專(zhuān)利名稱(chēng)：：與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高等植物為了適應(yīng)缺鐵脅迫，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了兩種鐵吸收機(jī)理機(jī)理i和機(jī)理n，機(jī)理r涉及的植物主要包括非禾本科植物，機(jī)理n涉及的植物主要包括禾本科植物，機(jī)理i和機(jī)理n涉及的植物中同時(shí)存在一種重要的鐵素螯合物-尼克煙酰胺(NA)。由于鐵元素的不穩(wěn)定性和對(duì)細(xì)胞的毒害作用，植物體內(nèi)的鐵必須與螯合物形成復(fù)合物才能被運(yùn)輸和分配。在機(jī)理n植物中，NA是植物體內(nèi)高鐵載體-脫氧麥根酸類(lèi)物質(zhì)(MAs)的合成前體(HiguchiK,etal.Cloningofnicotianaminesynthasegenes,novelgenesinvolvedinthebiosynthesisofphytosiderophores.PlantPhysiol,1999,119(2):471480);機(jī)理I植物不產(chǎn)生也不利用MAs，但它可能與Fe"等二價(jià)金屬離子結(jié)合并被YSL轉(zhuǎn)運(yùn)到或運(yùn)出不同的細(xì)胞或器官，參與非特異金屬離子的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)(DiDonatoJrR丄，etal.Arabidopsisyellowstripe-like2(YSL2):ametal-regulatedgeneencodingaplasmamembranetransporterofnicotianamine-metalcomplexes.PlantJ.2004,39:403414;CurieC，etal.Aloss陽(yáng)offunctionmutatinninAtYSLlrevealitsroleinironandnicotianamineseedloading.PlantJ.2005,44:769~782)。在兩種鐵吸收機(jī)理植物中，存在同樣的NA生物合成途徑即以L-蛋氨酸為底物，在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)催化下合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM再在NA合成酶(Nas)的作用下合成NA。Nas已在多種植物，如煙草、大麥中被克隆到，并已證明其積極響應(yīng)缺鐵脅迫(InoueH,etal.Threericenicotianaminesynthasegenes,(9sA^57,QsvV/452，andCWV/4513areexpressedincellsinvolvedinlong-distancetransportofironanddifferentiallyregulatedbyiron.PlantJournal.2003,36:3,366381;NegishiT，etal.cDNAmicroarrayanalysisofgeneexpressionduringFe-deficiencystressinbarleysuggeststhatpolartransportofvesiclesisimplicatedinphytosiderophoresecretioninFe-deficientbarleyroots.PlantJournal.30(l):83-94)。作為NA合成的重要前體SAM，其合成的限速酶基因是否參與植物的缺鐵應(yīng)答，以及以何種方式響應(yīng)便成為目前的研究目標(biāo)。蘋(píng)果屬小金海棠(71^/^x/ao力'"em^)是一種鐵高效基因型植物，現(xiàn)已通過(guò)2D技術(shù)檢測(cè)到缺鐵脅迫條件下，小金海棠根部鐵元素表達(dá)模式發(fā)生變化的兩個(gè)蛋白屬于S屈S家族成員(郭函子.缺鐵脅迫下小金海棠根特異蛋白的表達(dá)鑒定及M;c&4MS基因克隆[博士學(xué)位論文].北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005)，同時(shí)通過(guò)差異篩選缺鐵脅迫條件下構(gòu)建的小金海棠消減cDNA文庫(kù)也得到6MM9的EST片段(張玉剛，等.抑制性消減雜交分離蘋(píng)果缺鐵誘導(dǎo)的相關(guān)基因.園藝學(xué)報(bào).2007,34(3):555-560);另外，在超表達(dá)^t5"a/^7的煙草中，5^/5"基因由于受到共抑制，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的缺鐵黃化癥狀。因此，可以推測(cè)6^fcS基因與植物缺鐵相關(guān)，可能參與植物體內(nèi)鐵的運(yùn)輸和利用過(guò)程。S-腺苷甲硫氮酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase,SAMSEC2.5.1.6)是植物代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，能催化甲硫氨酸與ATP生物合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAMSATP+L-methionine+H20>phosphate+diphosphate+S-adenosyl-L-methionineSAM在植物體內(nèi)參與多種代謝途徑，是植物體內(nèi)最重要的甲基供體之一，具有轉(zhuǎn)甲基作用，許多生物合成過(guò)程都需要S細(xì)提供甲基；SAM還參與DNA甲基化和葉綠素生物合成等途徑。多胺類(lèi)物質(zhì)參與多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，其中，生物胺(精胺和亞精胺)的合成需要SAM脫羧產(chǎn)物作為氨丙基供體。1953年Cantoni首次從大鼠肝臟中提取得到SAM合成酶，該酶能催化底物L(fēng)-甲硫氨酸和ATP合成SAM。隨后又有人從大腸桿菌和酵母中分離出SAM合成酶。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是生物體代謝過(guò)程中一種重要的化合物，它在動(dòng)物及微生物中均存在，并較早在基因水平上得到研究；而在植物中該酶及其基因的研究則相對(duì)較遲，現(xiàn)已從擬南芥、康乃馨、矮牽牛、白楊、番茄、歐芹、水稻、豌豆及中華獼猴桃等植物中克隆到SAM合成酶的基因，其中，擬南芥菜和豌豆中各有兩種6^i/5"基因(MathurM,etal.DifferentialregulationofS-adenosylmethioninesynthetaseisozymesbygibberellicacidindwarfpeaepicotyls.BiothimBiophysActa.1993,1162(3》283-290)，獼猴桃中有三種6"A!