專利名稱：全人源抗人白介素21單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種可與人白介素21特異結(jié)合的單鏈抗體。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素21 (humaninterleukin-21， hIL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的y鏈(Yc)家族中的一 種細(xì)胞因子。hIL-21能抑制Thl細(xì)胞分泌IFN個(gè)抑制樹(shù)突細(xì)胞(dendric cells, DCs)抗原遞 呈功能，促B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，提高免疫球蛋白y (immunoglobingamma， IgG)分泌，提 高CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性，提高自然殺傷細(xì)胞(nature killer cells， NKs)細(xì)胞殺傷活性，促Thl7 細(xì)胞分泌IL-17和IL-21。由于IL-21提高體液免疫和細(xì)胞免疫活性，因此其在炎癥與自身免 疫性疾病中存在重要的促疾病發(fā)展作用。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以慢性多發(fā)性
關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的一種自身免疫性疾病。研究表明，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜組織
中，滑膜成纖維細(xì)胞與滑膜巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-21R， IL-21參與其表型分化與IL-ip、 TNF(x分
泌。研究發(fā)現(xiàn)，IL-21R不僅在病人的滑膜組織中表達(dá)增加，外周血白細(xì)胞、滑液白細(xì)胞表面
的IL-21R表達(dá)均顯著增加。因此，阻斷IL-21/IL-21R通路可能是治療RA的新途徑。膠原誘
發(fā)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis， CIA)禾卩佐齊!j誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis, AIA)
是實(shí)驗(yàn)性RA的代表性模型，對(duì)CIA和AIA動(dòng)物模型分別使用IL-21R-Fc可溶性蛋白
(IL-21R-Fc)，發(fā)現(xiàn)CIA明顯好轉(zhuǎn)而AIA癥狀完全消失，這一結(jié)果支持了 IL-21阻斷劑對(duì)于
RA治療的重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在IL-21R-Fc劑量為(100^g/ml)時(shí)可以降低50%TNFa
分泌量、57% IL-6分泌量和81%的IL-lp分泌量。
原發(fā)性干燥綜合癥(primary Sjogren's syndrome, pSS)是一種累及分泌腺體的自身免疫
性疾病，病理上表現(xiàn)為唾液腺呈灶性CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而且B淋巴細(xì)胞高反應(yīng)性成為其
最突出的免疫學(xué)特征之一。研究發(fā)現(xiàn)pSS患者血清IL-21水平顯著高于正常人水平，且與？
球蛋白、紅細(xì)胞沉降率呈明顯正相關(guān)，特別是自身抗體陽(yáng)性者血清IL-21水平顯著高于對(duì)照，
表明IL-21在pSS患者體內(nèi)是促進(jìn)B細(xì)胞增殖的，并在調(diào)節(jié)免疫球蛋白的產(chǎn)生過(guò)程中起重要
作用。而且IL-21在pSS伴腮腺腫痛者明顯高于對(duì)照，推測(cè)在免疫紊亂的pSS患者體內(nèi)，大
量CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)唾液腺體，隨著IL-21水平的升高，致使B細(xì)胞反應(yīng)性增高，多克隆B淋
巴細(xì)胞激活使體內(nèi)產(chǎn)生大量器官特異性及非特異性自身抗體并可出現(xiàn)高IgG癥，更加劇了自
身免疫反應(yīng)及腺體內(nèi)外損傷。pSS并甲狀腺功能減退者血清IL-21水平顯著高于非甲減。干燥
綜合癥合并甲狀腺病變以自身免疫性甲狀腺功能異常為主，都存在異常的體液及細(xì)胞免疫。
