專利名稱：A型流感病毒核蛋白捕獲elisa抗原診斷試劑盒及專用單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒及專用單克隆抗體。
背景技術(shù)：
禽流感的頻繁暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失；對流感病毒做出快速診 斷或早期診斷以及進行禽流感在養(yǎng)殖業(yè)禽類中的凈化，是控制該病的重要環(huán)節(jié)。A 型流感病毒亞型包括16個HA亞型和9個NA亞型，各亞型之間血凝素抗原差異較 大，針對HA進行亞型抗原診斷有一定難度。而核蛋白(NP)蛋白在A型流感病毒 各亞型之間變異程度很低，具有良好的保守性，可以作為A型特異性抗原對A型流 感病毒進行診斷。
目前應(yīng)用于AIV病原診斷的方法主要有病毒分離、血凝和血凝抑制試驗、瓊脂 擴散試驗和RT—PCR等。病毒分離和RT—PCR方法是目前最為常用的兩種方法，但 病毒分離法耗時較長，不易作為快速診斷；RT—PCR方法，雖然用時較短，但成本 較高，不易作為大規(guī)模調(diào)查。血凝和血凝抑制試驗，又需要在病毒分離的基礎(chǔ)上， 在基層又難以實現(xiàn)和推廣，不宜用來進行大規(guī)模的樣品檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒及專用單 克隆抗體。該試劑盒可用于對臨床采集拭子或病毒尿囊液進行流感病毒核蛋白檢
本發(fā)明所提供的抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體，是由對A型流感病毒NP 蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4 (CGMCCNo.2575)分泌產(chǎn)生的，對A型流感病毒NP蛋白雜交 瘤細(xì)胞株C4已于2008年7月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 編100101)，保藏編號為CGMCC No. 2575。
保藏號為CGMCC No. 2575的對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4也屬于本 發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑。
本發(fā)明所提供的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒，包括已包被 所述的抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體的固體載體和酶標(biāo)記的所述的抗A型禽 流感病毒核蛋白單克隆抗體。所述酶具體可為辣根過氧化物酶。
其中，為了便于檢測，所述試劑盒中還包括陰性和陽性對照。所述陽性對照為 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組禽流感病毒核蛋白或所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)表達(dá)的重組禽流感病毒核蛋白溶液；所述陰性對照為未感染禽流感病毒的SPF雞 胚尿囊液或其稀釋液。所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組禽流感病毒核蛋白溶 液中，所述重組禽流感病毒核蛋白的濃度為15ug/ml;所述未感染禽流感病毒的SPF 雞胚尿囊液的稀釋液是將所述雞胚尿囊液稀釋40倍得到的。
本發(fā)明的抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體效價和特異性高。本發(fā)明的A型 流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒，能敏感而特異地從臨床采集的拭子和 雞胚繁殖的尿囊液中檢測到A型流感病毒核蛋白抗原。操作簡單，敏感性高，特異 性強。可用于A型流感病毒臨床檢測和實驗室檢測，具有很高的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
實施例1、對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4 CGMCC No. 2575分泌的單 克隆抗體
1)制備抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體
a. 動物免疫
將用甲醛滅活的H9N2亞型禽流感病毒注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，使其產(chǎn)生多克 隆抗體血清。
b. 細(xì)胞融合和克隆化
小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7: 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融 合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔 進行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株，將該抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為對A型流感病毒 NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4，該細(xì)胞株已于2008年7月4日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科 學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.2575。