/5"基因(WhittakeDJ.ThreecDNAsencodingS-adenosyl-L-methioninesynthetasefromActinidiachinensis.PlantPhysiol.1995,108(3):1307-1308.)，而番茄中則至少有四種5^ff基因(Esparteroetal.DifferentialaccumulationofS-adenosylmethioninesynthetasetranscriptsinresponsetosaltstress.PlantMolBiol.1994,25(2):217-27.)。植物中的SAMS由一個(gè)多基因家族所編碼，因而存在多種類(lèi)型的5^"基因，它們共同調(diào)節(jié)著SAM的合成速率。每種植物中都可能有幾個(gè)拷貝的6^^基因存在，而且他們的表達(dá)方式也各不相同，在植物的生理代謝中發(fā)揮著不同的功能，有些WMS"基因是組成型表達(dá)，而有些卻是受發(fā)育時(shí)期或/和環(huán)境因子所調(diào)節(jié)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白，名稱(chēng)為MxSAMS，來(lái)源于蘋(píng)果屬小金海棠(Afa/wj;a'aoy7"e"w;y)，是如下l)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐缺鐵相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由391個(gè)氨基酸殘基組成。為了使l)中的MxS認(rèn)S便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述2)中的MxSAMS可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述2)中的MxSAMS的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1的自5'末端第1-1173位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白的cDNA基因具體可為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列i的自5'末端第1-1173位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與l)的基因具有95%以上的同源性，且編碼上述與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白的DNA分子。序列表中的序列1由1176個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1173位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的MxSAMS。上述嚴(yán)格條件可為在6xSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2xSSC,0.1%SDS和lxSSC,0.1%SDS各洗膜一次。擴(kuò)增上述JfcS4i/堪因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有ifoS4M基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白編碼基因lx5^^的植物表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的宿主植物可以是擬南芥等雙子葉植物。使用i/x5^M基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體為可在pCW1301的多克隆位點(diǎn)間插入序列表中序列l(wèi)的自5'末端第1-1173位脫氧核苷酸得到的正義重組表達(dá)載體pCW-35sv^Wifi和反義重組表達(dá)載體pCW-anti必^W5";所述pCW1301是用fco/I和W/7dlI分別雙酶切pCAMBIA1301和P麗101，連接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA1301酶切后的大片段，即得到pCW1301。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐缺鐵的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的耐缺鐵的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述與植物耐缺鐵相關(guān)蛋白的編碼基因ifcS4J^導(dǎo)入植物中，得到耐缺鐵的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可為雙子葉植物，如擬南芥。本發(fā)明從缺鐵處理的小金海棠差異篩選cDNA文庫(kù)中分離出小金海棠的cDNA片段，結(jié)合RACE技術(shù)(RapidAmplificationcDNAends,cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))擴(kuò)增得到小金海棠這一cDNA片段的3，末端和5，末端，然后將得到的小金海棠cDNA序列的3'末端和5'末端通過(guò)拼接，得到小金海棠JfxS^f5"基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)構(gòu)建必5^l/5"的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥植株中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入ifeS"AM的擬南芥植株耐缺鐵性明顯提高，說(shuō)明MxS認(rèn)S是與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白，MxS層S蛋白及其編碼基因可用于提高植物的耐缺鐵性，為進(jìn)一步研究植物體內(nèi)鐵元素運(yùn)輸利用機(jī)制提供理論依據(jù)。由于MxSAMS與大多數(shù)植物的SAM合成酶具有很高的同源性(90%)，因此推測(cè)本發(fā)明的ifc5^f可能與小金海棠中S認(rèn)的生物合成相關(guān)。