3甲狀腺表現(xiàn)為慢性炎癥過(guò)程大量Thl細(xì)胞因子如IFN-Y、 TNF-a等增多，而pSS患者腺體中 IL-2、 IFN-a表達(dá)增加提示亦有類似Thl反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)IL-21可以上調(diào)T-bet基因合成進(jìn)而 增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)。以往研究表明pSS患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，因而對(duì)CD4+T 細(xì)胞的抑制功能減弱，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞功能亢進(jìn)，活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的大量IL-21激 活T、 B細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白的產(chǎn)生引起腺體及腺體外的損傷。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種自身免疫性結(jié)締組織病，由 于體內(nèi)大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物造成組織損傷。其中IgGl、 IgG2是在SLE中起關(guān) 鍵致病作用的自身抗體，因此在很大程度上，那些影響B(tài)淋巴細(xì)胞功能的因素便在SLE中發(fā) 揮重要作用。IL-21可增強(qiáng)IgG分泌，對(duì)抗IgE的生成，并促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，因此 IL-21可能參與SLE的致病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)在SLE病患體內(nèi)IL-21的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于健康人， 對(duì)于基因多態(tài)性分析也顯示IL-21是SLE患病風(fēng)險(xiǎn)的候選指標(biāo)之一。對(duì)狼瘡性MRL-Fas(lpr) 小鼠模型使用IL-21R-Fc阻斷IL-21后，dsDNA自身抗體和總IgG水平下降，特別是IgGl和 IgG2量顯著下降，并且SLE的癥狀如蛋白尿、IgG腎小球沉淀、腎小球基底增厚、皮膚損傷 都有所減少?？梢?jiàn)IL-21是SLE —個(gè)重要的致病因素，其機(jī)制主要是通過(guò)影響B(tài)細(xì)胞的功能 和調(diào)節(jié)致病性自身抗體數(shù)量在SLE中起到致病作用，因此可以推測(cè)IL-21阻斷劑在治療SLE 方面具有一定潛力。
非肥胖型糖尿病(nonobese diabetic, NOD)為T(mén)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，NOD 小鼠是目前較為常用的糖尿病小鼠模型。研究者繪制出控制這種疾病的基因位點(diǎn)圖譜，其中 最重要的位點(diǎn)是ldd3位點(diǎn)，用Idd3保護(hù)性等位基因置換NOD小鼠Idd3易感性等位基因能使 糖尿病發(fā)生幾率下降70% 。 IL-21基因就定位于ldd3，因此IL-21很可能是控制NOD的關(guān)鍵 所在。研究表明和器官特異性自身免疫疾病一樣，NOD小鼠的自身免疫性疾病是淋巴細(xì)胞減 少癥和過(guò)量的IL-21導(dǎo)致的自身反應(yīng)性T細(xì)胞代償性增殖所引起的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明NOD小鼠 中表達(dá)IL-21受體的T細(xì)胞量明顯多于含有抗病基因的B6.Idd3.NOD小鼠，特別是記憶型T 細(xì)胞是B6.Idd3.NOD小鼠的3-4倍。NOD小鼠IL-2lmRNA的表達(dá)量也比B6.Idd3.NOD小鼠 多出數(shù)倍，并且IL-21還能上調(diào)自身受體的表達(dá)，促進(jìn)IL-21R表達(dá)型T細(xì)胞增殖，更增強(qiáng)了 應(yīng)答效應(yīng)。然而NOD小鼠有大量IL-21R表達(dá)型T細(xì)胞似乎與淋巴細(xì)胞減少癥相矛盾，但實(shí) 際上盡管IL-21促使T細(xì)胞增殖，卻并不促進(jìn)其存活。在NOD小鼠，表達(dá)IL-21R的T細(xì)胞 更傾向于死亡，存活下來(lái)的一部分破壞胰島P細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是T 細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)脫髓鞘疾病，是人類脫髓鞘疾病一 多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)的經(jīng)典動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)抗原誘導(dǎo)EAE之前使用IL-21,促進(jìn)了 NK細(xì)胞增殖和活性從而增強(qiáng)了 CNS的炎癥反應(yīng)，EAE加劇，但在EAE 產(chǎn)生后使用IL-21卻無(wú)此效應(yīng)，NK細(xì)胞耗竭可以完全抑制IL-21誘導(dǎo)的病情加重。據(jù)此分析， IL-21通過(guò)刺激NK細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促EAE病情發(fā)展。IL-21與IL-21R基因敲除小鼠中 IL-17的水平低于對(duì)照EAE模型組10倍，并且其病情發(fā)展緩慢，顯示IL-21除了通過(guò)刺激 NK細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還通過(guò)刺激Thl7細(xì)胞分泌IL-17加劇病情發(fā)展。
