專利名稱：香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該引物 對(duì)香菇Cr02菌種進(jìn)行鑒別和檢測(cè)的方法。
(二)
背景技術(shù)：
香菇(Ze"W,/a Wwfes (Berk.) Pegler)起源于亞洲和澳洲的溫帶-亞 熱帶地區(qū)。香菇以其營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療價(jià)值和獨(dú)特的口味而聞名全世界，特別是 在中國(guó)和其它的東南亞國(guó)家。中國(guó)是最早栽培香菇的國(guó)家，目前香菇產(chǎn)量 達(dá)到全世界的70%。香菇菌種是香菇生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料，目前在 中國(guó)商業(yè)栽培使用的香菇菌種已超過100余種。在香菇生產(chǎn)中， 一些具有 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培特性的香菇菌種通常在產(chǎn)業(yè)界被評(píng)價(jià)為優(yōu)良菌種，例如在生 產(chǎn)上一直栽培的Cr02、慶20、申8、香9菌種等。這些優(yōu)良菌種在中國(guó) 得到大面積栽培，甚至引種到了其他一些亞洲國(guó)家和地區(qū)如日本、韓國(guó)、 中國(guó)臺(tái)灣等，栽培者因此也獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。然而長(zhǎng)期以來，中國(guó) 香菇主產(chǎn)地的菌種生產(chǎn)、銷售一直較為混亂，"異種同名、同種異名，，現(xiàn)象 普遍存在，特別是一些優(yōu)良菌種頻繁被假冒而出現(xiàn)在菌種市場(chǎng)上，極大地 損害了香菇育種者和生產(chǎn)者的利益。因而對(duì)于香菇工業(yè)，建立一種簡(jiǎn)便、 快速、可靠的優(yōu)良菌種鑒定技術(shù)尤為迫切。
分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌種鑒定技術(shù)提供了有效手段。 一些基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨才幾擴(kuò) 增多態(tài)性DNA) 、 AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò) 增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)在上個(gè)世紀(jì)90年代已用于食用菌菌種的分類鑒定上， ^旦這些標(biāo)記用于香菇菌種的鑒定均不夠理想。SCAR (Sequence CharacterizedAmplified Region,特征性片段擴(kuò)增區(qū)域)標(biāo)記是1993年由 Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ)上提出的，它基于對(duì)特異RAPD片段 的測(cè)序，根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)18 24堿基的引物，在較高的退火溫度 下進(jìn)行特異擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的，其專一性引物的采用排除了隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)之 間的竟?fàn)帲蚨且环N十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡(jiǎn)便、 低成本的特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立香菇Cr02菌種的SCAR分子標(biāo)記，提供香菇Cr02 菌種的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種能對(duì)香菇Cr02菌種進(jìn)行快速鑒定 的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列為
上游引物5'-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3';
上游引物5'-CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3'。
該引物對(duì)是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗(yàn)，采用RAPD標(biāo)記為 引物獲得香菇Cr02菌種的特異性DNA片段，將該片段克隆測(cè)序，以得 到的DNA序列為基礎(chǔ)，所設(shè)計(jì)的特異性引物，以該引物對(duì)香菇Cr02菌 種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得1084bp大小的特異性片4殳。
本發(fā)明還涉及一種所述的分子特異性標(biāo)記引物對(duì)香菇Cr02菌種進(jìn)行 鑒定和檢測(cè)的方法，所述方法為提取待測(cè)香菇菌種基因組DNA作為模 板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增
產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)1084bp的DNA條帶，則待測(cè)菌種 為香菇Cr02菌種；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為 上游引物5'畫AGGCAAACTGGTTCCATGATA畫3'; 下游引物5'畫CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3'。 所述方法關(guān)4建在于擴(kuò)增引物的選擇，DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反 應(yīng)條件確定，以及電泳檢測(cè)，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系組成如下 PCR Buffer 終濃度為1 x
lmmol/L 2.5mmol/L
2.5U 各1.25 yM 60ng
dNTPs MgCl2 Taq DNA酶 上、下游引物 模板DNA 余量為ddH20; PCR反應(yīng)條件如下
94。C預(yù)變性6min后；92。C變性40s, 54.5。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30個(gè)循環(huán)；最后于72。C補(bǔ)平7min,終止溫度為4"C。