圖1為小金海棠根部總RNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為必5AI/5"基因的5'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為i/xS^ff基因的3'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖4為JfeSAW基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖5為i^SM5"基因的Southernblot雜交結(jié)果圖6a為缺鐵條件下小金海棠新葉中i&S4iff基因的半定量RT-PCR結(jié)果圖6b為缺鐵條件下小金海棠成熟葉中Jfc5^^基因的半定量RT-PCR結(jié)果圖6c為缺鐵條件下小金海棠根中i/x5"ii^基因的半定量RT-PCR結(jié)果圖7為正義重組表達(dá)載體pCW-35si/xS^i/5的PCR鑒定結(jié)果圖8為反義重組表達(dá)載體pCW-antiifcS"^4J/5^JPCR鑒定結(jié)果圖9為轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體pCW-35sJ/xS4/l/5和轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體pCW-antiifc5^/5的根癌農(nóng)桿菌的菌落PCR檢測(cè)結(jié)果圖10為轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體pCW-35sifeS4M5和轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體pCW-antii/x5"AJ/鄰勺轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗的PCR檢測(cè)結(jié)果圖11為轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體pCW-35s^x5^/5"的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的Northernblot雜交結(jié)果圖12為轉(zhuǎn)基因擬南芥在低鐵培養(yǎng)基、缺鐵培養(yǎng)基和正常供鐵培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后的表型具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測(cè)序工作均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。限制性內(nèi)切酶尸"I、A^7厶及^II及Pfu酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pBS-T-VectorKit購(gòu)自天為時(shí)代生物公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit購(gòu)自Clontech公司，P地高辛雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、DEPC、1200bpDNAMarker、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例1、與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白MxSAMS及其編碼基因的獲得一、雙鏈cDNA的合成以小金海棠(M"/^;a'aq/7"em^)(國(guó)家蘋(píng)果種質(zhì)資源圃，編號(hào)為DGB0458)為實(shí)驗(yàn)材料，提取其根的總RNA，將提取得到的總RNA用5(Hil的DEPC水溶解，電泳檢測(cè)。經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA兩條帶，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大約為1:1-2:1。結(jié)果表明，提取得到的RNA是完整的，染色結(jié)果顯示，提取得到的總RNA可以用來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以上述提取得到的根的總RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以此cDNA為模板，以5'RACECDSPrimer(5F):5'-ACACTGGGAACACCCTGAAG-3'和3'SMARTCDSPrimerIIA(3R):5'-TCCAAACATGCCAAATTGAA-3'為引物，PCR擴(kuò)增#z5>W5"基因的雙鏈cDNA。反應(yīng)混合物如下:__ddH2010xAdvantange2PCRBuffer50xdNTPMix模板(反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA)l|iL5'RACECDSPrimer(5F)3'SMARTCDSPrimerIIA(3R)5OxAdvantage2PolymeraseMixPCR反應(yīng)條件先95"C預(yù)變性lmin;然后95。C變性15S;65T退火30s，共30個(gè)循環(huán)；最后68'C延伸6min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。二、IxWJ/5"基因5'端序列的獲得以步驟一獲得的雙鏈cDNA序列為模板，在其5'端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增#^#5^因的5，端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下:_預(yù)混物_體積(叱)ddH2030.2(il10xPCR緩沖液4.2|ildNTPMixture(25mM)3.2Taq酶(5U/fil)0.5|ul總體積38.1)al，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成4管，每管9pl，按照下表加入引物雙引物對(duì)照5PR1單引物對(duì)照5F單引物對(duì)照樣品5F(序列表中序列3)0.25(il—0.25nl0.25(il5PR1(序列表中序列4)0.25|il一0.25(il模板—0.5pi0.5|il0.5|ilPCR反應(yīng)條件先95"C預(yù)變性3min;然后95。