專利名稱：：一種定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒。
背景技術(shù)：
：近幾年發(fā)明的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍。與普通PCR相比，RQ-PCR除了能夠定量之外還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)通過在PCR反應(yīng)體系中加入探針或通過制作熔解曲線，使特異性增強(qiáng)、靈敏度提高；(2)擴(kuò)增過程中閉管操作，實(shí)時(shí)收集數(shù)據(jù)，降低了污染機(jī)會(huì)，減少假陽性結(jié)果；(3)無需電泳，縮短了操作時(shí)間；(4)通過定量?jī)?nèi)參基因來評(píng)價(jià)樣本質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果。基于TaqMan探針的RQ-PCR技術(shù)關(guān)鍵之處在于PCR反應(yīng)體系中除了上、下游引物外還加入了TaqMan探針，該探針的5'端和3'端分別標(biāo)有熒光報(bào)告基團(tuán)(如FAM或TET)和熒光淬滅基團(tuán)(如TAMRA)。PCR反應(yīng)前，探針完整，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被熒光淬滅基團(tuán)淬滅；隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq酶發(fā)揮5'—3'的外切活性，使切下來的熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與初始模板DNA的量成正比，當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度大于閾值(基線以上IO個(gè)SD)時(shí)，即可被熒光探測(cè)器定期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每個(gè)樣本的CT值(PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))與起始模板量的對(duì)數(shù)值成正比，可以根據(jù)CT值利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出目的基因及內(nèi)參基因的量，二者相除的比值即為目的基因的相對(duì)水平。要計(jì)算出起始模板的量必須利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是采用經(jīng)過系列稀釋的已知起始量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RQ-PCR，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知質(zhì)量的cDNA或己知拷貝數(shù)的質(zhì)粒，前者制作比較簡(jiǎn)單，但是得到的未知樣品結(jié)果不直觀，較難理解；而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品盡管制備比較繁瑣，但是利用它可以計(jì)算出未知樣品的拷貝數(shù)，且結(jié)果直觀，是目前應(yīng)用最廣泛的標(biāo)準(zhǔn)品類型。內(nèi)參基因選擇的目的是為了消除不同樣本之間mRNA質(zhì)量、數(shù)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率等方面的差異，內(nèi)參基因的選擇有以下三大要求(1)在所有有核細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，與分化系列及分化階段無關(guān)，不受實(shí)處理的影響；(2)不存在假基因；(3)表達(dá)水平及降解水平與目的基因一致。因此，通過構(gòu)建ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)參基因的絕對(duì)定量，是實(shí)時(shí)定量PCR的前提和基礎(chǔ)，有利于檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和臨床推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒。本發(fā)明所提供的定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系；所述內(nèi)參基因優(yōu)選為ABL基因，以ABL基因作為內(nèi)參基因時(shí)，所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針，所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示。上述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中還包括熒光PCR的MasterMix。本發(fā)明中，上述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。上述定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。為了方便使用，上述定量檢測(cè)BCR/ABLmRNA水平的試劑盒還包括陰性對(duì)照質(zhì)粒。本發(fā)明的定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒具有以下特點(diǎn)1、覆蓋面廣可用于以ABL為內(nèi)參基因的多種白血病融合基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)中。2、敏感度高可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝。3、成本低實(shí)驗(yàn)體系僅為lO!Lll，各成分用量均減少一半以上，從而使成本明顯降低。4、實(shí)用性強(qiáng)本試劑盒同時(shí)包括內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，可定量出未知樣本的ABL拷貝數(shù)，有利于判斷樣本的RNA質(zhì)量和檢測(cè)敏感度。5、使用簡(jiǎn)便使用時(shí)只需加入待測(cè)樣品的cDNA即可開始PCR反應(yīng)。6、儲(chǔ)存期長-2(TC條件下可以長期保存(M.5年)，且不影響檢測(cè)效果。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定ABLmRNA水平。在各種白血病融合基因檢測(cè)中，可以ABL為內(nèi)參基因，用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行內(nèi)參基因的定量，以實(shí)現(xiàn)各種白血病融合基因的準(zhǔn)確、快速、定量，進(jìn)而準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行白血病的分子診斷和微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為臨床疾病確診、治療方案的確定、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。圖1為利用內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系擴(kuò)增1X106—1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施例方式如果兩種基因的PCR擴(kuò)增效率一致，那么分別利用它們的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線也是一樣的，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及縱截距與基因類型無關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)中在驗(yàn)證目的基因和內(nèi)參基因ABL的PCR擴(kuò)增效率一致后，即可采用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)定量目的基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，這樣不僅簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，更可以消除質(zhì)粒定量帶來的差異，提高RQ-PCR的準(zhǔn)確度。