c. 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
將抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1X 109個 /ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37t:水浴中速 融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ral/只，7天后腹腔注射抗禽流感病毒 核蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株106個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸 銨法進行腹水純化，得到單克隆抗體，-2(TC保存。
實施例2、 A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒 一、A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒的組成 A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒其組成為1)已包抗A型禽流 感病毒核蛋白單克隆抗體的固體載體；2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗禽流感病毒核 蛋白的單克隆抗體；3)酶的底物存儲液；4)陰性對照和陽性對照；5)酶聯(lián)物及 標(biāo)本的稀釋液；6)洗滌液；7)酶反應(yīng)終止液。
1) 已包被抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體的固體載體的制備 用包被緩沖液將對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4 CGMCC No. 2575分泌
的單克隆抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1.5" g/mL，在每個96孔EIA高效結(jié)合酶標(biāo)板(美 萊博公司)的反應(yīng)孔中加0.1ml， 37'C放置2h后4r過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液， 用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘，然后再每孔中加入15(^1封閉液，37°。溫育2h， 傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
其中，包被液Na2C03 1.59g， NaHC03 2.93g，加蒸餾水至1L， 121。C高壓滅菌 30min， 4。C保存；洗滌液NaCl 80. 0g， KC1 2. 0g， Na2HP04 12H20 2. 9g， KH2P04 2 . 0g， 去離子水10L， pH值調(diào)至7. 3, 121。C高壓滅菌30min，加入0. 05%Tween 20;封閉 液明膠(Sigma公司進口分裝)l.Og加入lOOmL包被液，配成1%工作濃度。
2) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體
將對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4 CGMCC No. 2575分泌的單克隆抗體 與辣根過氧化物酶(HRP)采用過碘酸鹽氧化法進行偶聯(lián)。
3) 酶的底物存儲液
辣根過氧化物酶的底物為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(Serva公司)，3, 3, 5, 5-四 甲基聯(lián)苯胺溶于二甲亞砜配制成3， 3， 5， 5-四甲基聯(lián)苯胺濃度為10mg/ml的酶的底 物存儲液。
4) 陰性對照和陽性對照
陽性對照經(jīng)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的禽流感病毒重組核蛋白(購自
AnaSpec, Inc.目錄號為61024)，蛋白濃度600Pg/mL，使用時稀釋到15Pg/mL。 陰性對照未感染禽流感病毒的SPF雞胚尿囊液，使用時1:40稀釋。
5) 酶聯(lián)物及標(biāo)本的稀釋液
明膠(Sigma公司進口分裝)0. lg加入lOOmL包被液，配成O. 1%工作濃度。
6) 洗滌液
NaC180.0g， KCl 2. Og， Na2HP04 12H20 2. 9g， KH2P04 2. Og，去離子水IOL， pH 值調(diào)至7. 3， 121。C高壓滅菌30min，加入0. 05%Tween 20。
7) 酶反應(yīng)終止液
H2S04 (96%) 22. 2mL，蒸餾水177. 8mL， 4。C保存。
二、 A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒的使用方法
1) 待檢樣品裂解物
取待檢的拭子或尿囊液，按4:1比例加入裂解液，4'C裂解18h，得到待檢樣品 裂解物。其中，裂解液Tris*堿O. 303g， Triton-100 25nL， KC1 0. 223g，加PBS (pH7. 5)至5mL。
2) 加入待檢樣品裂解物
將待檢樣品裂解物加入已包被抗A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體的反應(yīng)板 中，100uL/孔，同時每板設(shè)陰陽性抗原對照，各兩孔，37"C作用1.5h。
3) 洗板 洗滌液洗板3次，每次3min。
4) 加入酶標(biāo)抗體 反應(yīng)板的每孔加入1:1000稀釋的酶標(biāo)抗體，37。C作用lh。
5) 洗板
洗滌液洗板3次，每次3min。
6) 加入底物溶液
加入新鮮配置的底物溶液，100ul/孔，37。C避光作用15min;