C變性15S;68i:退火6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸7min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，取l叱作為模板，以5F和5PR2(序列表中序列5)為引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取1(￥L第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2和3分別為兩個(gè)單引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，4為5PR2和5F雙引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)單引物對(duì)照組9都沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到700bp的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說(shuō)明書(shū)將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的700bp片段即是ife5^^基因的5，端序列。三、ife5"A^基因3'端序列的獲得以步驟一獲得的cDNA序列為模板，在其3'端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增ifeS4J/堪因的3'端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>總體積38.1)^1，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成4管，按照下表加入引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR反應(yīng)條件先95r預(yù)變性3min;然后95°(3變性15S;68"退火6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，取l叱作為模板，以3R和3RF2(序列表中序列7)為引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取10化第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2和3分別為兩個(gè)單引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，4為3RF2和3R雙引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)單引物對(duì)照組都沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到1000bp的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說(shuō)明書(shū)將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的1000bp片段即是必「5)W5"基因的3'端序列。四、fxS^5"基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得將上述PCR擴(kuò)增獲得的ifr5"A基因5'端序列以及3'端序列進(jìn)行同源性比較，利用DNAMAN等生物軟件進(jìn)行拼接校正，拼接出ifeS^^基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接的i^S^^基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物MSF和MSR(序列表中序列8和序列9)，提取小金海棠根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)i/xWi^基因，用高保真Pfu酶替換化g酶，PCR反應(yīng)混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR反應(yīng)條件先94。C預(yù)變性3min;然后94°C50S，55°Clmin，72°C2min，共35個(gè)循環(huán)；再72"C延伸7min，4。C保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，其中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為Jfc5^"基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明獲得約1500bp的條帶。切下該目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說(shuō)明書(shū)將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，將獲得重組表達(dá)載體命名為pBS-#x5^K。對(duì)擴(kuò)增得到的fx5"A基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，獲得1500bp的條帶，該1500bp的核苷酸片段即為ifr5"Af，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。實(shí)施例2、Southernblot分析CTAB法提取小金海棠的DNA，取20嗎上述小金海棠的DNA用況oRI和S;/zI內(nèi)切酶消化，0.8%瓊脂糖凝膠40V電壓條件下電泳12h，利用上述實(shí)施例1獲得的ifeS^^基因開(kāi)放閱讀框cDNA作為探針進(jìn)行雜交分析。雜交、洗膜和顯色均按照Roche公司的DIGHighPrimeDNA/RNALabelingandDetectionStarterKitI的步驟進(jìn)行。雜交結(jié)果如圖5所示，其中，S為I酶切后的Southernblot結(jié)果，E為況oRI酶切后的Southernblot結(jié)果。結(jié)果表明，兩種單酶切產(chǎn)物均有單一的雜交信號(hào)，表明小金海棠基因組中存在ifc5^/5"基因，并且該基因在小金海棠基因組中是單拷貝的。實(shí)施例3、缺鐵脅迫條件下小金海棠不同器官中ifr5^f基因的表達(dá)分析分別提取正常供鐵(鐵濃度為40nMFe-EDTA)及低鐵處理(鐵濃度為4iiMFe-EDTA)0、3、6和9天的小金海棠幼根、新葉(未展開(kāi)葉)和成熟葉的總RNA，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定不同器官、不同處理的RNA的含量，取等質(zhì)量的上述RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。以該單鏈cDNA為模板，先以肌動(dòng)蛋白(ACTIN)引物(序列表中序列10和序列11)進(jìn)行PC財(cái)廣增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，調(diào)整不同處理模板的用量，使各個(gè)處理ACTIN的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亮度一致。