實(shí)施例1、定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒的制備一、定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒中引物和探針的設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR體系組成如下(1)上游引物(位于ABL外顯子2):5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，(序列表中序列1)，終濃度為0.3pM;(2)下游引物(位于ABL外顯子3):5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，(序列表中序列2)，終濃度為0.3pM;(3)TaqMan探針(位于ABL外顯子3):5，-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3'(序列表中序列3)，終濃度為0.2pM;(4)熒光PCR的MasterMix(購自美國ABI公司)。上述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。二、ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品包括1X1()6拷貝/VL、1X1()5拷貝/VL、1Xl()4拷貝/nL、IX103拷貝AtL和1X102拷貝/^iL五個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其具體制備方法如下依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品序列覆蓋并大于RQ-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的原則設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的引物，具體序列為上游引物5，-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3，，下游引物5'-GGACACAGGCCCATGGTAC-3，。提取正常人離體外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收、純化，將純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的ABL基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。其中，自5'末端第142位_第172位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物，自5'末端第210位一第237位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的TaqMan探針序列，自5，末端第245位一第265位為上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的下游引物。將上述測(cè)序結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒中提，并測(cè)定質(zhì)粒濃度、計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)、進(jìn)行10倍系列稀釋，最后分裝成lX106拷貝AiL、1X105拷貝AiL、1X104拷貝/liL、1X1()3拷貝/VL、lXl(f拷貝AiL、1X10'拷貝/VL，置一8(TC凍存?zhèn)溆谩Ｈ?、陰性?duì)照質(zhì)粒-WT1的制備提取1例已經(jīng)確診為急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成c腿，以該cDNA為模板，以5'-ccacagcacagggtacgaga-3，禾口5'-ctcagatgccgaccgtacaa-3，為引物PCR擴(kuò)增WT1基因。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收、純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，并轉(zhuǎn)染T0P10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，連接到pGEM-TEasy載體上的WT1基因的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示。得到的測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒即為陰性對(duì)照質(zhì)粒-WTl。四、使用方法所有待測(cè)樣品均需擴(kuò)增內(nèi)參基因ABL，計(jì)算ABL的拷貝數(shù)并確定待測(cè)樣品的質(zhì)量。具體使用方法如下1、取離體的待檢測(cè)病人骨髓或外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取其總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2、在9^iL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中加入lpL步驟l的待測(cè)樣品的cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，然后計(jì)算ABL的拷貝數(shù)并確定待測(cè)樣品的質(zhì)上述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的條件為先50。C2minl個(gè)循環(huán)；然后95°C10min1個(gè)循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin,40個(gè)循環(huán)。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中分別加入lpL上述步驟二制備的拷貝數(shù)為1X106、1X105、1X104、1X103及1X102五個(gè)濃度的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，先5(TC2min1個(gè)循環(huán)；然后95°C10min1個(gè)循環(huán)；再95。C15s，62°Clmin，40個(gè)循環(huán)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)做兩管平行管，其余各拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別擴(kuò)增一管。利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系擴(kuò)增1X106—1X102拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。4、每批RQ-PCR反應(yīng)還需同時(shí)擴(kuò)增陰性對(duì)照質(zhì)粒。在9pL上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中加入l|iL上述步驟三制備的WT1質(zhì)粒，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。本發(fā)明的定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒的儲(chǔ)存條件為4。C避光儲(chǔ)存至少2個(gè)月或-2(TC避光儲(chǔ)存1.5年。