專利名稱：：牛樟體胚培養(yǎng)基及組培快繁方法牛樟體胚培養(yǎng)基及組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物的體胚培養(yǎng)基及組培快繁方法。
背景技術(shù)：
：牛樟67/w礎(chǔ)咖咖ia/7e力/rae〃ay"fl，又名樟牛、有樟，樟科(Lauraceae)、樟屬(Cinnamom咖)，是中國南方特有樟科植物，因其樹形粗狀堅實，故稱為牛樟。牛樟木材芳香，為著名的建筑、家具及雕刻工藝用材，尤其是佛像雕刻，受佛家寵愛。牛樟全抹可提煉牛樟油。另外牛樟樹上寄生的真菌，被稱為牛樟菇或牛樟芝。眾人認(rèn)為具有抗癌、強身等功效，其價格日揚。牛樟原本在中國南方分布較廣，自海拔200公尺到2，000公尺有其自然分布，但是由于過去大量的伐采，現(xiàn)在只有在高山地區(qū)還有零星的分布，且多為逾齡老熟木，加上牛樟之花屬黏質(zhì)蟲媒花，母樹間受粉困難，又多開于樹冠頂端，易遭風(fēng)害，偶有種子亦未成熟前即遭鳥、獸食害，因此采種極為困難。在自然狀態(tài)下，種子自落，也因林下光弱、枯枝落葉過厚而不易著床發(fā)芽成苗。因此牛樟數(shù)量極為稀少，已列為保育類植物?？焖俣康胤敝碁l危的牛樟樹，應(yīng)成為林業(yè)工作的當(dāng)務(wù)之急，經(jīng)檢索，至今未見用牛樟未成熟種子為外植體，配制有效的組織培養(yǎng)基，對牛樟進行快繁的方法的報道。為此，本申請人遂組織力量，進行組培快繁的科研攻關(guān)工作，已初見成效。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用牛樟的未成熟種胚為外植體，配制一種有效的體胚培養(yǎng)基，進行誘導(dǎo)牛樟體胚分化、體胚增殖、發(fā)芽及生根，提供一套完整的組培及快繁方法。針對現(xiàn)實狀況，本發(fā)明的任務(wù)有四一是提供一種誘導(dǎo)體胚分化的培養(yǎng)基，二是提供一種體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基，三是提供一種胚芽生根培養(yǎng)基，四是提供整套牛樟組培快繁方法。上述任務(wù)可通過如下措施實現(xiàn)本牛樟組培快繁培養(yǎng)基，除MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類、MT維生素外，還含有作生長調(diào)節(jié)劑的0.01-lmg/L或l-5mg/L的BA即節(jié)^J^腺嘌呤、0.0005-0.01mg/L或0.0001-0.01mg/L的Picloram即氨氯吡咬酸、0.03-lmg/L的ABA即脫落酸、0.01-lmg/L的NAA即ot-奈乙酸、170mg/L的一7JC褲酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺噤呤、0.5g/L水解酪蛋白、附加占各培養(yǎng)基總重量1.0-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖，配制成三階段分別用的體胚分化培養(yǎng)基、體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基和胚芽生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值5.0-6.0。所說的體胚分化培養(yǎng)基由MS鹽類、MT維生素、0.01-lmg/L的BA、0.0005-0.01mg/L的Picloram、170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培養(yǎng)基總重量5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成，pH值5，0-6.0。所說的體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基由MS鹽類、MT維生素、l-5mg/L的BA、0.0001-0.01mg/L的Picloram、0.03-lmg/L的ABA、170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺噤呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培養(yǎng)基總重量1%-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。所說的胚芽生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基、0.01-lmg/L的NAA、占培養(yǎng)基總重量(為簡便起見，以下不再說明，只給出百分?jǐn)?shù))1%-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。用本牛樟體胚培養(yǎng)基進行組培快繁經(jīng)過下列步驟(1)外植體的采集與消毒采集開花授粉后4-5個月未成熟淡綠色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剝?nèi)スず凸庾尦实种梁稚姆N子完全露出，逐一泡在蒸餾水內(nèi)，最后統(tǒng)一用蒸餾水漂洗三次，再將種子置入稀釋10倍的5SNaCI0溶液中，真空條件下浸泡20min，用無菌水沖洗五次，置于無菌培養(yǎng)亞上，用刀剝開種子再置于顯微鏡下用刀尖挑取胚組織；(2)體胚的誘導(dǎo)將挑取胚組織接種于如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)體胚分化的培養(yǎng)基上，置于暗拒中，溫度25士21C，培養(yǎng)40-60天后便能成功地誘導(dǎo)體胚分化；(3)體胚增殖及胚芽分化將上述開始分化的胚組織，移至人工光照條件下培養(yǎng)，光照強度2500Lux，光照16h/d，控制溫度25±2匸，培養(yǎng)50-70天后，將材料轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求3所述的體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-50天，胚芽陸續(xù)分化；(4)誘導(dǎo)生根與移栽當(dāng)胚芽長至lcm高時將其移植至如權(quán)利要求4所述的胚芽生根培養(yǎng)基中，光照強度3700Lux，光照16h/d，25土21C條件下，2-3個月后再將帶根試管苗置于馴化室，強光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于三者的體積比為蛭石珍珠巖泥炭=1:1:1的混合而成的基質(zhì)中，每個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，2-3周后棄袋移入溫室栽種。