專利名稱：：一個(gè)與丹參酮類化合物生成相關(guān)的二萜合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用cDNA芯片技術(shù)克隆植物二萜合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，尤其涉及丹參主要活性成分丹參酮類化合物生物合成的二萜合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：藥用植物有效成分(次生代謝產(chǎn)物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用^r景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)(魏小勇，方花，李杰芬.植物中藥功能基因研究.中草藥，2005，36(8):1251-1254)，這些基因的克隆將為詮釋藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來(lái)廣闊的應(yīng)用空間。藥用植物丹參&7/vm皿加wr/n'zaBge.為一味常用中藥，素有"一味丹參，功同四物"的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾多復(fù)方、保健品的主要成分。脂溶性的二砲醌類化合物是丹參中主要有效成分，以丹參酮IIA(tanshinoneIIA)為代表，統(tǒng)稱為丹參酮類化合物，是一類松香烷型(abietane)的二萜化合物(IkeshiroY,MaseI,TomitaY.AbietanetypediterpenoidsfromSalviamiltiorrhiza.PA_ytoc/em/sz>7.1989,28:3139—3141)。二砲合斷diterpenesynthase),又稱二萜環(huán)化酶(diterpenecyclase)被認(rèn)為是合成萜類次生代謝終產(chǎn)物的關(guān)鍵酶(TrappSC,CroteauR.GenomicOrganizationofPlantTerpeneSynthasesandMolecularEvolutionaryImplications.GewWa,2001,158:811-832)。由二萜化合物的共同前體櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)到結(jié)構(gòu)多樣的二萜母核化合物的形成一般經(jīng)過(guò)兩歩反應(yīng)，即質(zhì)子化和焦磷酸酯鍵的斷裂。在不同物種中，該過(guò)程可由單一的雙功能酶和兩個(gè)不同的酶分別催化形成。如赤霉素的前體貝殼杉烯在大部分植物中均由內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶(e"-copalylpyrophosphatesynthase,08)和貝殼杉烯合酶(<"/-]110"6116synthase,KS)兩個(gè)酶分步催化完成，而在赤霉菌及松樹中則是單一的CPS/KS雙功能酶將GGPP催化合成貝殼杉烯。形成丹參酮類化合物前體松香烷型母核的二萜環(huán)化酶已在冷杉、云杉等裸子植物中得到克隆和功能鑒定(VogelBS,WildungMR,VogelG,CroteauR.AbietadienesynthasefromGrandFir(j&'&sgra"fifa).cDNAisolation,characterization,andbacterialexpressionofabifunctionalditerpenecyclaseinvolvedinresinacidbiosynthesis.JB'.o/C7ww,1996;271:323262-2326S),但由于萜類環(huán)化酶的催化功能和基因結(jié)構(gòu)在裸子植物和被子植物間存在顯著差異(MartinDM,FaldlJ,BohlmannJ.FunctionalCharacterizationofNineNorwaySpruceTPSGenesandEvolutionofGymnospermTerpeneSynthasesoftheTPS-dSubfamily.尸/a,"尸/y/Sz'o/ogy，2004,135:1908-1927),不能僅通過(guò)序列相似性比較而確定其生化功能，常規(guī)的利用兼并引物克隆目的基因的策略也難以應(yīng)用于該類基因的克隆。通過(guò)前期研究，我們已從丹參中得到能將GGPP催化產(chǎn)生柯巴基焦磷酸(copalylpyrophosphate,CPP)的柯巴基焦磷酸合酶基因"wC尸S)，即完成GGPP的質(zhì)子化過(guò)程，而本發(fā)明涉及的是催化柯巴基焦磷酸的焦磷酸酯鍵的斷裂而形成丹參酮類母核結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶基因，該基因是首次從丹參中得到的丹參酮類成分合成的關(guān)鍵酶基因，在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過(guò)本專利申請(qǐng)中所提及的丹參二萜合酶基因及其氨基酸序列。植物基因克隆的方法有很多種，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年來(lái)，國(guó)外研究者采用經(jīng)典的功能克隆法克隆到一些藥用植物的關(guān)鍵酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先無(wú)目的蚩白或其相應(yīng)基因定位的的情況下分離相關(guān)基因是相當(dāng)困難的。因此，對(duì)于遺傳背景不清，相關(guān)基因產(chǎn)物不明的情況下，表型克隆成為基因克隆的主要方法。