五、本發(fā)明的定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒的敏感度、特異性和穩(wěn)定性測(cè)1、敏感度可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝將按照上述步驟二的方法制備的5個(gè)拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各5份，分別利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果每次實(shí)驗(yàn)中均有擴(kuò)增曲線，因此本發(fā)明的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的可重復(fù)敏感度為5個(gè)拷貝。2、特異性因?yàn)槿祟愑泻说脑煅?xì)胞均含有ABL基因，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系檢測(cè)了不含ABL基因的WT1質(zhì)粒，未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，證實(shí)ABL檢測(cè)具有特異性。3、穩(wěn)定性以下穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)本均來自人民醫(yī)院，為自愿供體的離體骨髓單個(gè)核細(xì)胞。(l)日間差分析提取標(biāo)本G717的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行5批次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表所示，從表數(shù)據(jù)可知，日間差變異系數(shù)(CV)為1.83X。樣本編號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>(2)日內(nèi)差分析提取標(biāo)本H236的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板，利用上述步驟一的內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)，在同一批次進(jìn)行了5個(gè)平行孔的RQ-PCR反應(yīng)，結(jié)果如下表所示，從表中數(shù)據(jù)可知，日內(nèi)差變異系數(shù)(CV)為1.35%。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、以不同拷貝數(shù)的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為例檢測(cè)試劑盒的儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)1X103及1X10'拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品室溫避光儲(chǔ)存1周、4。C避光儲(chǔ)存3周、6周、9周及12周、-2(TC避光儲(chǔ)存18個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果用CT值表示，具體結(jié)果如下面兩表所示，從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間的變化，CT值無明顯變化，表明試劑盒仍很穩(wěn)定。103拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>107拷貝的ABL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不同儲(chǔ)存溫度及時(shí)間下的CT值變化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表〈160〉5〈210>1〈211〉31<212>腿<213〉人工序列<400>1tggsgata^c3ctcta3gc3t肌cta^aggt31〈210〉2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gatgtagttgcttgggaccca21〈210〉3〈211〉28<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3ccatttttggtttgggcttcacaccatt28〈210〉4〈211>316<212〉DNA<213>人工序列<400〉4ccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttg60gaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgc120actgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagct180ccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggcca240aggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggta300ccatgggcctgtgtcc316<210>5<211>151〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>5ccacagcacagggtacgagagcgataaccacacaacgcccatcctctgcggagcccaata60cagaatacacacgcacggtgtcttcagaggcattcaggatgtgcgacgtgtgcctggagt120agccccgactcttgtacggtcggcatctgag15權(quán)利要求1、一種定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒，包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系；所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中還包括熒光PCR的MasterMix。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系中的TaqMan探針的3'端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，5'端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有ABL基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陰性對(duì)照質(zhì)粒。全文摘要本發(fā)明公開了一種定量檢測(cè)ABLmRNA水平的試劑盒。該試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系。本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定ABLmRNA水平。在各種白血病融合基因檢測(cè)中，可以ABL為內(nèi)參基因，用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行內(nèi)參基因的定量，以實(shí)現(xiàn)各種白血病融合基因的準(zhǔn)確、快速、定量，進(jìn)而準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行白血病的分子診斷和微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為臨床疾病確診、治療方案的確定、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后提供重要的分子依據(jù)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101624623SQ20081011660公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者主鴻鵠,劉艷榮,秦亞溱申請(qǐng)人:秦亞溱;劉艷榮;主鴻鵠