綜上所述，此類疾病均出現(xiàn)IL-21異常表達(dá)，使得IL-21拮抗劑存在應(yīng)用于此類疾病的潛力。
抗體相對(duì)于化學(xué)小分子有其特殊的優(yōu)勢(shì)(1)抗體對(duì)靶標(biāo)特異的高親和力，大大減少了 脫耙所造成的副作用。(2)抗體的半衰期平均為10-21天，從而減少了使用次數(shù)，易于被病 患接受。(3)如果靶標(biāo)不適合使用化學(xué)方法處理，抗體可以提供一種新的治療方式。(4)抗 體有確定的序列，可以通過(guò)工程手段更改序列，獲得更佳的療效。
早期鼠源單抗臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射鼠源抗體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體(Human anti-mouse antibodies, HAMA)顯著降低藥物體內(nèi)半衰期，還會(huì)增加患者后續(xù)應(yīng)用的臨床風(fēng)險(xiǎn)。因此， 鼠源抗體藥物的應(yīng)用受到了限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，1984年出現(xiàn)了嵌合重組抗體 技術(shù)，但是由于嵌合抗體中依然存在33%的鼠源部分，能誘發(fā)產(chǎn)生人抗嵌合抗體(Human anti-chimeric antibodies, HACA)反應(yīng)。隨后發(fā)展了抗原性更低的人源化抗體(鼠源部分5% 一10%)——通過(guò)基因工程手段將鼠源的抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)嵌入人抗體骨架中。隨著 噬菌體展示技術(shù)以及由此衍生的五.Co/z'展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)的發(fā)展，使人工合成全人源 抗體成為可能，全人源抗體較前幾類抗體免疫原性更低，更加安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源抗人白介素21單鏈抗體序列。
全人源抗人白介素21單鏈抗體基因序列全長(zhǎng)750個(gè)核苷酸其特征為可變重鏈區(qū)和可變輕 鏈區(qū)組成
可變重鏈區(qū)
CDR1
CDCDR3
可變輕鏈區(qū)
CDR1
CDR2
CDR3 CCGCA
本發(fā)明的目的還在于提供一個(gè)全人源抗人白介素21單鏈抗體的篩選方法。 上述發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供的全人源抗人白介素21單鏈抗體來(lái)源于人源單鏈抗體噬菌體抗體庫(kù)，從庫(kù)中 篩選出與人IL-21有特異性親和力的抗體序列。
本發(fā)明提供的人IL-21篩選方法為
1、 噬菌體抗體庫(kù)擴(kuò)增 通過(guò)發(fā)酵法擴(kuò)增保存于菌株內(nèi)的質(zhì)粒，加入輔助噬菌體釋放形成抗體庫(kù)。
2、 篩選抗人IL-21單鏈抗體
通過(guò)非特異性洗滌去除不與人IL-21作用的噬菌體，通過(guò)篩選-富集-篩選的循環(huán)獲得與 人IL-21具有高親和力的抗體。
3、 鑒定抗人IL-21單鏈抗體
使用ELISA鑒定單鏈抗體的親和力，使用PCR鑒定插入抗體片斷的完整性，使用測(cè)序鑒 定抗體的核酸序列。
4、 抗人IL-21單鏈抗體的可溶性表達(dá)
使用HB2151作為表達(dá)菌株，用噬菌體直接感染，誘導(dǎo)表達(dá)。使用Ni+親和純化獲得可溶 性單鏈抗體表達(dá)。
A T
D c
G A
c A
c A
c G
^ G
A b
c A
T G
G K
c G
c A
G A
T c
c G
T T
P c
T c
y T
T c
^ c
A G
c A
M A
w c
A A
c w
c c
c T
A G本發(fā)明提供了 1株對(duì)人IL-21具有高親和力的單鏈抗體。 本發(fā)明提供的抗人IL-21單鏈抗體可以直接與人IL-21特異性結(jié)合。
本發(fā)明的全人源抗人白介素21單鏈抗體有以下優(yōu)點(diǎn)①與人IL-21的親和力高；②抗體 序列為全人源，免疫原性低，具有直接開(kāi)發(fā)成人用藥物的潛力；③基因工程改造方便，可以 根據(jù)CDR區(qū)直接合成Fab 二價(jià)抗體或完整抗體。