基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，它可以對(duì)生物整個(gè)基因組的所有基因表達(dá)同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，作為一個(gè)全新的、強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，已廣泛地應(yīng)用于功能基因組的研究中，也成為挖掘新基因的強(qiáng)有力手段。cDNA芯片已在擬南芥、水稻、番茄、棉花等多個(gè)植物中得到了應(yīng)用，但在藥用植物功能基因研究中還沒有相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種丹參cDNA芯片的制作、雜交、差異基因分析以及功能基因克隆的方法。本發(fā)明提供了一種與丹參二萜醌類化合物合成有關(guān)的基因丹參類貝殼杉烯合酶(&/WaTO'/rtwr/u'zakaunenesynthaselike,Sm&SZ)，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo.L的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNo.l限定的DNA序列具有一個(gè)或幾個(gè)堿基突變，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。一種由上述基因SWj&SZ編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代且具有序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明SEQIDNo.l的DNA序列由2110個(gè)堿基組成，編碼序列表中由595個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)序列SEQIDNo.2。本發(fā)明克隆基因^SV"i^丄經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，其表達(dá)量明顯增加，伴隨著丹參二路醌類化合物如丹參酮IIA的快速積累。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及宿主菌和使用該基岡在調(diào)節(jié)和生產(chǎn)植物二萜類化合物及丹參育種中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。將SEQIDNo.l基因的cDNA克隆到原核表達(dá)載體pET32a的限制性內(nèi)切酶EcoRV禾BNotI位點(diǎn)間，構(gòu)建帶有HIS表達(dá)標(biāo)簽的SmKSL重組表達(dá)載體pET32KSL;轉(zhuǎn)入丑w//BL21(DE3)表達(dá)宿主菌采用ffTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)初步純化后，加入到以SmCPS催化產(chǎn)物為底物的體外酶促反應(yīng)體系屮，正己烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物，GC-MS分析。表達(dá)產(chǎn)物電泳顯示在約86KDa處得到目的蛋白條帶。GC-MS分析結(jié)果表明SmCPS的催化產(chǎn)物在重組SmKSL蛋白酶的催化下，生成了分子量為272(m/z)的新物質(zhì)，通過(guò)分析新產(chǎn)物的分子離子峰與主要裂解方式，認(rèn)為該產(chǎn)物為松香二烯同分異構(gòu)體。研究結(jié)果表明，本發(fā)明與丹參酮類化合物合成有關(guān)的基閑具有二蔽合酶基因的DDXXD特征結(jié)構(gòu)域，酶促反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因催化丹參酮類化合物母核的合成步驟，對(duì)于調(diào)節(jié)和生產(chǎn)植物二萜類化合物及培育高品質(zhì)的丹參具有重要的理論及實(shí)際意義。圖1丹參SmKSL蛋白與其他植物二萜合酶家族蛋白的分子進(jìn)化樹7種二萜合酶蛋白的物種來(lái)源為丹參(5"a/vz'aMz7"'or/n'zfl)、黃瓜(Cwct"mssa"v站)、煙草(Mcort朋a,a6acM附)、擬南芥"rafefo/wz'"Aa/細(xì)fl)、水禾舀(<9，a加/v");北美冷衫"W&sgro"cfo)。圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果1:0d，2:ld，3:2d，4:3d，5:5d圖3丹參受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后^n尺5Z表達(dá)量與丹參酮IIA含量相對(duì)變化曲線圖4重組質(zhì)粒pET32KSL的酶切和PCR鑒定M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DLI5000);1:PCR產(chǎn)物；2-pET32a(+)載休EcoRV和I雙酹切；3:pET32KSL質(zhì)?！陊RV和WWI雙酶切。圖5大腸桿菌表達(dá)pET32KSL的SDS-PAGE分析M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:含pET32KSL的大腸桿菌BL21(DE3)可溶性表達(dá)蚩白；2:含pET32a(+)的大腸桿菌BL21(DE3)可溶性表達(dá)蛋白。箭頭表不目的重組蛋白。