不同處理模板用量確定后，進(jìn)行ACTIN與ifeS^i/堪因的擴(kuò)增。每個(gè)處理的RT-PCR分析重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增i/x5^M5基因所用的引物對(duì)為MSF和MSR。結(jié)果表明，低鐵處理時(shí)，ifcS^/5基因在小金海棠的根和葉片中均有表達(dá)，具體結(jié)果如圖6所示。其中，a為低鐵處理時(shí)，ifcS4i/堪因在新葉中的表達(dá)情況，b為低鐵處理時(shí)，必「5^MS基因在成熟葉中的表達(dá)情況，c為低鐵處理時(shí)，ifxS4J/堪因在根中的表達(dá)情況。其中，i/x6^l/5基因在根部的表達(dá)最強(qiáng)，表達(dá)量依次為根〉成熟葉〉新葉；并且根、新葉和成熟葉中的ifr^J/5均受缺鐵脅迫誘導(dǎo)，隨著缺鐵時(shí)間的延長(zhǎng)，ife^J/5基因的表達(dá)量也逐漸增強(qiáng)，但是表達(dá)增強(qiáng)的幅度有所不同，其中，新葉受缺鐵誘導(dǎo)加強(qiáng)表達(dá)的幅度最大。實(shí)施例4、ifcS^fi"基因轉(zhuǎn)化擬南芥一、35S::ife5^/5"正、反義重組表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中用MSF和MSR擴(kuò)增的Ix5^i/5"基因全長(zhǎng)連接到pBS-T載體上，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒酶切后鑒定ifeS^^基因的插入方向。重組質(zhì)粒在多克隆位點(diǎn)存在一個(gè)//Zm/in酶切位點(diǎn)，在基因內(nèi)距離起始密碼子ATG約450bp處也有一個(gè)/z/"cnn酶切位點(diǎn)，因此/^'mnn酶切后若切出450bP大小的條帶則為正向插入的重組質(zhì)粒；若酶切后出現(xiàn)750bp大小的片段則為反向插入的重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒pCAMBIA1301(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司)禾卩P麗101(張志云，張虎生，孫毅，梁愛(ài)華.雙價(jià)抗蟲(chóng)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(8):1402-1408)分別用fcoyI和ffi/7oin進(jìn)行雙酶切，連接P麗101酶切后的小片段和pC層BIA3301酶切后的大片段，即得到重組表達(dá)載體pCW-1301。將鑒定好方向的正向和反向重組質(zhì)粒用尸^1和Awl雙酶切后分別和植物表達(dá)載體pCW-1301連接，將正向重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCW-1301連接后構(gòu)建的重組表達(dá)載體命名為pCW-35sifxWJ/5"，將反向重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCW-1301連接后構(gòu)建的重組表達(dá)載體命名為pCW-anti#x5^#5"。對(duì)重組表達(dá)載體pCW-35sfx5^/5"和pCW-antii/x5^5"分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，分別用引物MSF和MSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，尸"I和^wl酶切PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，具體結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組表達(dá)載體pCW-35sifxS^W的PCR結(jié)果，2為重組表達(dá)載體pCW-anti必「5^iff的PCR結(jié)果；圖8中，M為15000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組表達(dá)載體pCW-35sifc^ifi"的酶切結(jié)果，2為重組表達(dá)載體pCW-anti;l/x5^i^的酶切結(jié)果。結(jié)果表明，pCW-35sifx5^iff和pCW-antiifc5^i^分別為含有i/x5^/5"基因的正義和反義重組表達(dá)載體。利用凍融法將含有#^#5基因的正、反義重組表達(dá)載體pCW-35sifcS4i/滯口pCW-antii/x6^if5導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取陽(yáng)性克隆，用引物MSF和MSR進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖9所示。其中，M為10000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，CK為未轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌GV3101，3為pCW-35sMx&4MS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后的PCR結(jié)果，4為pCW-antiMx&4MS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后的PCR結(jié)果。結(jié)果表明，植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。二、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥當(dāng)擬南芥植株長(zhǎng)至莖高3cm時(shí)，去除其頂生花序，以刺激葉生花序的生長(zhǎng)。打頂5-7d后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)葉生花序已長(zhǎng)出，其下部的花已經(jīng)有花粉的出現(xiàn)。轉(zhuǎn)化前一天要澆透水，剪掉角果和已開(kāi)的花。