專利名稱：新型中性植酸酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型中性植酸酶，特別涉及來編碼該中性植酸酶的基因序列。
背景技術：
植酸酶是一種可以將植酸水解為肌醇和磷酸的酶類。詞料中添加植酸酶后可將植酸 和植酸鹽水解成肌醇和磷酸鹽，供動物吸收利用，從而提高磷的利用率和骨骼礦化程度， 可節(jié)約磷資源、降低飼料成本。但天然來源的植酸酶含量太低而難以大量提取生產(chǎn)。
因此，找到一種新型的植酸酶，并通過基因工程手段克隆該植酸酶基因，然后在生 物反應器中高效表達植酸酶基因，可以使植酸酶的制備產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的植酸酶基因，將該基因克隆并表達后，可以得到一種 新型的中性植酸酶，該酶可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并具有較高的比活力。
本發(fā)明提供了一種新的中性植酸酶基因本發(fā)明篩選出含有胞外分泌植酸酶的檸檬
酸桿菌(Citrobactersp.)，并從該擰檬酸桿菌基因組中PCR得到一個中性植酸酶基因 phyA;將該基因克隆到表達載體pPIC9K，轉化到酵母菌GS115中。用甲醇誘導植酸酶 的表達，通過鎳柱親和純化帶有His Tag的植酸酶。通過SDS-PAGE驗證植酸酶純化情況。
對上述植酸酶進行了性質的測定通過不同溫度和不同pH值的處理，得到該酶的 最適溫度和最適pH值等性質。
經(jīng)測定，本發(fā)明得到的新的植酸酶比活力約為1000U/mg。
本發(fā)明提供的新的中性植酸酶基因，具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
SEQ ID N0:1所編碼的植酸酶蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列或其衍生序列。
3所述氨基酸序列的衍生序列包括以下情況
(f) 將SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有植酸酶功能的多肽；
(g) 將SEQIDNO:l所示的核酸分子的簡明序列所編碼的多肽；
(h) 在嚴謹條件下與SEQ ID NO:l所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸所編碼的具有植酸酶活性的多肽；
(i) 由SEQ ID N0:1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具有植酸酶活性的多肽；或
(j)與SEQ ID N0:2所示的多肽序列具有至少70%同源性的具有植酸酶活性的多肽，優(yōu)選75%， 80%， 85%， 90%或95%，特別是99%的同源性。
通過基因工程手段，如人工合成或其它方式克隆該植酸酶基因，然后在生物反應器中高效表達，可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有較高酶活性的中性植酸酶。


圖l:中性植酸酶PHYA的最適pH結果。圖2: pPIC9K-phyA的質粒圖譜序列信息
編碼檸檬酸桿菌的中性植酸酶成熟蛋白質的DNA序列SEQIDNO: 1;檸檬酸桿菌的中性植酸酶成熟蛋白質的氨基酸序列SEQIDNO: 具體實施例方式
以下實施例中所用的材料和試劑來源如下
1. 菌株與載體大腸桿菌菌株E. coli BL21(DE3)購自Novagen公司，載體由本
研究構建并保存。巴斯德畢氏酵母GS115和表達載體pP工C9K購自invitrogen公司。
2. 酶與試劑盒限制性內切酶，連接酶，Taq酶為NEB公司產(chǎn)品?；蚪M提取試
劑盒為天根生化公司產(chǎn)品。
3. 生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成為ABI公司Cyclone DNA
合成儀。IPTG、 X-Gal、 SDS及植酸酶鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。NTA樹脂為Qiagen公司^z: 口
廣P卩o
4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl， pH7. 0)。巴斯德畢氏酵母養(yǎng)基為YPD (2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖)。
實施例1產(chǎn)植酸酶的檸檬酸桿菌的篩選
從新疆高溫照射環(huán)境中取得土壤進行微生物富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，成分為酵母粉0.5%、蛋白胨0.3%、 0.5%氯化鈉、pH為7。培養(yǎng)條件稱取適量土壤放入LB培養(yǎng)基，37°C， 200r/min，培養(yǎng)3-6天。每日吸取少量培養(yǎng)液進行梯度稀釋(10-2一IO-IO)，涂布于含有植酸鈉的固體培養(yǎng)基中,37'C培養(yǎng)2-3天。固體培養(yǎng)基成分植酸鈉l%，NaN03 0.3%, MgS04 '7H20 0.5%,KC1 0.5%,K2HPO4 0.1%，F(xiàn)eSO4 '7H20 0.001%,瓊脂1%， pH6.0。若培養(yǎng)基中生長的菌落周圍出現(xiàn)了明顯的菌圈，則可初步判斷該菌能產(chǎn)生出植酸酶，選出培養(yǎng)基中產(chǎn)生最大菌圈的菌落。
實施例2檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)基因組的提取與鑒定