本發(fā)明的有益效果是首創(chuàng)了牛樟體胚培養(yǎng)基及整套組培快繁方法，快速而批量地生產(chǎn)出牛樟樹苗，為拯救和擴大該種質(zhì)資源的同時，還為綠化、用材、發(fā)展相應(yīng)的林業(yè)經(jīng)濟提供堅實的物質(zhì)保障，又為進一步探索體胚的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎(chǔ)，而且為具有極高經(jīng)濟價值的樟芝的大量生產(chǎn)，提供了充足樹材。具體實施方式本發(fā)明下面結(jié)合實施例作進一步詳述本牛樟體胚培養(yǎng)基主要由MS基本培養(yǎng)基或MS鹽類、MT維生素，附加生長調(diào)節(jié)劑、凝固劑和營養(yǎng)劑等組成，凝固劑及其最佳添加量選定為占該培養(yǎng)基總重量的1.2%的瓊脂，營養(yǎng)劑選定為3%的蔗糖。本培養(yǎng)基還含有170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺噤呤、0.5g/L水解酪蛋白，培養(yǎng)基的pH值5.0-6.0，最佳值5.7。按附加的生長調(diào)節(jié)劑的成分與添加量的不同，配制成三種不同階段應(yīng)用的培養(yǎng)基一是誘導(dǎo)體胚分化的培養(yǎng)基，二是體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基，三是胚芽生根培養(yǎng)基。在配制三種不同階段的培養(yǎng)基中，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基釆用了不同濃度的BA0-10(單位mg/L,下同)和不同濃度的Picloram0-0.01配比的培養(yǎng)基，進行對比實驗，篩選出誘導(dǎo)體胚分化效果較佳的生長調(diào)節(jié)劑濃度為BAO.Ol-l+Picloram0.0005-0.01、最好的生長調(diào)節(jié)劑濃度為BAO.3+Picloram0.01;體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基采用不同濃度的BA0-10、不同濃度的Picloram0-0.1和不同濃度的ABA0-10配比的培養(yǎng)基，進行對比實驗，篩選出增殖系數(shù)較好的生長調(diào)節(jié)劑濃度為BA1-5+Picloram0.0001-0.01+ABA0.03-1、最好的生長調(diào)節(jié)劑濃度為BA3+Picloram0.0001+ABA0.3?，F(xiàn)將三階段分別用的三種培養(yǎng)基的四個實施例的原料及配比值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>下面用最佳方案的實施例1來說明本發(fā)明(見表中相應(yīng)的原料及配比值)(1)外植體的釆集與消毒外植體的采集與消毒采集開花授粉后4-5個月未成熟淡綠色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剝?nèi)スず凸庾尦实种梁稚姆N子完全露出，逐一泡在蒸餾水內(nèi)，最后統(tǒng)一用蒸餾水漂洗三次，再將種子置入稀釋10倍的5%NaCIO溶液中，真空條件下浸泡20min，用無菌水沖洗五次，置于無菌培^m上，用刀剝開種子再置于顯微鏡下用刀尖^胚組織；(2)體胚的誘導(dǎo)將挑取胚組織接種于用MS鹽類+MT維生素+0.lmg/LBA+0.0001mg/LPicloram+1.2%瓊月旨+庶糖配制成的體胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上，pH值5.7，置于暗柜中，溫度25土2TC，培養(yǎng)40-60天后便能成功的誘導(dǎo)體胚分化；(3)體胚增殖及胚芽分化將開始分化胚組織的材料，移至光下培養(yǎng)，光照強度2500Lux，光照16h/d，25士2TC糾下，培養(yǎng)50-70天后，將材料轉(zhuǎn)入MS鹽類+MT維生素+1mg/L的BA+0.001的Picloram+0.3mg/L的ABA+1.2X瓊脂+3%蔗糖的體胚增殖及胚芽分化的培養(yǎng)基上，pH值5.7,培養(yǎng)30-50，小芽陸續(xù)分化；(4)誘導(dǎo)生根與移栽當(dāng)小芽長至lcm高時將其移植至MS基本培養(yǎng)基+0.1mg/L的NAA+1.2%瓊脂+34蔗糖的生根培養(yǎng)基中，光照強度3700Lux，光照16h/d，25土21CM下，2-3個月后可將帶根試管苗置于馴化室，強光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于三者的體積比為蛭石珍珠巖泥炭-l:l:l的混合而成的差^質(zhì)中，每個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，一個月后棄袋移入溫室栽種，成活率高達(dá)85X。