圖6LC-ESI-MS/MS檢測(cè)蛋白序列覆蓋率紅色表示檢測(cè)到的氨基酸序列，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為SmKSL理論預(yù)測(cè)序列，檢測(cè)覆蓋率為66.89%。圖7SmCPS+SmKSL雙酶促反應(yīng)產(chǎn)物GC-MS分析A:SmCPS催化產(chǎn)物總離子圖及275(m/z)單離子圖；B:SmCPS和SmKSL雙酶促反應(yīng)產(chǎn)物總離子圖及272(m/z)單離子圖；C:SmCPS催化產(chǎn)物峰1對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖；D:e"f-CPP標(biāo)樣質(zhì)譜圖；E:SmCPS和SmKSL雙酶促反應(yīng)產(chǎn)物峰1對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖；F:貝殼杉烯標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖；G:松香二烯質(zhì)譜圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、丹參cDNA芯片的制作1、丹參總RNA的分離和檢測(cè)取陜西商洛丹參(&/WaM7to/rA/zaBge)根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至65。C預(yù)熱的lOmL提取緩沖液中(CTAB(W/V)2%，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.!/1,EDTA25mmol.i;1，NaCl2.0mol'L—1，PVP402%，亞精胺0.5g/L，巰基乙醇2%),充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的10MLiCl，混勻后放置4'C沉淀過(guò)夜;7500g離心20分鐘，沉淀用500(iLSSTE(SDS0.5%,NaCl1mol.L"，Tris-HCl(pH8.0)10mmol'i;1，EDTAlmmol'L"，在65。C溶解5分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無(wú)水乙醇，-7(TC放置2h;4°C13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于100pLDEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，用GenQuant核酸定量?jī)x測(cè)定A260、A280比值和濃度。置于-80。C冰箱備用。2、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建采用mRNA純化試劑盒(QuichprepTMMicromRNAPurificationKit,Pharmacia公司)分離mRNA后，通過(guò)在cDNA分子兩端加上EcoRl/Notl接頭，在T4多核苷酸激酶的作用下石粦酸4七，與表達(dá)載4本XZAPExpressPredigestedVector(ZAPExpressPredigestedVectorKit,stratagene公司)連氺妾，然后.采用stratagene公司的ZAPExpressPridigestedGigapackCloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)將包裝蛋白在體外包裝連接產(chǎn)物，感染E.coliXLl-BlueMRF'構(gòu)建成cDNA文庫(kù)。3、cDNA芯片的制備3.1PCR擴(kuò)增挑取分離良好的噬菌斑溶于lOC^LSM緩沖液(Amresco公司)中混勻后作為PCR模板。PCR擴(kuò)增引物為XZAPExpress多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的部分序列Ml3-加引物5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'，BK反向引物5'-GGAAACAGCTATGACCTTG-3'。96孔板PCR反應(yīng)體系，準(zhǔn)備如下混合物dNTP(25mmol.L-l)，600pL;Mg2+600|iL，lOx緩沖液lOOO^L;Taq(TakaraExTaq，5UiiL")，40^L'-M13-20引物(12.5拜ol.L-1)，200(iL;BK反向引物(12.5pmol'L-l)200nL;高純水補(bǔ)足至10mL。混合均勻后，用排槍分裝至96孔PCR板。然后各加入6pLDNA模板，混合均勻。在ABI900型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，為94°C30s，54°C30s，72°C2分鐘，循環(huán)結(jié)束后72。C后延伸5分鐘。取3(aL反應(yīng)產(chǎn)物在含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,在SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。3.2PCR產(chǎn)物純化使用96孔Multiscreenfilterplates(Millipore公司)純化板進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化。