將選取的培養(yǎng)基中的菌，挑取單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液用于該菌的基因組DNA的提取。使用Tiangen公司的TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒，按公司提供的試劑盒操作說明書提取該菌的基因組DNA。為了鑒定菌屬，以基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增該菌株的16s rDNA序列。
設計細菌16SrDNA的引物F 27: 5'-agagtttgatcatggctcag-3'
R 1492: 5'陽tacggttaccttgttacgactt-3'
PCR產(chǎn)物長度約1. 4kb，測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中DNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與檸檬酸桿菌的16s rDNA基因序列相似性達98y。，因此，將該菌株在分類學上鑒定為檸檬酸桿菌。
實施例3檸檬酸桿菌基因組中植酸酶基因的克隆
從Genbank中的找到其他檸檬酸桿菌中關于植酸酶基因序列，設計簡并引物，如下:
phyA F (EcoR I): 5 '-GAATTCATGAGTACATTCATCATTC-3'
phyA R (Not I): 5'-GCGGCCGCTTATTCCGTAACTGCACAC-3'下劃線部分為EcoRI(上游引物F)和Notl(下游引物R)識別位點。
PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳后，觀察長度約為1.3Kb。運用T4 DNA連接酶連
5接到T-載體上(pMD18-T simple vector, Takara公司)。經(jīng)過測序，得到序列推導出的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
實施例4檸檬酸桿菌中植酸酶基因的酵母轉化及篩選表達
連接T-載體的植酸酶DNA片段經(jīng)過限制性核酸內切酶Notl和EcoRI消化，通過濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，將線性化的植酸酶基因切割下來，使用DNA回收試劑盒(Tiangen)回收線性化的植酸酶DNA;將載體質粒pPIC9K用限制性核酸內切酶Notl和EcoRI消化，運用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，將線性化的載體片段切割下來，使用DNA回收試劑盒(Tiangen)回收線性化的載體質粒片段pPIC9K。用T4DNA連接酶把兩段純化的DNA片段連接起來,轉化大腸桿菌JM109。之后提取質粒，使用限制性核酸內切酶Dral將質粒線性化。后懸浮于100u 1電轉感受態(tài)畢赤酵母GS115細胞中，將混懸液轉移到0. lcm的電穿孔杯(BioRad)中，使用Gene Pulser Xcell (BioRad)裝置，1800V、 25uF和200Q進行電激。電激后立即加入lml的lmol/L的山梨醇，隨后涂布與含組氨酸缺陷的MM培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)2天。PCR篩選含有phyA基因的轉化子。
將活化的pPIC9K-phyA菌液lml加入到100ml LB培養(yǎng)基中，37。C使菌液濃度達0D6。。=0. 6-0. 8時進行甲醇誘導。3CTC搖床(200rpm)用10ml/L的甲醇誘導，每12小時向培養(yǎng)基中添加一次甲醇，共誘導2天。由于植酸酶在酵母菌中的異源表達能有效地分泌到胞外，因此誘導后的菌液，經(jīng)離心得到上清即是植酸酶的粗酶液。
實施例5來自擰檬酸桿菌中重組植酸酶的純化
將用pPIC9K轉化的GS115的培養(yǎng)物進行離心去除細菌細胞，用Tris堿將粗酶液的上清pH調節(jié)到7. 9。將上清通過pH 7. 9平衡的Ni-NTA層析柱子，流速控制在15m1/小時左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質的結合情況。層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ral/小時左右。分別用5倍NTA體積的NTA-20， NTA-40， NTA-60， NTA-80, NTA-100, NTA-200Buffer洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。通過SDS-PAGE確定目標蛋白在洗脫液中的分布情況。將純化得到的植酸酶蛋白收集，低溫存放。
實施例6檸檬酸桿菌中異源表達的植酸酶酶活測定有目的植酸酶的收集管用與測定植酸酶酶活，酶活測定方法如下將上清用緩沖液(50mM Tris - HC1 , 2mM CaC12 ，10 %甘油，pH710)做適當稀釋后，取015ml酶液，力口入2ml 2mM的植酸鈉(100mM Tris - HC1 ， pH710 ， 012mM CaC12 ) ,37 。C保溫30min ，加入215ml 20 %TCA(w/ v)終止酶活反應，5000r/ min離心5min ,然后加入5ml硫酸亞鐵一鉬酸銨顯色液[(115 %鉬酸銨515 %硫酸)(217 °/。硫酸亞鐵)=4:1 ，v/v ] ， 5000r/ min離心5min , 700mM測定無機磷酸含量。對照為先在015ml的酶稀釋液中加入215ml 20 %TCA使酶失活，再加入同體積的底物保溫。酶活性單位(U)定義為在一定條件下,每分鐘釋放lnmol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位。
實施例7來自檸檬酸桿菌中重組植酸酶的最適pH
在實施例5中所述的緩沖液和條件下，研究檸檬酸桿菌中植酸酶(按照實施例6純化)的活性對pH的依賴性。所述酶在較廣范圍內都有活性，而在中性條件下6. 5-7. 5之間活性最大。