其中底物溶液為底物緩沖液10mL，酶的底物存儲液100yL， 30% H202 10 yL， 現(xiàn)用現(xiàn)配；底物緩沖液0. lmol/L檸檬酸(21.0g/L) 24. 3mL， 0. 2mol/L Na2HP04 12H20 (71.6g/L) 25. 7mL，蒸餾水50mL， 4。C保存。 7) 終止反應(yīng)
加入終止液終止反應(yīng)，50uL/孔。
8) 讀數(shù) 讀取450nm的光吸收值。
9) 結(jié)果判定
將12份空白尿囊液分別加入封閉后的酶標(biāo)板中，每個樣品設(shè)一個重復(fù)對照孔， 加入1:1000稀釋的酶標(biāo)抗體，之后將配好的底物溶液加入酶標(biāo)板，終止反應(yīng)后， 在酶標(biāo)儀上讀取0D45。nm的光吸收值。
結(jié)果表明陽性對照的濃度達(dá)到15ug/mL，陰性對照1:40稀釋時，陽性對照OD 值接近1. 000， 二者的比值最大，說明它們可以作為A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA 抗原診斷試劑盒的對照。
然后按公式陰陽臨界值二OD平均值+3X標(biāo)準(zhǔn)差(3SD)計算得出臨界值為0. 092。 待檢樣品的OD值大于0. 092判為陽性，OD值小于0. 092判為陰性。
實施例3、使用實施例2的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒檢 測A型流感病毒核蛋白抗原
1)特異性的測定
為了驗證本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒的特異性， 使用實施例2的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒對13株A型流感 病毒(均稀釋到2°狀單位)進行檢測，同時設(shè)新城疫病毒(NDV) (Wei HL， Bai GR， A. S. Mweene, Zhou YC， Cong YL， Pu J， Wang S， Kida H, Liu JH. Rapid detection of avian influenza virus A and subtype H5N1 by single step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction. Virus Genes 2006， 32(3) 261-267.)
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))作交叉反應(yīng)驗證(表1) 。 13株A型流感病毒分別為Ck/BJ/l/95、 Ck/HB/l/96、 Ck/BJ/2/97、 Ck/GD/97、 Ck/HB/2/98、 Ck/HB/3/98、 Ck/SD/98、 Ck/HN/98、 Ck/BJ/3/99、Ck/LN/99、Ck/BJ/l/00、 Ck/HB/1/01和Ck/SD/l/02。 (LiuJH， Okazaki K， 0zaki H， Sakoda Y， Wu QM， Chen FY, Kida H. H9N2 influenza viruses prevalent in poultry in China are phylogenetically distinct from A/quail/Hong Kong/Gl/97 presumed to be the donor of the internal protein genes of the H5N1 Hong Kong/97 virus. Avian Pathology 2003， 32: 551-560; Liu JH， Okazaki K， Mweene A, Shi WM， Wu QM， Su幾，Zhang GZ， Bai GR， Kida H. Genetic
conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China. Virus Genes. 2004， 29(3): 329-334.)(中國 農(nóng)業(yè)大學(xué))
表1特異性測定
Ck/BJ/1/952. 199Ck/HB/1/962.647
Ck/BJ/2/970. 284Ck/GD/972. 570
Ck/HB/2/982. 758Ck/HB/3/982. 805
Ck/SD/982,749Ck/HN/982. 741
Ck/BJ/3/992. 702Ck/LN/991. 426
Ck/BJ/1/002. 764Ck/HB/1/012.686
Ck/SD/1/022. 840陽性對照2, 766
陰性對照0. 049麗0. 058
實驗結(jié)果表明，檢測(不同亞型)A型流感病毒的0D450值在0. 284與2. 840 之間，與NDV不發(fā)生交叉反應(yīng)(0D450=0.058)，顯示了良好的特異性。
2、敏感性的測定
為了驗證本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒的敏感性， 選擇HI (PR8 / 34) 、 H3 (Dk/Ukraine/63) 、 H4 (Dk/Czech/56) 、 H5 (Dk/HK/820/80)、 H7 (Dk/服/301/78)和H9 (Tk/WI/1/66)(世界衛(wèi)生組織動物流感監(jiān)測網(wǎng))(中國 農(nóng)業(yè)大學(xué))；六種不同亞型A型流感病毒，2倍倍比稀釋后進行檢測，確定本發(fā)明 方法的最低檢出量。
Hl、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亞型流感病毒檢測的實驗方法相同，具體步驟如下
1) 待檢樣品裂解物
