lys 125
Asp Leu Glu Lys
Lys 150
Ser Thr Val Asn
Leu 140
Glu Asn Gin Asp
Val 165
Asp lie Glu Thr
Lys 155
Tyr Pro Leu Pro
Gin Val Ser Gly 180
Asp Val Pro Lys
Ala Val Gin 195
Thr Val His Ser
Gly Thr 210
Asp lie Val Asn Gly 225
Gly Met Val Ser
Met 215 lie
Lys 200 Gin
Ser 185 Asn
Lys 170
Lys Thr Ser Thr
Thr 175 Asp
Asn 230
Asp Phe Met Phe
Lys Asp Lys Tyr
Ala Lys Cys
Asn Tyr Pro
Trp 220
Gin Asn His Pro
Gin 245
Asn Leu Gin Ala
Pro 235
Pro Met Arg Glu
His Gly His Ala 260
Gin Ala Phe Pro
His 250
Thr Ala Ser Ala
Ala Ser His 275
Leu Gin lie Ser
Thr 265
Cys His Ser Gin
Glu 255 Thr
Ser Phe 290
Leu Leu Gin Asn Pro 305
Val Trp Pro Tyr
Ala 280
Thr Phe Ser Asn
Ser 295
Ala His Ala Ala
Ala 310
Ser Val Gly Asn
Leu 300
Thr Phe Ala Ala
Met Ser Ser Ser 340
Ala 325
Pro Pro Ser lie
Ala 315
Gly Asp Ser Ser
Thr 345
Ser 330
Ala lie Ala Ala
Ala 350
Thr 335 Thr
Glu 160 Lys
Asn
Val 190
Gly Asn Asp
Asp 205
His Phe His Ala
Ser 240 Thr
Thr
Thr 270
Asp Tyr Arg
Asp 285
lie Met Ser Thr
Ser 320 Pro
ValAla Ala Ala Thr Ala Trp Trp Ala Ser His Gly Leu Leu Pro Val Cys 355
Ala Pro lie Thr
Ala Pro 370
Thr Pro Ala Met Thr 385
Glu Lys Gin Asn
Ala 360
Val Pro Phe Ser
Cys 375
Met Asp Thr Val
Leu 365
Val Ala Val Pro
Glu 390
Ala Leu Gin Asp
Thr 380
Asn Thr Gin Pro
Thr 405
Ser Asp Asp Ser
Glu 395
Thr Leu Ala Ser
Pro Ala Ser Ser 420
Ser Lys Thr Asn
Gin 410
Glu Thr Gly Val
Asn Ala Asp 435
Ala Val His Asp
Asp 425
Asp Lys lie Glu
Lys 415 Lys
Thr Ala 450
Asp Arg Ser Ser Cys 465
Thr Asp Ala Leu
Asp 440
Asn Thr Ala Gin
Ser 455
Ser Asn Thr Pro
Gly 470
Lys Met Glu Lys
Lys 460
Gly Ser Asp Ala
Thr Asp
Lys Met
Lys Glu 530 Arg Glu 545
Val Asn
Glu
Asp 485
Gin Pro Asp Val
Ser 475
Lys Glu Asp Val
Asn 500
Asp Asn Asn Ser
Asp 490
Glu Leu Asn Asn
Arg 515
Val Ser Glu Glu
lie 505
Asn Asn Ala Thr
Lys 495 Lys
Asn 520
Arg lie Ala Phe
Arg Leu Pro Arg
Gly 535
Ser Phe Ser Pro
Lys
Gin 550
Ser Asp Thr Ser
Gin 540
Gin Val Ala Glu
Lys Ser Gin Asp 580
Gin 565
Ser Cys Ala Ala
Pro 555
Pro Leu Ala Pro
Asp 585
Met 570
Gin Glu Gly Val
Val 590
Asn 575 Met
Phe 400
Ser
Leu
Thr 430
Val Val Val
Glu 445
Lys Asn Leu Val
Glu 480 Glu
lie
Arg 510
Asp Ser Trp
Thr 525
Ala Leu Phe Ala
Asn 560 Phe
lieGly Val Gly Thr Cys Lys Ser Leu Lys Thr Arg Gin Thr Gly Phe Lys
595 600 605
Pro Tyr Lys Arg Cys Ser Met Glu Val Lys Glu Ser Gin Val Gly Asn
610 615 620
lie Asn Asn Gin Ser Asp Glu Lys Val Cys Lys Arg Leu Arg Leu Glu 625 630 635 640
Gly Glu Ala Ser Thr 645
〈210〉 2 〈211〉 2044 <212> 腿
〈213> 擬南芥屬擬南芥UraZ io^A^'5 f力a7^3朋) 〈400> 2
gggatactttacttgttag已gaggatttga6tgcagcgaMagctgcaaccggtcctgtta60
tggatactaataceitctggatagctaaggcaagaaagccatatacaataa120
caaagcagcg卿gcgstggactgaggstg3gCStg卿ggtttctagaagccttg鄉(xiāng)c180