實施例8來自檸檬酸桿菌中重組植酸酶PHYA的比活
使用按照實施例6的純化制備物來評估PHYA植酸酶的比活。根據(jù)實施例5在pH7. 0測定的植酸酶活性，通過用BCA蛋白質測試試劑盒測量總蛋白質濃度并通過用SDS-PAGE估計的植酸酶含量對其進行校正計算該酶濃度。按照這些測量來自擰檬酸桿菌的重組植酸酶的比活力約為1000U/mg。
7序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所<120>新型中性植酸酶
<160> 2
< 170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)
<400〉 1
atgagtacat tcatcattcg tttattattt ttttctctct tatgcggttc tttctcaata 60
catgctgaag agcagaacgg tatgaaactt gagcgggttg tgatagtgag ccgccatgga 120
gtaagagcac ctacgaagtt cactccaata atgaaagatg tcacacccga tcaatggcca 180
caatgggatg tgccgttagg atggctaacg cctcgtgggg gagaacttgt ttctgaatta 240
ggtcagtatc aacgtttatg gttcacgagc aaaggtctgt tgaataatca aacgtgccca 300
tctccagggc aggttgctgt tattgcagac acggatcaac gcacccgtaa aacgggtgag 360
gcgtttctgg ctgggttagc accaaaatgt caaattcaag tgcattatca gaaggatgaa 420
gaaaaaactg atcctctttt taatccagta aaaatgggga catgttcgtt taacacattg 480
aaggttaaaa acgctattct ggaacgggcc ggaggaaata ttgaactgta tacccaacgc 540
tatcaatctt catttcggac cctggaaaat gttttaaatt tctcacaatc ggagacatgt 600
aagactacag aaaagtctac gaaatgcaca ttaccagagg ctttaccgtc tgaacttaag 660
gtaactcctg acaatgtatc attacctggt gcctggagcc tttcttccac gctgactgag 720
atatttctgt tgcaagaggc ccagggaatg ccacaggtag cctgggggcg tattacgggg 780
gaaaaagaat ggagagattt gttaagtctg cataacgctc agtttgatct tttgcaaaga 840actccagaag ttgcccgtag tagagccaca ccattactcg atatgataga cactgcatta 900
ttgacaaatg gtacaacaga aaacaggtat ggcataaaat tacccgtatc tctgttgttt 960
attgctggtc atgataccaa tcttgcaaat ttaagcgggg ctttagatct taactggtcg 1020
ctacccggtc aacccgataa tacccctcct ggtggggagc ttgtattcga aaagtggaaa 1080
agaaccagtg ataatacgga ttgggttcag gtttcatttg tttatcagac gctgagagat 1140
atgagggata tacaaccgtt gtegttagaa aaacctgccg gcaaagttga tttaaaatta 1200
attgcatgtg aagagaaaaa tagtcaggga atgtgttcgt taaaaagttt ttccaggctc 1260
attaaggaaa ttcgcgtgcc agagtgtgca gttacggaa 1299
<210> 2 <211> 433 <212> prt
<213> 檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.) <400> 2
MET Ser Thr Phe lie He Arg Leu Leu Phe Phe Ser Leu Leu Cys Gly
15 10 15
Ser Phe Ser lie His Ala Glu Glu Gin Asn Gly MET Lys Leu Glu Arg
20 25 30
Val Val He Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr
35 40 45
Pro lie MET Lys Asp Val Thr Pro Asp Gin Trp Pro Gin Trp Asp Val
50 55 60
Pro Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu 65 70 75 80
Gly Gin Tyr Gin Arg Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn
85 90 95
Gin Thr Cys Pro Ser Pro Gly Gin Val Ala Val He Ala Asp Thr Asp
100 105 110
Gin Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro
115 120 125
Lys Cys Gin lie Gin Val His Tyr Gin Lys Asp Glu Glu Lys Thr Asp
