專利名稱：一種酪氨酸酶模擬酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種酪氨酸酶模擬酶的制備方法,屬于仿生催化技術領域。
背景技術：
酪氨酸酶，多酚氧化酶的一種，它廣泛存在于植物、動物、和微生物中。酪氨酸酶具 有加氧酶和脫氫酶兩種活性，能催化氧化酪氨酸生成二羥基苯丙氨酸。酶催化與普通化學 催化劑相比，具有高效性、專一性和反應條件溫和等優(yōu)點，而天然酶對環(huán)境過于敏感， 對操作條件要求苛刻，易失活，價格昂貴的缺點。
設計合成酪氨酸酶模型，要考慮的因素較多，關鍵在于配體的選擇。過去的研究中， 人們用吡啶基等來模擬酶活性中心的咪唑基，合成了一系列的酪氨酸酶模型物，較好地模 擬了酪氨酸酶的性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，而提供一種催化活性高，不會失活的
酪氨酸酶模擬酶的制備方法，它是A)將環(huán)糊精按質(zhì)量比l : 15 25加入干吡啶中溶解， 然后按環(huán)糊精與鄰-碘酰基苯甲酸的摩爾比為1:0.2 0.4逐滴加入間苯二磺酰氯；在 25 'C下反應1小時，停止反應，在低于25 'C條件下減壓蒸除吡啶，淺褐色殘余物在液 氮保護下在低于25 r下真空干燥，得到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比1 : 8 15溶于40%質(zhì)量百分 比濃度的乙醇水溶液中，濾去不溶物后按質(zhì)量比1 : 8 15逐滴加到83%質(zhì)量百分比濃度 的乙腈水溶液中，抽濾，除去白色沉淀，在30 'C下減壓蒸除溶劑，殘留物溶于適量20% 質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，攪拌l小時，在30 。C下蒸除溶劑，在20 3(TC下真 空干燥即得到6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì)量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯與碘 化鈉的質(zhì)量比為1 : 1 1.5加入碘化鈉，在60 90。C下攪拌反應2 45h，在4(TC下減壓 蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌、過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復 三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40 45'C下 真空千燥即得到雙碘代環(huán)糊精；C)將雙碘代環(huán)糊精按質(zhì)量比為1 : 10 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按雙碘代環(huán)糊精與組氨酸的質(zhì)量比為1:0.8 1.5加 入組氨酸，在80。C下反應24小時；將反應得到的懸濁液抽濾，收集濾液，在40。C下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗至丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙 酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精雙組氨酸衍生 物按質(zhì)量比為l:500 2000投入ra值為7 9的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán) 糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾比為1 : 1 5加入硫酸銅，過濾，除去不溶物，加 入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗滌，在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模擬酶。
本發(fā)明所述的環(huán)糊精為e-環(huán)糊精
本發(fā)明是以e-環(huán)糊精為模型，在制備得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物的基礎上，并將其 與Cu2+絡合得到了具有天然酶活性的酪氨酸酶模擬酶，可催化鄰苯二酚氧化生成鄰苯二 醌；與現(xiàn)有技術相比，它具有催化活性高，不會失活等特點。
具體實施例方式
下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作詳細的介紹酪氨酸酶模擬酶的制備方法，它是
A) 將環(huán)糊精按質(zhì)量比l : 15 25加入千吡啶中溶解，然后按環(huán)糊精與鄰-碘?；郊姿岬?摩爾比為1 : 0.2 0.4逐滴加入間苯二磺酰氯；在25 'C下反應1小時，停止反應，在低 于25 'C條件下減壓蒸除吡啶，淺褐色殘余物在液氮保護下在低于25 'C下真空干燥，得 到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比1 : 8 15溶于40%質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，濾去不溶物后 按質(zhì)量比1 : 8 15逐滴加到83%質(zhì)量百分比濃度的乙腈水溶液中，抽濾，除去白色沉淀， 在30 。C下減壓蒸除溶劑，殘留物溶于適量20%質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，攪拌l 小時，在30 'C下蒸除溶劑，在20 30'C下真空干燥即得到6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯；