圖1人IL-21對(duì)免疫細(xì)胞的作用。IL-21由多種亞型細(xì)胞分泌，其中Thl7細(xì)胞與NKT細(xì)胞 分泌量遠(yuǎn)高于Thl和Th2細(xì)胞(圖中紅色箭頭)。IL-21可以通過(guò)自分泌作用于此類細(xì)胞，增 強(qiáng)其正、負(fù)反饋?zhàn)饔谩?br> 圖2親和篩選每輪洗脫噬菌體滴度。以人IL-21為抗原，對(duì)單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)進(jìn)行了四輪親 和篩選，每一輪篩選后噬菌體抗體收獲率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。 圖3親和篩選每輪洗脫噬菌體對(duì)人IL-21親和力ELISA。 圖4單克隆噬菌體對(duì)人IL-21親和力ELISA。
圖5Ni+親和柱純化電泳圖。M，分子量Marker; 1，平衡緩沖液沖洗；2， 20mM咪唑沖洗； 3， 50mM咪唑沖洗；4， 100mM咪唑沖洗；5， 200mM咪唑沖洗；6， 500mM咪唑沖洗。單 鏈抗體在100mM咪唑洗脫。
圖6可溶性scFv親和力ELISA。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1全人源抗IL-21單鏈抗體篩選
1.1制備具有性纖毛的TG1和HB2151
噬菌體通過(guò)結(jié)合大腸桿菌性纖毛進(jìn)行感染，將TG1和HB2151從甘油凍存管內(nèi)平板劃線，
接種于M9培養(yǎng)基平板，37'C倒置培養(yǎng)36h。 4'C保存，1周內(nèi)使用。
1.2野生型M13噬菌體滴度測(cè)定 (1)挑取M9平板上的TG1單克隆，接種于2xTY培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(8~16h)。 (i)取過(guò)夜培養(yǎng)的TGl，按P/。(v/v)接種于2xTY培養(yǎng)基，37nC振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD6f0.5)。
(3) 鋪下層平板TYE (1.5%瓊脂粉)。
(4) 將甘油凍存的野生型噬菌體按IOO倍比例梯度稀釋至l(T12，取各個(gè)稀釋梯度的野生型噬 菌體10nl加入200pl對(duì)數(shù)期TG1 ， 37'C水浴感染30min。
(5) 將3ml融化后的上層培養(yǎng)基(0.7%瓊脂粉)置于42。C水浴中保溫，加入感染后的TG1，顛倒混勻，迅速鋪于下層平板上，等待上層培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò) 夜。
(6)計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的噬菌斑個(gè)數(shù)，推算原始管內(nèi)噬菌體的數(shù)量。 1.3大量制備輔助噬菌體
(1) 挑取1.2中單個(gè)噬菌斑接種到51111處于對(duì)數(shù)期的丁01培養(yǎng)物中，37。C搖床培養(yǎng)2h。
(2) 轉(zhuǎn)接到含有500ml2xTY液體培養(yǎng)基的2L搖瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)lh，然后加入50mg/ml卡 那霉素水溶液，至終濃度50 70pg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)8 16h。
(3) 10800g， 4。C離心15min，收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/LNaCl)， 冰上放置大于30min。
(4) 再次10800g， 4'C離心15min，沉淀重懸于2mlTE緩沖液中，0.45nm膜過(guò)濾除菌。
(5) 按1.2中方法測(cè)定噬菌體滴度，將其稀釋至lxl(^p.f.u/ml。分裝后置4'C保存?zhèn)溆谩?1.4從噬菌體抗體庫(kù)中篩選功能抗體分子
1.4.1擴(kuò)增噬菌體抗體庫(kù)
(1) 取lml保存的噬菌體抗體庫(kù)(大約lxl01Qp.f.u)接種到500ml 2xTY培養(yǎng)基中(含有 100嗎/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖)。
(2) 37。C搖床培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期(OD,為0.4 0.6)，大約用1.5 2h。
(3) 取25ml培養(yǎng)液(大約"10|()個(gè)細(xì)菌)，用輔助噬菌體VCS-M13感染。感染比例為細(xì)菌 數(shù)/輔助噬菌體數(shù)=1/20。其余475ml培養(yǎng)物按照操作1.4.2制作次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)。細(xì)菌計(jì)算 方法為1 OD6oo細(xì)菌培養(yǎng)液約為8xl()8個(gè)細(xì)菌/ml。