tttatgg犯gagcttggcaacgaattgaagaacatat"tgggctgtt.caga240
tcagaagtcatgcacaaaagttcttcacaagtt￡taa^ggca<300
tccctgtttgccaagctttgttccgcctcctcgtcctaaaCg32l3SCCCa360
atactccttatcctcgaa犯cctgggaacaacggtacatcttcctctcaagtatcatcag420
caa^ageitgcaaaacttgtttcatcggcctcttcttcacagttgaMcaggcgttcttgg480
atttggaaaaaatgccgttctctgagaaaacatcaactggaaaagaaaatcaagatgaga540
attgctcgggtgtttctactgtgaacaagtatcccttaccaaCg￡L￡L￡LC￡Lggtaagtggcg600
aagtaagacctc已actgtggacaacgcggttcaagatgttcccasgaaga660
3ca^gacaaagatggtaacgatggtactactgtgcacagcatgcaaaactacccttggc720
atttccacgc￡lgat￡Lttgtgtfigcada^tgccctca^a^tcatccctcag780
gtatggtatctcaagacttcatgtttcatcct3tga^gagggCBCgC肌840
atcttcaagctac犯cagcatctgctactactacagcttctcatcaagcgtttccagctt900gtcattcacaggatgattaccgttcgtttctccagatatcatctactttctccaatctta960
ttatgtcaactctcctacagaatcctgcagctxatgctgcagctacattcgetgettegg1020
tctggccttatgcgagtgtcgggaattctggtgattcatcaaccccaatgagctcttctc1080
ctccaagtataactgecattgccgctgctacagtagctgctgeaactgettggtgggctt1140
ctcatggacttcttcctgtatgcgctccagctccaataacatgtgttccattctcaactg1200
ttgcagttccaactcc3gca<tggataccgtcaaccgtttg1260
cacagctctgCMgatcaaaccttggcttcgaa3tctcc3gcttcatcat1320
ctgatgattc3ga^ga_ga<ctgg3gt犯CC33gctsa^tgc3ccaMg3tg1380
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tctt204權(quán)利要求
1、一種培育耐逆植物的方法，是將生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，得到耐逆植物。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY是如下 (a)或(b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有生理時鐘調(diào)控功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼 基因是如下l)或2)或3)或4)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列2自5'末端第60-1997位脫氧核糖核苷酸所示的 DNA分子；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分子；3) 在嚴(yán)格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼所述蛋白的DNA分子。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼 基因是通過圖1所示的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的。
5、 如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽和/或 耐旱。
6、 圖1所示的表達(dá)載體。
7、 含有權(quán)利要求6所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
8、 如權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將所述表達(dá)載體導(dǎo) 入農(nóng)桿菌LBA4404得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了生理時鐘調(diào)控蛋白LHY在培育耐逆植物中的應(yīng)用。生理時鐘調(diào)控蛋白LHY可應(yīng)用于培育耐逆植物。本發(fā)明提供的培育耐逆植物的方法，是將生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，得到耐逆植物。實驗表明，將生理時鐘調(diào)控蛋白LHY的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可以使其表達(dá)受組成型啟動子調(diào)控，不受光的調(diào)控，從而增強植物對逆境，特別是旱/鹽脅迫的耐逆性，并提高植物的生物總量，具有深遠(yuǎn)的理論意義及廣泛的實踐意義。
文檔編號C12N1/21GK101302523SQ20081011630
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者茜 吳, 李欽清, 蕾 陳 申請人:北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司