將1.4.1項(xiàng)下瓊脂糖凝膠檢測(cè)為單一條帶的PCR產(chǎn)物(100pL)轉(zhuǎn)入純化板中；將純化板放于MilUpore的真空裝置上，于15mmHg真空抽濾IO分鐘，直至抽干；加入100pL水，15mmHg真空抽濾10分鐘，直至抽干；從真空抽濾裝置上取下PCR純化板，加入40〖丄(pH8.0左右)的水，將純化板放至搖床上輕搖20~30分鐘重懸DNA;將純化產(chǎn)物吸出，置于酶標(biāo)板上測(cè)定濃度和純度；取l^L純化產(chǎn)物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)；將純化產(chǎn)物真空干燥。3.3cDNA芯片點(diǎn)制根據(jù)上述測(cè)定的濃度差異加入適量50%DMSO作為點(diǎn)樣液，調(diào)節(jié)濃度至約250ng^L-1后，將樣品轉(zhuǎn)移至384孔板中準(zhǔn)備芯片點(diǎn)制。點(diǎn)樣儀為GeneMachme公司OmmGnd100。點(diǎn)樣參數(shù)為針2x12，X:8000，Y:6000;點(diǎn)間距300microns;點(diǎn)陣13x14;點(diǎn)陣間距500microns;矩陣模式442。實(shí)施例2:丹參中二萜合酶基因的克隆-1、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備丹參毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌15834直接感染的方式進(jìn)行Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的毛狀根。取6-7V固體培養(yǎng)基(不含激素)暗藏保存的丹參毛狀根，在無(wú)菌條件下將2g濕根接種于裝有200ml無(wú)激素的6-7V液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)至18d后作為試驗(yàn)材料。培養(yǎng)條件為25。C，110120rmin-l，黑暗條件下培養(yǎng)。2、誘導(dǎo)子的制備和處理酵母提取物(yeastextract,YE)生物誘導(dǎo)子的制備取25g酵母提取物溶于125mL蒸餾水中，加入lOOmL無(wú)水乙醇，置于4。C冰箱靜置4d，傾去上清液，膠狀沉淀溶于125mL蒸餾水中，加入無(wú)水乙醇(乙醇含量達(dá)80%)二次沉淀，離心，沉淀溶于lOOmL蒸餾水中'120'C滅菌20min，冷卻后置于4'C冰箱備用。銀離子(Ag+)的制備取AgNO35.096g溶于100mL蒸餾水中，制備得3mmol'L-l的Ag+。誘導(dǎo)子處理向培養(yǎng)18d的丹參毛狀根培養(yǎng)基中分別加入誘導(dǎo)子組合YE+Ag+(YE2ml、Ag+66.7ul)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別于YE+Ag+處理后不同時(shí)期收獲'用吸水紙吸干，各樣本稱取約2g鮮重于液氮速凍后-70。C保存(提取總RNA)或WC干燥至恒重，7精密稱量毛狀根的千重用于測(cè)定毛狀根中丹參酮IIA的含量。3、誘導(dǎo)子處理后丹參酮IIA的含量變化釆用高效液相色譜法測(cè)定誘導(dǎo)子處理后丹參酮IIA的含量。取干燥至恒重的丹參毛狀根適量，研碎過(guò)40目篩，混勻。取藥材細(xì)粉約0.2g，精密稱量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液4mL，精密稱重，超盧處理40mm，取出放冷，加甲醇溶液補(bǔ)足至原重，搖勻，靜置，過(guò)0.45pm微孔濾膜即得。色譜條件為Waters2695高效液相色譜儀，RP-WatersC18柱(150mmx3.9mm，5,)，檢測(cè)波長(zhǎng)270謹(jǐn);柱溫30°C，流速1.0m.min-1，流動(dòng)相為0.5%醋酸甲醇(A)禾口0.5。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫025min,30%60%A;2530min，60%65%A;3050min，65%70%A;5060min，70%80%A;6061min，80%30%A。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)子處理后，丹參酮IIA含量迅速上升，處理后第48h，丹參酮IIAYE+Ag+處理組是對(duì)照組的3.1倍，處理后第6d處理組是對(duì)照組的7.4倍，處理后第9d，處理組是對(duì)照組的6.9倍。結(jié)果表明丹參毛狀根經(jīng)誘導(dǎo)子處理之后，丹參酮類成分在短時(shí)間內(nèi)迅速積累，丹參酮IIA最大增幅達(dá)7.4倍。4、芯片雜交分析根據(jù)上述誘導(dǎo)子處理后丹參酮IIA的變化情況，選用YE+Ag+處理后48h的毛狀根及對(duì)照組作為芯片雜交樣品，以對(duì)照組(C)為參照，與YE+Ag+(YA)的材料進(jìn)行雜交，重復(fù)兩次，每組均采用正反標(biāo)記以消除染料的誤差。采用間接標(biāo)記法進(jìn)行探針標(biāo)記，包括雙鏈cDNA合成、T7介導(dǎo)的RNA體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄、cDNA用KLENOW酶標(biāo)記等步驟。(1)雙鏈cDNA合成取5昭總RNA，以T7—Oligo(dT)15，-3'，V可以是G、C和A,上海博亞生物技術(shù)有限公司)為引物，用cDNASynthesisKit(TaKaRa公司)合成雙鏈cDNA;雙鏈合成以后用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(2)體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA:用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProduclionSystem(Promega公司)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA;然后用RNeasy試劑盒(Qiagen公司)純化。