分別將含有上述步驟一正義重組表達(dá)載體pCW-35sifc5^^和反義重組表達(dá)載體pCW-anti必5A的農(nóng)桿菌接種于5mlYEB(含卡那霉素和利福平)液體培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)24-36h，以1:50的比例轉(zhuǎn)接到200mlYEB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD,值為1.2-1.6時(shí)6000rpm離心15min收集菌體，沉淀用適量滲透培養(yǎng)基(蔗糖5%，SilwetL-770.02%)充分懸浮至OD,值為0.6-0.8。將上述根癌農(nóng)桿菌懸浮液倒在小燒杯中，將擬南芥的花浸入懸浮液中3-5min，保證蓮座葉以上部分浸于懸浮液中，浸泡5min，可見(jiàn)植株上有一層薄膜。將浸泡好的擬南芥植株取出，避光橫放16-24h，然后將其放正，綁住松散花芽。培育至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子(L代轉(zhuǎn)基因種子)。三、轉(zhuǎn)基因純合體的篩選及Northernblot雜交檢測(cè)將收獲的Ti代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于含30mg/L潮霉素、50mg/L氨節(jié)青霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4。C春化2-3天，然后轉(zhuǎn)至22。C培養(yǎng)。篩選真葉健康、根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中的植株為陽(yáng)性植株。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA并以其為模板，以MSF和MSR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖10所示。其中，M為1200bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-6為轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體pCW-35s#x5^f的轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗的PCR檢測(cè)結(jié)果，7-12為轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體pCW-anti^^S4Jff的轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗的PCR檢測(cè)結(jié)果，CK+為重組表達(dá)載體pCW-35s#xS^W的PCR結(jié)果，CK_為以雙蒸水為模板的PCR結(jié)果。結(jié)果共獲得轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體的L代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株59株，獲得轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的L代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株15株。將PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的植株單株收種，得到T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，L代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子再經(jīng)過(guò)相同的篩選，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3:1分離比的轉(zhuǎn)基因植株單株收種得到T3代轉(zhuǎn)基因種子，T3代轉(zhuǎn)基因種子單株在篩選培養(yǎng)基上不發(fā)生分離的視為插入含有#^5^^基因的正、反義重組表達(dá)載體的純合株系。結(jié)果共獲得轉(zhuǎn)入含有J&S4M9基因正義重組表達(dá)載體的純合株系18株，獲得轉(zhuǎn)入含有必^4MS"基因反義重組表達(dá)載體的純合株系5株。隨機(jī)選取6株轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥col-O的總RNA，1.2%甲醛瓊脂糖凝膠電泳后，在20XSSC中轉(zhuǎn)膜。利用上述實(shí)施例1獲得的^xS4J^基因開(kāi)放閱讀框cDNA作為探針，ifr6^"特異探針用dig-UTP標(biāo)記，雜交和洗膜方法參見(jiàn)北京美萊博地高辛雜交檢測(cè)試劑盒II，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)用CDpstar進(jìn)行，X光膠片顯影。結(jié)果如圖ll所示。其中，1-6分別為轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的Northernblot雜交結(jié)果，WT為野生型擬南芥的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的Northemblot雜交結(jié)果。結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因株系中臉6^/5"基因的表達(dá)水平有所不同，其中2tt、3tt和6tt株系ife5^/5"基因的表達(dá)水平較高。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因擬南芥耐缺鐵的功能研究一、轉(zhuǎn)基因擬南芥在缺鐵培養(yǎng)基、低鐵培養(yǎng)基和正常供鐵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的表型觀察選取上述實(shí)施例4獲得的JfcAW基因表達(dá)最強(qiáng)的211、3tt和6tt轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，同時(shí)以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)入空載體pCW-1301的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子為對(duì)照，在1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周后，移入缺鐵培養(yǎng)基(OuMFe-EDTA+300uMferrozine鐵螯合劑)、低鐵培養(yǎng)基(4uMFe-EDTA)和正常供鐵培養(yǎng)基(40uMFe-EDTA)中進(jìn)行培養(yǎng)并觀察表型。