PCR Buffer終濃度為1 x ,是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的 濃度與1 x PCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10 x PCRBuffer。 10xPCR Buffer成分為100 mM Tris-HCl (pH8.5 )、 500 mM KC1、 25mMMgCl2和1.0%Triton-X-100，溶劑為ddH20。
具體的，本發(fā)明所述方法如下
(1)取待測(cè)香菇菌種，接種至PDA斜面，25。C培養(yǎng)14d,轉(zhuǎn)接至PD
液體培養(yǎng)基中，25。C下振蕩培養(yǎng)14d，收集菌絲，以SDS-CTAB
法提取待測(cè)香菇菌種基因組DNA; (2)以步驟(1 )提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)
記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系每20 ju L組成如下 10 xpCR Buffer 2/liL 10mmol/LdNTPs 2|aL 25mmol/L MgCl2 2 ju L
5U/ ju L Taq DNA酶 0.5 ju L 25jiM上、下游引物 各1 |iL 20ng/ ju L模板DNA 3 ju L
ddH20補(bǔ)足至20jaL; PCR反應(yīng)條件如下
94。C預(yù)變性6min后；92。C變性40s, 54.5。C退火40s, 72。C延伸2min， 共30個(gè)循環(huán)；最后于72。C補(bǔ)平7min,終止溫度為4°C;
(3 )取步驟(2 )擴(kuò)增產(chǎn)物5 ji L,與1 |u L 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻， 點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1 x TAB i爰沖液中、5V/cm電 壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，EB染色通常在含0.5(ag/ml EB 的水溶液中染色30分鐘。于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相，若電 泳結(jié)果出現(xiàn)1084bp的DNA條帶，則待測(cè)菌種為香菇Cr02菌種。
本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮 抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明方法 ^r測(cè)所需時(shí)間只要1 3天，而常M^的拮抗試^r所需要的時(shí)間至少兩周時(shí)
間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間。
(四)


圖l為對(duì)香菇菌種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；C為 陰性對(duì)照；箭頭所指為從編號(hào)為17的香菇Cr02菌種擴(kuò)增出的分子量為 1084bp的特殊DNA條帶；其余編號(hào)為其它常用的香菇生產(chǎn)菌種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍
并不僅限于此
實(shí)施例1:
(1 )菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接 到PDA斜面(PDA斜面培養(yǎng)基取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水 1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液加水補(bǔ)足至1000毫升， 加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，121。C滅菌30分鐘，冷卻得斜 面)上，25。C下培養(yǎng)。14d后接到100mlPD液體培養(yǎng)基(PD液體培養(yǎng)基 取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴 薯塊，將濾液加水補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，121。C滅菌30分鐘， 冷卻即得PD液體培養(yǎng)基)中，25。C下100r/min振蕩培養(yǎng)14d,收集菌絲， 放入-20。C水箱保藏備用。基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使 用DNA純化試劑盒(杭州博日科技有限公司)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。 純化的基因組DNA先用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳定性;險(xiǎn)測(cè)，再用 DNA/RNA紫外分光光度計(jì)定量檢測(cè)。DNA提取物于-20。C冰箱貯藏備用。
(2 )設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列為上游引物 5'-AGGCAAACTGGTTCCATGATA誦3'和下游引物5'-CTGTGAAGTCAT
TACAGTCGC-3'，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。
(3) SCAR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增10xPCRBuffer2^1, 10mmol/L dNTPs2p1, 25mmol/LMgCl22^d, 5U/pl Taq DNA酶0.5ial， 25mM特異引 物對(duì)各lpl, 20ng^l模板DNA3pl， ddH20補(bǔ)足至20ji1。擴(kuò)增反應(yīng)在TC-XP 型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。94。C預(yù)變性6min后；92。C變性40s， 54.5。C退火40s, 72°C 延伸2min,共30個(gè)循環(huán)；最后于72。C補(bǔ)平7min,終止溫度為4。C。
(4) 電泳檢測(cè)取步驟(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，與lul 0.25%溴酚 蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于lxTAB緩沖液中，5V/cm 電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含0.5pg/ml EB的水;容液中染色30分鐘， 然后在培清JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相。