(3)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄取2(igcRNA'用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶，200U卞L—1(lnvitrogen公司)，9RandomPrimer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(4)cDNA用KLENOW酶標(biāo)記取1嗎cRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用隨機(jī)引物進(jìn)行KLENOW標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化'純化后抽千。標(biāo)記過(guò)程中dATP,dGTP，dTTP使用濃度為120nM，dCTP使用濃度為6C^M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用濃度為40^M。將不同樣品分別用cy3、cy5(Amersham公司)進(jìn)行標(biāo)記，然后溶于30pL雜交液中(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart's,25%甲酰胺)，于42。C雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩千后進(jìn)行掃描。將不同樣品分別用cy3、cy5(Amersham公司)進(jìn)行標(biāo)記，然后溶于30pL雜交液中(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart's,25%甲酰胺)，于42。C雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進(jìn)行掃描。芯片用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進(jìn)行掃描。采用GenePixPro4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化；最后用Ttest方法結(jié)合兩倍差異的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。5、差異基因的獲得和分析將每組芯片兩次重復(fù)的共同差異基因進(jìn)行5'單向測(cè)序，獲得的EST序列采用Windows系統(tǒng)下的StadenPachage(gap4)(http:Vstaden.sourceforge.net)軟件進(jìn)行序列前處理以及拼接聚類。去掉載體、接頭以及低質(zhì)量序列和較短的序列。使用BLASTX(6December2005:BLAST2.2.13released;http:〃www.ncbi.nih,gov/BLAST/)將處理后的EST序列在蛋白質(zhì)水平上與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundantproteindatabase)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果克隆號(hào)為chip30hlO的基因在YA/C雜交結(jié)果中均表現(xiàn)為上調(diào)基因，BlASTX注釋為萜類環(huán)化酶terpenoidcyclase基因，命名為月-參類貝殼杉烯合酶(5Wvz'aw7"'or/u'zfi！kaimenesynthase,5"m^SZ)基因。6、cDNA末端快速擴(kuò)增(5'-RACE和3'-RACE)采用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增SmAT5X的5'末端和3'末端的擴(kuò)增，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作?？俁NA用Trizol(Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊(cè)。以設(shè)計(jì)的GSP1(5'-CATCGCCGCTTGCATACAAATAACA-CCC-3')為5'RACE特異弓i物，進(jìn)行cDNA5'末端的擴(kuò)增。PCR條件為94°C5min，94'C30s、68。C30s、72°C2min(35個(gè)循環(huán))，72°C7min。擴(kuò)增得到長(zhǎng)約翻bp的特異性cDNA片段。根據(jù)S附尤Si基因片段設(shè)計(jì)的3'RACE特異引物為GSP2(5'-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3')，以GSP2為擴(kuò)增引物'進(jìn)行^^fficDNA3'末端的擴(kuò)增。PCR條件為94°C5min，94。C30s、68。C30s、72。C1.5min(35個(gè)循環(huán))，72°C7min。擴(kuò)增出約600bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara公司)回收目的片段，按pMD19T載體(Takara公司)試劑盒操作手冊(cè)將上述片段克隆至pMD19-T載體中，鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)9序(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司)。