2周后可以明顯看到，在缺鐵培養(yǎng)基和低鐵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體和空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥以及野生型擬南芥均出現(xiàn)了葉片黃化現(xiàn)象，而且，轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的擬南芥黃化現(xiàn)象更為嚴(yán)重，同時(shí)還伴有根系稀疏、植株弱小等現(xiàn)象。具體的表型鑒定結(jié)果如圖12所示。其中，圖12D表示轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定結(jié)果，圖12B表示轉(zhuǎn)入空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定結(jié)果，圖12C表示野生型擬南芥的表型鑒定結(jié)果。而轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥在缺鐵培養(yǎng)基和低鐵培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)正常，根系明顯發(fā)達(dá)，側(cè)根增多、增長(zhǎng)，并且植株生長(zhǎng)量增大，葉片更肥厚，表現(xiàn)出比對(duì)照株更耐缺鐵的特性。具體的表型鑒定結(jié)果如圖12A所示。說(shuō)明Mx&4MS基因在鐵的代謝過(guò)程中起到重要的作用。而在正常供鐵培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體、反義重組表達(dá)載體和空載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥以及野生型擬南芥均生長(zhǎng)正常且一致。二、轉(zhuǎn)基因擬南芥中金屬離子含量的測(cè)定選取上述實(shí)施例4獲得的J/x5^ff基因表達(dá)最強(qiáng)的2tt、3ft和6#轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，同時(shí)以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)入空載體pCW-1301的轉(zhuǎn)基因擬南芥為對(duì)照，在1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周后，分別移入缺鐵培養(yǎng)基、低鐵培養(yǎng)基和正常供鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，截取上述擬南芥的幼葉和根，經(jīng)過(guò)灰化處理后用原子吸收法測(cè)定其中的Fe、Mn、Cu和Zn的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入正義重組表達(dá)載體的擬南芥在不同濃度鐵處理情況下，根和葉中的Fe、Mn、Cu、Zn的含量總是高于對(duì)照及轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的擬南芥植株，且葉中金屬含量的提高尤為明顯；根中各種金屬含量總是明顯高于地上部，但是不同株系之間根中金屬含量并無(wú)明顯差異；轉(zhuǎn)入反義重組表達(dá)載體的擬南芥中除了Mn的含量比對(duì)照有所降低外，其它如Fe、Cu和Zn的含量與對(duì)照相比無(wú)明顯差異。序列表<160〉11〈210>1<211〉1176〈212〉腿<213〉蘋(píng)果屬小金海棠(Mfl/wsx/aq/7"e肌's)<400>1atggaagacaccttcctgtttacttcggagtccgtgaacgagggacaccccgataaactc60tgtgatcagatttctgatgcagttctcgacgcctgcctcgaacaagaccccgacagcaaa120gttgcctgcgagacttgcaccaagacgaacatggtcatggtcttcggagagattacaacc180acagccaaagtggactacgagaagattgtgcgcgatacctgccgtacaattggatttgtt240tcagacaatgttggtcttgatgctgacaactgcaaggtcttggttaacatcgagcaacag300agccctgatatcgcgcagggcgtccatggccacttgaccaagcggcctgaggagattggt360gcgggtgaccagggtcacatgtttggttatgcaactgatgagacccctgagcttatgcct420ctgagccatgttcttgccaccaagcttggtgcccgtctcactgaagttcggaagaacgga480accttgccgtggctgagacccgttggcaagacgcaagtcactgctgaatactacaatgac540catggcgctatggttccaatccgtgtccacacggttctcatttcaactcagcatgacgaa600actgttaccaacgatgagattgctgctgacctcaaagagcatgttatcaagcctgttgtt660cctgagaagtacctagacgagaagactattttccatcttaacccatcaggtcgatttgtc720attggtggacctcacggtgatgctggcctcactggccgaaagataatcattgacacctac780ggtggttggggagctcatggtggtggtgccttctccggcaaggaccctaccaaggtagac840aggagtggtgcctacattgttaggcaggctgctaagagcattgtcgccaatggccttgcc900cgcaggtgcatagtgcaggtctcgtatgccattggtgttcccgagccactatcagtgttc960gttgacagttatggcaccggaaagattcctgacaaggagattcttaaactagtaaaggag1020aactttgatttcaggcctgggatgattgcgattaacctcgatctcaagcggggcaggtac1080ttgaaaacggctgcttatggacacttcggtagggatgaccctgacttctcatgggaagtg1140gtgaagccattgaagtgggaaaagccccaagagtag1176<210>2<211>391<212〉PRT〈213>蘋(píng)果屬小金海棠(Afa/^x/ao力'"e"57;s0<400〉2MetGluAspThrPheLeuPheThrSerGluSerValAsnGluGlyHis151015ProAspLysLeuCysAspGinlieSerAspMaValLeuAspAlaCys202530LeuGluGinAspProAspSerLysValAlaCysGluThrCysThrLys354045ThrAsnMetValMetValPheGlyGlulieThrThrThrAlaLysVal505560AspTyrGluLyslieValArgAspThrCysArgThrlieGlyPheVal65707580SerAspAsnValGlyLeuAspAlaAspAsnCysLysValLeuValAsn859095lieGluGinGinSerProA印lieAlaGinGlyValHisGlyHisLeu100105110ThrLysArgProGluGlulieGlyAlaGlyAspGinGlyHisMetPhe115120125GlyTyrAlaThrAspGluThrProGluLeuMetProLeuSerHisVal130135140LeuAlaThrLysLeuGlyAlaArgLeuThrGluValArgLysAsnGly145150155160ThrLeuProTyrLeuArgProValGlyLysThrGinValThrAlaGlu165170175TyrTyrAsnAspHisGlyAlaMetValProlieArgValHisThrVal180185190LeulieSerThrGinHisAspGluThrValThrAsnAspGlulieAla195200205AlaAspLeuLysGluHisVallieLysProValValProGluLysTyr210215220LeuAspGluLysThrliePheHisLeuAsnProSerGlyArgPheVal225230235240lieGlyGlyProHisGlyAspAlaGlyLeuThrGlyArgLyslielie245250255lieAspThrTyrGlyGlyTyrGlyAlaHisGlyGlyGlyAlaPheSer260265270GlyLysAspProThrLysValAspArgSerGlyAlaTyrlieValArg275280285GinAlaAlaLysSerlieValAlaAsnGlyLeuAlaArgArgCyslie290295300ValGinValSerTyrAlalieGlyValProGluProLeuSerValPhe305310315320ValAspSerTyrGlyThrGlyLyslieProAspLysGlulieLeuLys325330335LeuValLysGluAsnPheAspPheArgProGlyMetlieAlalieAsn340345350LeuAspLeuLysArgGlyArgTyrLeuLysThrAlaAlaTyrGlyHis355360365PheGlyArgAspAspProAspPheSerTyrGluValValLysProLeu370375380LysTyrGluLysProGinGlu385390<210>3〈211>39<212>DNA<213〉人工序列<400>3aagcagtggtatcaacgcagagtggccattatggccggg39<210〉4<211>23<212〉腿〈213〉人工序列<400〉4catcgttggtaacagtttcgtea23<210〉5〈211〉23〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5tcgttggtaacagtttcgtcatg23〈210〉6<211>34<212>DNA<213>人工序列<■〉6tgaggagattggtgcgggtgaccagggtcacatg<210>7〈211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<400〉7atgaccatggcgctatggttccaatccgtgtcc3433〈210〉8<211>20<212〉薩<213>人工序列<400〉8acactgggaacaccctgaag20<210>9<211>20<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉9tccaaacatgccaaattgaa20〈210>10〈211〉22<212>DNA<213〉人工序列〈400〉10ctacaaagtcatcgtccagacat22<210〉11<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11tgggatgacatggagaagatt2權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐缺鐵相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因?yàn)槿缦耹)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1一1173位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子；4)與l)的基因具有95X以上的同源性且編碼編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCW-1301;所述pCW-1301是用&MI和歷/oin分別雙酶切pCAMBIA1301和PWM101，連接PWM101酶切后的小片段和pCAMBIA3301酶切后的大片段，即得到pCW-1301。6、擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)。7、一種培育耐缺鐵的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，得到耐缺鐵提高的轉(zhuǎn)基因植物。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述植物為雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種與植物耐缺鐵相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物耐缺鐵性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)入MxSAMS的擬南芥植株耐缺鐵性明顯提高，為進(jìn)一步研究植物體內(nèi)鐵元素運(yùn)輸利用機(jī)制提供理論依據(jù)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101307099SQ20081011645公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2008年7月10日優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日發(fā)明者瑾孔,張新忠,朱妍捷,李天忠,憶王,許雪峰,韓振海申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)