(4) 于37。C水浴中，靜置30min。
(5) 3300g， 4'C離心10min，將沉淀重懸在30ml 2xTY培養(yǎng)基中(含有100嗎/ml氨節(jié)青霉 素和25嗎/ml卡那霉素)。
(6) 將上述菌液添加到470ml已經(jīng)37'C預(yù)溫的2xTY培養(yǎng)基中(含有100pg/ml氨芐青霉素 和25ng/ml卡那霉素)，3(TC搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
(7) 10800g， 4。C離心10min或3300g， 4。C離心30min。
(8) 收集上清，加入1/5體積PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)，徹底混合后4°。放置 lh。
(9) 再次10800g， 4。C離心10min，沉淀重懸于40ml水和8ml PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)。
(10) 10800g， 4'C離心10min或3300g， 4。C離心30min，吸棄離心上清。
(11) 再次重懸沉淀，再次10800g， 4。C離心10min，徹底吸棄上清。(12) 將沉淀重懸于5mlPBS中，H600g，離心10min，去除細(xì)菌碎片(沉淀)。
(13) 噬菌體上清4'C短期保存；用含15。/。甘油的PBS于一7(TC長(zhǎng)期保存。
(14) 測(cè)定噬菌體保存液的噬菌體滴度。取1^1噬菌體保存液稀釋在lmlPBS中，從中取1^1 感染lmlTGl菌液(OD6oo為0.4 0.6)。將感染菌液梯度稀釋后，再分別取5(^1感染菌液(原 液、1/102稀釋液、1/104稀釋液)鋪TYE平板(含有100ng/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖)，37°C 培養(yǎng)過(guò)夜。噬菌體保存液的滴度應(yīng)該在1()W l(^p.f.u/ml之間。
1.4.2制備次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)
(1) 將1.4.1 (2)步驟中，剩余的475ml培養(yǎng)液繼續(xù)在37'C搖床培養(yǎng)2h。
(2) 3300g, 4。C離心30min，棄沉淀，將菌體沉淀重懸于10ml 2xTY培養(yǎng)基(含15%甘油)， 分裝成10個(gè)小管(lml/管)。
(3) 將次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)保存在一7(TC。再次使用前，以PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆率及測(cè)定 噬菌體滴度。
1.4.3固相親和篩選
(1) 以包被緩沖液(PBS或50mmol/L NaHC03， pH9.6)稀釋人IL-21至100嗎/ml。取4ml 加入到免疫管中，室溫包被過(guò)夜。
(2) 棄上清，以PBS迅速洗管3次。
(3) 免疫管中注滿2。/。MPBS， 37。C封閉2h。
(4) 棄封閉液，用PBS迅速?zèng)_洗免疫管3次，簡(jiǎn)單的將PBS倒入免疫管再迅速倒出，以下 洗滌操作相同。
(5) 將1.4.1 (13)步驟獲得的噬菌體(1012 1013p.f.u)懸浮于4ml 2% MPBS (含有2%脫 脂牛奶的PBS)并加入到免疫管中。室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)30min后，于室溫靜置90min以上，棄上 清。
(6) 在進(jìn)行第一輪篩選時(shí)，以含有0.1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次 去除去污劑。第二輪以后的篩選，分別洗管20次。
(7) 將PBS吸干以后，加入lml簡(jiǎn)mmol/L三乙胺[700^il三乙胺(7.18mol/L)加入到50ml 水中]，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)孵育10min，進(jìn)行特異性洗脫。
(8) 在孵育過(guò)程中，準(zhǔn)備0.5ml lmol/L Tris (pH7.4)用于迅速中和(7)特異洗脫下來(lái)的噬 菌體。中和后的噬菌體可以直接4'C保存或用于(10)感染TG1菌。
(9) 向免疫管中加入200(xl lmol/LTris (pH7.4)中和殘余的噬菌體。
(10) 取9.25ml處于對(duì)數(shù)期的TGl細(xì)菌培養(yǎng)物與0.75ml洗脫下來(lái)的噬菌體混合，另外向免
疫管中加入4ml處于對(duì)數(shù)期TG1細(xì)菌培養(yǎng)物。兩者同時(shí)37'C水浴靜置30min。(11) 從兩種已感染噬菌體的TG1細(xì)菌培養(yǎng)物中分別取10(Hd，并分別做4 5次100倍系列 稀釋，然后將梯度稀釋物的噬菌體涂布TYE平板(含有100pg/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖)， 37。C培養(yǎng)過(guò)夜。