按照上述方法，分別對(duì)多種香菇菌種(編號(hào)1 23代表香菇菌種依次 為1:申香2號(hào)；2:申香4號(hào)3:申香6號(hào)；4:申香9號(hào)；5:申香7 號(hào)；6:申香8號(hào)；7:申香10號(hào)；8:申香12; 9:蘇香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:慶-+20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:閩豐1號(hào)；20:滬農(nóng)1號(hào)；21:浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九)進(jìn)行^^測(cè)，以無菌水為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果見圖1。其中編號(hào) 17為香菇Cr02菌種，擴(kuò)增出分子量為1084bp的特殊DNA條帶，其余編 號(hào)為其他常用的香菇生產(chǎn)菌種，未見有1084bp的特殊DNA條帶產(chǎn)生。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110〉浙江省林業(yè)科學(xué)研究院
〈120〉香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物及檢測(cè)方法
<130>
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.4
〈210〉 1
<211> 21
〈212〉 DNA
<213> Unknown
<220>
<223〉人工序列 <■> 1
aggcaaactg gttccatgat a 21
<210> 2
〈211> 21
<212〉 DNA
<213> Unknown
<220〉
<223〉人工序列
<400> 2
ctgtgaagtc attacagtcg c 2權(quán)利要求
1.香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列為上游引物5′-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3′；下游引物5′-CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3′。
2. —種用權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物對(duì)香菇Cr02菌種進(jìn)行鑒定和抬r 測(cè)的方法，所述方法為提取待測(cè)香菇菌種基因組DNA作為模板，以所述分 子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)， 若電泳結(jié)果出現(xiàn)1084bp的DNA條帶，則待測(cè)菌種為香菇Cr02菌種；所述分 子特異性標(biāo)記引物序列為上游引物5'-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3'; 下游引物5 '-CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3'。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系組成如下 PCR Buffer 終濃度為1 xdNTPs lmmol/L MgCl2 2.5mmol/L TaqDNA酶 2.5U 上、下游引物 各1.25iaM 模板DNA 60ng 余量為ddH20; PCR反應(yīng)條件如下94"C預(yù)變性6min后；92'C變性40s， 54.5。C退火40s, 72。C延伸2min，共30 個(gè)循環(huán)；最后于72。C補(bǔ)平7min,終止溫度為4。C。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 取待測(cè)香菇菌種，接種至PDA斜面，25。C培養(yǎng)14d，轉(zhuǎn)接至PD液體培 養(yǎng)基中，25。C下振蕩培養(yǎng)14d，收集菌絲，以SDS-CTAB法提取待測(cè)香 菇菌種基因組DNA;(2) 以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作 為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系每20 n L組成如下 10 xPCR Buffer 2yL 10mmol/LdNTPs 2|uL 25mmol/L MgCl2 2 n L5U/ la L Taq DNA酶 0.5 ja L 25jaM上、下游引物 各1 jiL 20ng/ ju L模板DNA 3 ju LddH20補(bǔ)足至20 ja L; PCR反應(yīng)條件如下94。C預(yù)變性6min后；92。C變性40s, 54.5。C退火40s, 72。C延伸2min,共30 個(gè)循環(huán)；最后于72。C補(bǔ)平7min,終止溫度為4°C;(3 )取步驟(2 )擴(kuò)增產(chǎn)物5 |a L，與1 n L 0.25%溴盼蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于 1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1 x TAB緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳 結(jié)束后用EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn) 1084bp的DNA條帶，則待測(cè)菌種為香菇Cr02菌種。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述EB染色為在含0.5嗎/ml EB的水 溶液中染色30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種香菇Cr02菌種的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該引物對(duì)香菇Cr02菌種進(jìn)行鑒別和檢測(cè)的方法。所述引物序列為上游引物5′-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3′，下游引物5′-CTGTGAAGTCA T TACAGTCGC-3′。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明方法檢測(cè)所需時(shí)間只要1～3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需要的時(shí)間至少兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101358238SQ20081012031
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者付立忠, 吳學(xué)謙, 吳慶其, 李海波, 程俊文, 亮 賀, 魏海龍 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院