通過(guò)cDNA雜交所得EST序列和5'-RACE獲得的部分片段測(cè)序結(jié)果可得到序列表SEQIDNO:1所示的丹參萜類環(huán)化酶基因S"化SZ全長(zhǎng)cDNA序列，其所推導(dǎo)的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。7、全長(zhǎng)cDNA的克隆和測(cè)序根據(jù)5'RACE和3'RACE所得到的結(jié)果和芯片雜交獲得的Umgene序列，從兩端設(shè)計(jì)得到鉤取S"i&Si全長(zhǎng)cDNA的引物，正向引物為5、-GGGGGCAGCAGCATATTTCAGTCA-3、，反向引物為5、-TACATGATCTGCCCTAAATAGTTG-3、；再以5'-RACE-ReadycDNA為模板，進(jìn)行LA-PCR。瓊脂糖凝膠電泳表明約在2100bp處出現(xiàn)特異片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T載體中(Takara)，鑒定陽(yáng)性克隆并進(jìn)行雙向測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司)，用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。實(shí)施例3、SmKSL基因序列的生物信息學(xué)分析本發(fā)明涉及的丹參二萜合酶基因Sm尤SZ全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為2110bp，詳細(xì)序列見序列表中的序列1，其中完整開放讀碼框位于192-1979bp。將丹參全長(zhǎng)cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾UNon-redundantGenBankCDStranslation+PDB+SwisSprot+S叩erdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果核苷酸水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)同源性序列，可見利用常規(guī)的兼并引物克隆該基因難度很大。該基因在氨基酸水平上比對(duì)分析顯示，丹參s附^a:基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與其它物種的同源性較低，與煙草萜類環(huán)化酶(AAS98912)(terpenoidcyclase)氨基酸序列同源性最高，僅為36%;與擬南芥內(nèi)根一貝殼杉烯合酶(AAC39443)的氨基酸序列同源性為35%。該基因具有萜類環(huán)化酶保守的"DDXXD"結(jié)構(gòu)基序。利用密碼子分析軟件(http:Wwww.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì)Sm&SL基因的密碼子使用頻率進(jìn)行分析，并依據(jù)該基因的密碼子使用表改變部分堿基e利用生物信息學(xué)軟件(http:〃www.cbs.dtu.dk/scrvices/VirtualRibosome/)和BLAST程序?qū)ν蛔兒蟮幕蛐蛄羞M(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列保持不變，其仍具有DDXDD結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例4、茉莉酸甲酯處理后SmKSL基因表達(dá)與丹參酮IIA含量的分析利用茉莉酸甲酯(lOOmM)處理丹參毛狀根，收集不同時(shí)間點(diǎn)的材料用于丹參Sm^S丄基因表達(dá)量和丹參酮IIA的含量。mRNA表達(dá)量采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)?？俁NA用Trizol(Invi加gene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊(cè)。取l嗎RNA模板按RT試劑盒(Takara公司)說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABIPrism7000SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems，USA)和SYBGREENPCRMasterMix(AppliedBiosystems,UK)試劑盒'以丹參actin基因(GenBank登錄號(hào)DQ243702)(引物序列actin-222:5'畫GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，，actin-488:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3')作為對(duì)照，確證不同時(shí)間都符合要求而且cDNA的量都相差不多。6'm^S'丄基因引物分別為5'CTTCCCAAGACAATGCAAAGAT3鄰5'ATTTCCCTCTCACATTATTAGC3'。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94。C5min后，開始94'C30sec、55。C30sec、72。Clmin共40個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min，最后4°C維持。PCR反應(yīng)結(jié)束后，ABIPrism7000SDS1.1分析工作站自動(dòng)保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)MJ處理后，，m^SZ基因表達(dá)水平于24h內(nèi)迅速升高，之后逐漸降低到對(duì)照組水平(圖2)。