分別取H1、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亞型流感病毒尿囊液，按4:1比例加入裂解 液，4。C裂解18h，得到樣品裂解物。其中，裂解液Tris'堿0.303g， Triton-100 25ML， KC1 0.223g，加PBS (pH7. 5)至5mL。
2) 加入樣品裂解物
分別將H1、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9亞型流感病毒尿囊液裂解物作2倍倍比稀釋， 得到22-2—3HA單位的裂解物稀釋液，然后使用本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲 ELISA抗原診斷試劑盒檢測不同稀釋度的裂解物。Hl、 H3、 H4、 H5、 H7、 H9六種亞 型A型流感病毒的0D450值如表2。
_表2.敏感性測定_
HA單位4_^_^_0. 5 0. 25 0. 125
Hl 1.635 0.815 0.697 0.379 0.203 0.097
H31.1220. 7460. 4580. 2200. 1280. 085
H41.9541. 4781. 1090. 6250. 3060. 100
H51.8221. 2770. 7230. 4050. 1470. 085
H71.4040. 8670. 5450. 2760. 1850. 077
H91.5400. 7360. 4790. 2860. 1420. 080
實驗結(jié)果表明本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒檢測此 6個亞型流感病毒均可檢測到2—2個HA單位，說明該試劑盒具有較好的敏感性。 3、與病毒分離法比較本發(fā)明的試劑盒的符合率
為了驗證本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒與其他病毒 檢測方法相比的符合率，使用本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試 劑盒與病毒分離法(參見《哺乳動物、禽和蜜蜂A'B類疾病診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn) 手冊》，國際獸疫局編著，1996:136-137)對同一批144份臨床采集拭子進行檢測。
實驗結(jié)果表明，144份臨床釆集拭子中病毒分離方法檢測出8份陽性樣品，其 余136份為陰性樣品。在病毒分離方法檢測出的8份陽性樣品中，本發(fā)明的A型流 感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒檢出7份為陽性；144份臨床采集拭子中 本發(fā)明的A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒檢出137份為陰性。
權(quán)利要求
1、對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4，其保藏號為CGMCC No.2575。
2、 A型禽流感病毒核蛋白單克隆抗體，是由保藏號為CGMCC No. 2575的對A型流 感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4分泌產(chǎn)生的。
3、 A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒，包括已包被權(quán)利要求2所述 的單克隆抗體的固體載體和酶標(biāo)記的權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述酶為辣根過氧化物酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括陰性 和陽性對照。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照為昆蟲桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組禽流感病毒核蛋白或所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組禽 流感病毒核蛋白溶液；所述陰性對照為未感染禽流感病毒的SPF雞胚尿囊液或其稀釋 液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)的重組禽流感病毒核蛋白溶液中，所述重組禽流感病毒核蛋白的濃度為15ug/ml; 所述未感染禽流感病毒的SPF雞胚尿囊液的稀釋液是將所述雞胚尿囊液稀釋40倍得 到的。
8、 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備A型流感病毒核蛋白ELISA診斷試劑盒 中的應(yīng)用。
9、 權(quán)利要求3所述試劑盒在A型流感病毒核蛋白檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種A型流感病毒核蛋白捕獲ELISA抗原診斷試劑盒及專用單克隆抗體。該抗A型禽流感病毒核蛋白特異性單克隆抗體，是由保藏號為CGMCC No.2575的對A型流感病毒NP蛋白雜交瘤細(xì)胞株C4分泌產(chǎn)生的。該試劑盒，包括已包被所述的單克隆抗體的固體載體和酶標(biāo)記的所述的單克隆抗體。本發(fā)明的抗A型禽流感病毒核蛋白特異性單克隆抗體效價和特異性高。所述的試劑盒操作簡單，敏感性高，特異性強，可用于A型流感病毒臨床檢測和實驗室檢測，具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N5/20GK101348777SQ20081011722
公開日2009年1月21日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者劉芹防, 劉金華, 娟 蒲, 閻春梅, 馬廣鵬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)