130 135 140
Pro Leu Phe Asn Pro Val Lys MET Gly Thr Cys Ser Phe Asn Thr Leu 145 150 155 160Lys Val Lys Asn Ala lie Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn lie Glu Leu
165 170 175
Tyr Thr Gin Arg Tyr Gin Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu
180 185 l卯
Asn Phe Ser Gin Ser Glu Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys
195 200 205
Cys Thr Leu Pro Glu Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp
210 215 220
Asn Val Ser Leu Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu 225 230 235 240
lie Phe Leu Leu Gin Glu Ala Gin Gly MET Pro Gin Val Ala Trp Gly
245 250 255
Arg lie Thr Gly Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn
260 265 270
Ala Gin Phe Asp Leu Leu Gin Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg
275 280 285
Ala Thr Pro Leu Leu Asp MET lie Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly
290 295 300
Thr Thr Glu Asn Arg Tyr Gly lie Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe 305 310 315 320
lie Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp
325 330 335
Leu Asn Trp Ser Leu Pro Gly Gin Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly
340 345 350
Glu Leu Val Phe Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp
355 360 365
Val Gin Val Ser Phe Val Tyr Gin Thr Leu Arg Asp MET Arg Asp He
370 375 380
Gin Pro Leu Ser Leu Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu 385 390 395 400
lie Ala Cys Glu Glu Lys Asn Ser Gin Gly MET Cys Ser Leu Lys Ser
405 410 415
Phe Ser Arg Leu lie Lys Glu lie Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr 420 425 430
Glu
10
權利要求
1.一種中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2、 一種由SEQ ID N0:1所編碼的中性植酸酶蛋白，具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列或其衍生序列。
3、 權利要求2所述的中性植酸酶蛋白，所述SEQ ID N0:2所示的氨基酸序 列或其衍生序列包括(a) 將SEQ ID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加而形成的具有中性植酸酶功能的多肽；(b) 將SEQIDN0:1所示的核酸的簡明序列所編碼的多肽；(c) 在嚴謹條件下與SEQ ID N0:1所示核酸分子的互補鏈雜交的核酸 所編碼的具有植酸酶活性的多肽；(d) 由SEQ ID N0:1所示核酸分子的等位基因或天然變體所編碼的具 有植酸酶活性的多肽；或(e) 與SEQ ID N0:2所示的多肽序列具有大于70%同源性的具有植酸 酶活性的多肽。
4、 權利要求3所述的中性植酸酶蛋白，所述多肽序列具有大于70%同源 性包括75%、 80%， 85%、卯％、 95%或99%的同源性。
5、 一種重組表達載體，其特征是含有SEQ ID N0:1所示序列的基因。
6、 權利要求5所述的載體，是pPIC9K-phyA。
7、 權利要求5或6所述的載體，其宿主細胞為GS115。
全文摘要
本發(fā)明從檸檬酸桿菌中得到了一種中性植酸酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。利用該基因可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有較高酶活性的中性植酸酶。
文檔編號C12N15/55GK101659957SQ20081011887
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月26日 優(yōu)先權日2008年8月26日
發(fā)明者平淑珍, 維 張, 敏 林, 燕永亮, 趙仲麟, 偉 陸, 明 陳, 鑫 馬 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所