B) 將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì)量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪 拌溶解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的質(zhì)量比為1 : 1 1.5加入碘化鈉， 在60 90。C下攪拌反應2 45h，在40。C下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入 丙酮，攪拌、過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固 體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40 45'C下真空干燥即得到雙碘代環(huán)糊精；C)將 雙碘代環(huán)糊精按質(zhì)量比為1 : 10 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按雙 碘代環(huán)糊精與組氨酸的質(zhì)量比為1 : 0.8 1.5加入組氨酸，在8(TC下反應24小時；將反 應得到的懸濁液抽濾，收集濾液，在40。C下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗 至丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到環(huán)糊 精雙組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精雙組氨酸衍生物按質(zhì)量比為1:500 2000投入PH值為 7 9的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾比為1 : 1 5加入硫酸銅，過濾，除去不溶物，加入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗滌， 在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模擬酶。本發(fā)明所述的環(huán)糊精為環(huán)糊精
實施例i，本發(fā)明所述的酪氨酸酶模擬酶的制備方法，它是a)將e-環(huán)糊精按質(zhì)量
比1 : 15加入干吡啶中溶解，然后按3-環(huán)糊精與鄰-碘?；郊姿岬哪柋葹? : 0.2 逐滴加入間苯二磺酰氯；在25 r下反應l小時，停止反應，在低于25 。C條件下減壓蒸 除吡啶，淺褐色殘余物在液氮保護下在低于25 'C下真空干燥，得到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比l :8溶于40%質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，濾去不溶物后按質(zhì)量比1 : 8逐滴加到83% 質(zhì)量百分比濃度的乙腈水溶液中，抽濾，除去白色沉淀，在30 'C下減壓蒸除溶劑，殘留 物溶于適量20 %質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，攪拌l小時，在30 。C下蒸除溶劑， 在2(TC下真空干燥即得到6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì) 量比為1 : 30加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯 與碘化鈉的質(zhì)量比為1 : 1加入碘化鈉，在60'C下攪拌反應2小時，在4(TC下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌、過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次， 除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在4(TC下真空干燥即 得到雙碘代環(huán)糊精；C)將雙碘代環(huán)糊精按質(zhì)量比為1 : IO加入到N，N-二甲基甲酰胺中， 攪拌溶解；然后按雙碘代環(huán)糊精與組氨酸的質(zhì)量比為1 : 0.8加入組氨酸，在8(TC下反應 24小時；將反應得到的懸濁液抽濾，收集濾液，在4(TC下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色 蠟狀物用丙酮洗至丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干 燥后即得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精雙組氨酸衍生物按質(zhì)量比為1:500投入 PH值為7的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾 比為l: l加入硫酸銅，過濾，除去不溶物，加入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗 滌，在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模擬酶。
實施例2，它是a)將e-環(huán)糊精按質(zhì)量比i: 25加入干吡啶中溶解，然后按e-環(huán)
糊精與鄰-碘?；郊姿岬哪柋葹? : 0.4逐滴加入間苯二磺酰氯；在25 'C下反應1 小時，停止反應，在低于25 'C條件下減壓蒸除吡啶，淺褐色殘余物在液氮保護下在低于 25 E下真空干燥，得到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比1 : 15溶于40%質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液 中，濾去不溶物后按質(zhì)量比l : 15逐滴加到83%質(zhì)量百分比濃度的乙腈水溶液中，抽濾， 除去白色沉淀，在30 "C下減壓蒸除溶劑，殘留物溶于適量20 %質(zhì)量百分比濃度的乙醇 水溶液中，攪拌l小時，在30 'C下蒸除溶劑，在3(TC下真空干燥即得到6位雙取代環(huán)
糊精磺酸酯；B)將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì)量比為1 : 50加入到N， N-二甲基甲酰 胺中，攪拌溶解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的質(zhì)量比為1 : 1.5加入碘化 鈉，在9(TC下攪拌反應45小時，在4(TC下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入 丙酮，攪拌、過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固 體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在45'C下真空干燥即得到雙碘代環(huán)糊精；C)將雙碘 代環(huán)糊精按質(zhì)量比為1 : 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按雙碘代環(huán)糊 精與組氨酸的質(zhì)量比為1 : 1.5加入組氨酸，在80。C下反應24小時；將反應得到的懸濁 液抽濾，收集濾液，在4(TC下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗至丙酮變無色； 所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生 物；D)將環(huán)糊精雙組氨酸衍生物按質(zhì)量比為1:2000投入PH值為9的磷酸鹽緩沖液中， 待完全溶解后，按環(huán)糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾比為1 : 5加入硫酸銅，過濾， 除去不溶物，加入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗滌，在4(TC下干燥，得到酪氨 酸酶模擬酶。