經(jīng)actin內(nèi)參基因均一化之后，與對(duì)照組比較，處理后24h，MJ處理組是同時(shí)期對(duì)照組的14.5倍(圖3)，說(shuō)明丹參毛狀根經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，5'm/CS'丄基因表達(dá)水平內(nèi)迅速升卨，從而有利于其編碼的蛋白酶催化柯巴基焦磷酸的環(huán)化，推動(dòng)代謝流向目的產(chǎn)物丹參酮類化合物流動(dòng)。丹參酮IIA含量測(cè)定方法同實(shí)施例2中4所述。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)MJ處理5d后，丹參酮類成分含量迅速上升。處理后第5d，丹參酮IIA成分是對(duì)照組的1.3倍，處理后第10d，丹參酮IIA成分含量是對(duì)照組的6.3倍；處理后第15d，丹參酮IIA成分含量是對(duì)照組的6.9倍(圖3)。結(jié)果表明丹參毛狀根經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，丹參Sm人:ttmRNA能被顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，相繼產(chǎn)牛丹參酮IIA成分的迅速積累。可知所得到的6Vn凡tt基因?yàn)榈⑼惓煞稚锖铣赏緩缴系年P(guān)鍵酶基因之一。實(shí)施例5、SmKSL基因原核表達(dá)及功能分析1、大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR的方法，將經(jīng)RACE方法克隆到的丹參類貝殼杉烯基因的開放閱讀框(ORF)，插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)的EcoRV和油fI酶切位點(diǎn)之間，獲得了攜帶有HIS表達(dá)標(biāo)簽的SmKSL重組質(zhì)粒pET32KSL,進(jìn)行PCR和酶切鑒定(圖4)。2、co/z'[pET32KSL]的誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建的pET32KSL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌五.co/!'BL21&x￡(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，所得菌體超聲破碎，上清液經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析，在約86KDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)的重組SmKSL的蛋白分子量符合；而陰性對(duì)照五.co/z'[pET32a]誘導(dǎo)表達(dá)后在86KDa處未見條帶出現(xiàn)(圖5)。3、重組pET32KSL氨基酸序列LC-ESI-MS/MS分析鑒定SDS-PAGE分離的重組SmKSL蛋白，經(jīng)胰蛋白酶消化分解得到大量的多肽，LC-ESI-MS/MS檢測(cè)分析，使用Bioworks軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行換算，得到MS/MS數(shù)據(jù)采用Sequest檢索引擎和使用Xcalibur軟件與pET32KSL理論預(yù)測(cè)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，得到共507個(gè)氨基酸的多肽序列與pET32KSL預(yù)測(cè)蛋白序列一致'蛋白檢測(cè)覆蓋率達(dá)到66.89。/。(圖6)。結(jié)果表明將SmKSL編碼區(qū)連接到表達(dá)載體pET32a(+)，在IPTG的誘導(dǎo)下，在大腸桿菌Aco/ZBL21&x風(fēng)DE3)中得到了正確的翻譯，在86KDa處所表達(dá)的目的蛋白即為SmKSL理論預(yù)測(cè)蛋白。4、丹參二萜合酶SmKSL的活性分析以GGPP為底物，先建立SmCPS酶促反應(yīng)體系，待反應(yīng)完成后，加入初歩純化的重組SmKSL酶，進(jìn)一步催化SmCPS酶促反應(yīng)產(chǎn)物；第二步催化產(chǎn)物經(jīng)正己烷萃取后，GC-MS分析產(chǎn)物成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以GGPP為底物，空載體表達(dá)空白對(duì)照組和SmKSL單獨(dú)催化組在275(m/z)和272(m/z)處均未出現(xiàn)新的產(chǎn)物。而SmCPS單獨(dú)催化組，如圖7A，總離子圖上在275(m/z)處有新物質(zhì)產(chǎn)生，且單離子掃描發(fā)現(xiàn)275(m/z)只對(duì)應(yīng)一個(gè)峰，質(zhì)譜圖如圖7C，與e",-CPP標(biāo)樣質(zhì)譜圖(圖7D)—致，產(chǎn)物鑒定為e,CPP。SmCPS+SmKSL雙酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組，產(chǎn)物經(jīng)正己烷萃取后，GC-MS檢測(cè)到總離子圖上在272(m/z)處得到新的物質(zhì)，且單離子掃描發(fā)現(xiàn)272(m/z)也只對(duì)應(yīng)一個(gè)峰(圖7B);產(chǎn)物的質(zhì)譜圖如圖7E，在現(xiàn)有的MS檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，與對(duì)應(yīng)-貝殼杉烯(kaur-16-ene)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖相似，但相似度僅為74%。