其余實施例2-4，照表中三種培養(yǎng)基相應(yīng)原料及配比值，與實施例l相同步緣搮作，也能解決本發(fā)明的技術(shù)問題，權(quán)利要求1、一種牛樟體胚培養(yǎng)基，含有MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類、MT維生素，其特征是還含有作生長調(diào)節(jié)劑的0.01-1mg/L或1-5mg/L的BA即芐氨基腺嘌呤、0.0005-0.01mg/L或0.0001-0.01mg/L的Picloram即氨氯吡啶酸、0.03-1mg/L的ABA即脫落酸、0.01-1mg/L的NAA即α-奈乙酸、170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、附加占各培養(yǎng)基總重量1.0-1.5％的瓊脂和1.5-4.5％的蔗糖，配制成三階段分別用的體胚分化培養(yǎng)基、體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基和胚芽生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值5.0-6.0。2、如權(quán)利要求1所述的牛樟體胚培養(yǎng)基，其特征是所說的體胚分化培養(yǎng)基由MS鹽類、MT維生素、0.01-lmg/L的BA、0.0005-0.01mg/L的Picloram、170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺噤呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培養(yǎng)基總重量1%-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。3、如權(quán)利要求1所述的牛樟體胚培養(yǎng)基，其特征是所說的體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基由MS鹽類、MT維生素、1-5mg/L的BA、0.0001-0.01mg/L的Picloram、0.03-lmg/L的ABA、170mg/L的一jc^酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、占培養(yǎng)基總重量1%-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成，pH值5.0-6.0。4、如權(quán)利要求1所述的牛樟體胚培養(yǎng)基，其特征是所說的胚芽生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基、0.01-lmg/L的NAA、占培養(yǎng)基總重量1%-1.5%的瓊脂和1.5-4.5%的蔗糖配制而成,pH值5.0-6.0。5、一種用權(quán)利要求1-4任一項所述的牛樟體胚培養(yǎng)基進行組培快繁的方法，其特征是經(jīng)過下列步驟(1)外植體的采集與消毒采集開花授粉后4-5個月未成熟淡綠色幼果，用刀切去部分果皮及果肉，用手剝?nèi)スず凸庾尦实种梁稚姆N子完全露出，逐一泡在蒸餾水內(nèi)，最后統(tǒng)一用蒸鎦水漂洗三次，再將種子置入稀釋10倍的5。yiNaCI0溶液中，真空條件下浸泡20min，用無菌水沖洗五次，置于無菌培養(yǎng)亞上，用刀剝開種子再置于顯微鏡下用刀尖挑取胚組織；(2)體胚的誘導(dǎo)將挑取胚組織接種于如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)體胚分化的培養(yǎng)基上，置于暗拒中，溫度25土2t:，培養(yǎng)40-60天后便能成功地誘導(dǎo)體胚分化；(3)體胚增殖及胚芽分化將上述開始分化的胚組織，移至人工光照條件下培養(yǎng)，光照強度2500Lux，光照16h/d，控制溫度25土2t;，培養(yǎng)50-70天后，將材料轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求3所述的體胚增殖及胚芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-50天，胚芽陸續(xù)分化；(4)誘導(dǎo)生根與移栽當(dāng)胚芽長至lcm高時將其移植至如權(quán)利要求4所述的胚芽生根培養(yǎng)基中，光照強度3700Lux,光照16h/d,25±2匸條件下，2-3個月后再將帶根試管苗置于馴化室，強光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于三者的體積比為蛭石珍珠巖泥炭=1:1:1的混合而成的基質(zhì)中，每個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，2-3周后棄袋移入溫室栽種。全文摘要一種牛樟體胚培養(yǎng)基，含有MS為基本培養(yǎng)基或MS鹽類和MT維生素，還含有BA、Picloram、ABA、NAA等生長調(diào)節(jié)劑，以及170mg/L的一水磷酸二氫鈉、30mg/L的硫酸腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、1.2％的瓊脂、3％的蔗糖，分別配制成了體胚分化、體胚增殖及胚芽分化、胚芽生根的三種培養(yǎng)基。運用上述培養(yǎng)基對牛樟組培快繁方法按四個步驟進行一是外植體的采集與消毒，二是體胚的誘導(dǎo)，三是體胚增殖與胚芽分化，四是誘導(dǎo)生根與移栽。本發(fā)明首創(chuàng)了牛樟體胚繁殖樹苗的整套方法，拯救了這一幾乎滅絕的物種資源，為進一步探索體胚的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎(chǔ)。而且為具有極高經(jīng)濟價值的樟芝的大量生產(chǎn)，提供了充足樹材。文檔編號C12N5/04GK101429489SQ20081012161公開日2009年5月13日申請日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日發(fā)明者曾余力,林新春,王曉芹,黃麗春申請人:浙江林學(xué)院