實施例3，它是A)將環(huán)糊精按質(zhì)量比l : 20加入干吡啶中溶解，然后按環(huán)糊精與鄰 -碘酰基苯甲酸的摩爾比為1 : 0. 3逐滴加入間苯二磺酰氯；在25 'C下反應1小時，停止 反應，在低于25 'C條件下減壓蒸除吡啶，淺褐色殘余物在液氮保護下在低于25 'C下真 空干燥，得到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比1 : 10溶于40%質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，濾去不 溶物后按質(zhì)量比l : 12逐滴加到83%質(zhì)量百分比濃度的乙腈水溶液中，抽濾，除去白色沉 淀，在30 C下減壓蒸除溶劑，殘留物溶于適量20 %質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中， 攪拌l小時，在30 'C下蒸除溶劑，在25X:下真空干燥即得到6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯； B)將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì)量比為1 : 40加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶 解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的質(zhì)量比為1 : 1.3加入碘化鈉，在75。C下 攪拌反應15小時，在40'C下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌、 過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中， 加入丙酮得到沉淀，在42'C下真空干燥即得到雙碘代環(huán)糊精；C)將雙碘代環(huán)糊精按質(zhì) 量比為1 : 13加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按雙碘代環(huán)糊精與組氨酸的 質(zhì)量比為1 : 1加入組氨酸，在8(TC下反應24小時；將反應得到的懸濁液抽濾，收集濾液， 在4(TC下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗至丙酮變無色；所得固體溶于水 中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精
雙組氨酸衍生物按質(zhì)量比為1:1200投入PH值為8的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后， 按環(huán)糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾比為1 : 3加入硫酸銅，過濾，除去不溶物，加 入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗滌，在3(TC下干燥，得到酪氨酸酶模擬酶。
權利要求
1一種酪氨酸酶模擬酶的制備方法，該方法是A)將環(huán)糊精按質(zhì)量比1∶15～25加入干吡啶中溶解，然后按環(huán)糊精與鄰-碘?；郊姿岬哪柋葹?∶0.2～0.4逐滴加入間苯二磺酰氯；在25℃下反應l小時，停止反應，在低于25℃條件下減壓蒸除吡啶，淺褐色殘余物在液氮保護下在低于25℃下真空干燥，得到的粗產(chǎn)物按質(zhì)量比1∶8～15溶于40％質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，濾去不溶物后按質(zhì)量比l∶8～15逐滴加到83％質(zhì)量百分比濃度的乙腈水溶液中，抽濾，除去白色沉淀，在30℃下減壓蒸除溶劑，殘留物溶于適量20％質(zhì)量百分比濃度的乙醇水溶液中，攪拌1小時，在30℃下蒸除溶劑，在20～30℃下真空干燥即得到6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯按質(zhì)量比為1∶30～50加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位雙取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的質(zhì)量比為l∶1～1.5加入碘化鈉，在60～90℃下攪拌反應2～45h，在40℃下減壓蒸干N，N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌、過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40～45℃下真空干燥即得到雙碘代環(huán)糊精；C)將雙碘代環(huán)糊精按質(zhì)量比為1∶10～15加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按雙碘代環(huán)糊精與組氨酸的質(zhì)量比為1∶0.8～1.5加入組氨酸，在80℃下反應24小時；將反應得到的懸濁液抽濾，收集濾液，在40℃下減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗至丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精雙組氨酸衍生物按質(zhì)量比為1:500～2000投入PH值為7～9的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精雙組氨酸衍生物與硫酸銅的摩爾比為1∶1～5加入硫酸銅，過濾，除去不溶物，加入適量丙酮，靜置，析出晶體，用丙酮洗滌，在20～40℃下干燥，得到酪氨酸酶模擬酶。
全文摘要
一種酪氨酸酶模擬酶的制備方法，它是以β-環(huán)糊精為模型，在制備得到環(huán)糊精雙組氨酸衍生物的基礎上，將其與Cu2+絡合得到具有天然酶活性的酪氨酸酶模擬酶，可催化氧化酪氨酸生成二羥基苯丙氨酸；與現(xiàn)有技術相比，它具有催化活性高，不會失活等特點。
文檔編號C12N9/02GK101363013SQ200810120478
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權日2008年9月8日
發(fā)明者秉 王, 胡智文, 陳文興 申請人:浙江理工大學