由于相似度較低，且SmKSL催化產(chǎn)物的質(zhì)譜電子轟擊碎片峰中含比較穩(wěn)定的偶離子峰(even-elec加nwn)，如m/z=134和m/z=148，所以排除貝殼杉烯的可能性。考慮到乃參酮類屬松香垸型的二萜類化合物，與裸子植物冷杉屬云杉中松香烷酸母體結(jié)構(gòu)相似，文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)物(m/z272)質(zhì)譜圖與松香二烯(abietadiene)質(zhì)譜圖相4以(Hyung匿JaeLee,MatthewM.Ravn，RobertM.Coates.Synthesisandcharacterizationofabietadiene,levopimaradiene，palustradiene,andneoabietadiene:hydrocarbonprecursorsoftheabietanediterpeneresinacids.Jfe加/jedraw.2001,57:6155-6167.)，且均含有可能由于發(fā)生了環(huán)內(nèi)雙鍵的RDA裂解，而得到m/z^48的偶數(shù)碎片峰。通過(guò)分析新產(chǎn)物的分子離子峰與主要裂解方式，認(rèn)為該產(chǎn)物為松香二烯同分異構(gòu)體。5、丹參二萜合酶SmKSL衍生物的活性分析分別將SEQIDNo.l序列709bp處的C突變?yōu)門、797bp處T突變?yōu)镃、1357bp處T突變?yōu)镃，1589bp處G突變?yōu)門得到衍生序列SEQIDNo.3;797bp處T突變?yōu)镃、1357bp處T突變?yōu)镃，1589bp處G突變?yōu)門得到的衍生序列SEQIDNo.5。其編碼氨基酸序列分別為SEQIDNo.4、SEQIDNo.6，經(jīng)GC-MS檢測(cè)進(jìn)行酶活性分析，發(fā)現(xiàn)所得反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS結(jié)果均與SmKSL產(chǎn)物相同(圖7B、7E)，說(shuō)明均具備與SEQIDNo.2相同的生物學(xué)功能。序列表〈110〉中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所<120〉一個(gè)與丹參酮類化合物生成有關(guān)的二萜合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用〈160〉6<170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉2110〈212〉DNA〈213>丹參(&7w's必7"orr力izaBge.)〈220〉<221>CDS〈222〉(192)..(1979)〈400〉1ttctaatacggggc犯gcgtggtatcaacgcagagtacgcgggggcagca60gcatatttcagtcaaccttttgttgtcatctcttacaagaatccctcctc120actccattcatac已tatcc3cagagcctggcatcgccgccgccgccgccc180cagagctaaagatgtcgctxgccttcaacccggcagccaccgctttctccggcaacgggg240ctcgg3gcagtttccggtga￡LgC3tgtt3Ctttccga,tga300tcaccaataagtcatctttcgccgtgaaatgcaaccttacttgatgggg已360gaagttcaagggg3gtaactttccggcagctgcggctgttcagc420ctgcggcggatatgccctctaatctctgtataatcgacaccctccaaaggttgggagtcg480accgatacttccgatxtgaaatcgacactattctagaggacacatacaggttatggcaac540gg咖g卿gagcgatattttcggatactgctattcatgcaatggcatttagacttt.tgc600gagtc犯gggtx3tca<g3gg已已ctggctccgt已tgctgatc肌gagcacg660ttgacctgcaaacgattgasgtggcg織gttatcgagcttt3C3g3gC3gcacaggaga720g3織ggggs鄉(xiāng)cg卿gc3gtcttaag3aactacatgcttggaccaccacctttctta780agcagaagttgctcactaactccattcctgacaagaagttgcacaaactggtggaatact840ctatcacgggatattagatag犯tggg已gttagac犯aacctcgacctat900atg已tat朋gct已ttatcgaactt.caaaagctgc犯ataggttctctaatctatgtagtg96013犯gattttctagcatttgcgaggcaagattttaacatttgcc已a(bǔ)gcccaacaccagaaag1020aacttcagcaactgcaaaggtgg憶gcagattgtaagttggacaccttg1080g,tg化gtgcgtgttgctaattttctaacttcagcaattattggtgatcctgaattgt1140ccgatgttcgcatagtctttUgtgcttgtgacacgteittgatgattttt1200tcgatc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