(12) 剩余的兩種已感染噬菌體的TG1細(xì)菌培養(yǎng)物3300g， 4'C離心10min，菌體沉淀重懸于 lml2xTY培養(yǎng)基中，使用Nunc Bio-Assay Dish鋪大型TYE平板(含有l(wèi)OO^ig/ml氨芐青霉 素和1%葡萄糖)。
(13) 3(TC培養(yǎng)過(guò)夜或直至出現(xiàn)可見(jiàn)克隆。 1.4.4進(jìn)一步親和篩選
(1) 向長(zhǎng)滿細(xì)菌克隆的Nunc Bio-Assay Dish平板中加入5ml含有15%甘油2xTY培養(yǎng)基并 用玻璃涂布棒刮取細(xì)菌并收集菌體懸液。取lOOpl菌體懸液加入到100ml 2xTY培養(yǎng)基中(含 有100嗎/ml氨芐青霉素和in/。葡萄糖)，檢測(cè)其OD6oc^0.1。其余的菌體懸液于一7(TC保存。
(2) 37。C搖床培養(yǎng)至OD6(X)-0.5 (約2h)。
(3) 加入輔助噬菌體VCS-M13感染，感染比例數(shù)為細(xì)菌數(shù)/輔助噬菌體數(shù)=1/20。
(4) 37。C水浴靜置30min。
(5) 將菌液3300g， 4。C離心10min，菌體沉淀重懸于50ml 2xTY培養(yǎng)基中(含有100嗎/ml 氨芐青霉素和25ng/ml卡那霉素)。3(TC搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
(6) 取40ml過(guò)夜培養(yǎng)物，10訓(xùn)g， 4'C離心10min或3300g， 4。C離心30min。
(7) 收集上清，加入l/5體積PEG/NaCl (20%PEG， 2.5mol/L NaCl)，徹底混合后4。C放置 lh以上。
(8) 再次10800g， 4r離心10min，沉淀重懸于40ml水和8ml PEG/NaCl。
(9) 10800g， 4。C離心10min或3300g， 4'C離心30min，吸棄上清。
(10) 沉淀重懸于2mlPBS中，11600g， 4'C離心10min，盡量去除細(xì)菌碎片。
(11) 取lml噬菌體4'C保存，另lml噬菌體用于下一輪親和篩選。
(12) 重復(fù)1.4.3、 1.4.4，進(jìn)行4輪篩選。
結(jié)果以人IL-21為抗原，對(duì)單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)進(jìn)行了四輪親和篩選，每一輪篩選后噬菌體抗 體收獲率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2篩選鑒定
2.1多克隆噬菌體ELISA
(1) 將人IL-21用PBS稀釋至10pg/ml，每孔添加10(^1，室溫包被過(guò)夜。
(2) 以PBS洗板3次，用200nl3。/。BSA (PBS配置)封閉2h。
(3) 以PBS洗板3次。每一輪篩選后，取10pl PEG/NaCl沉淀獲得的噬菌體，用3%BSA-PBS稀釋到ioow，加入酶標(biāo)板。
(4) 室溫孵育90min，以含有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(5) 每孔加入100^1用3% BSA 1:1000稀釋后的羊抗M13多克隆抗體，室溫孵育90min。以 含有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(6) 加入100pl用3% BSA 1:5000稀釋后的HRP-兔抗羊IgG多克隆抗體，室溫孵育90min。 以含有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(7) 配置底物液。100嗎/mlTMB。底物緩沖液為100mmol/L乙酸鈉，pH6.0，每50ml緩沖 液加入10^130%過(guò)氧化氫。
(8) 每孔加入lOO^il底物液，室溫孵育10min。
(9) 每孔加入5(Hil稀硫酸(O.lmol/L)終止反應(yīng)。
(10) 測(cè)定OD65Q和OD45Q，并以O(shè)D45Q的值減去OD65()的值，作為最后檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果以樣品孔的OD45o值繪制柱狀圖，每一輪篩選過(guò)后親和力逐漸升高，見(jiàn)圖3。 2.2單克隆噬菌體ELISA
(1 )將第4輪篩選獲得的平板上挑取單克隆到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，每孔已經(jīng)添加lOOpl 2xTY 培養(yǎng)基(含有100嗎/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖)，37'C搖床(300r/min)培養(yǎng)過(guò)夜。
(2) 每孔取出2^1菌液，加入到另一塊新的96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，每孔已經(jīng)添加200pl 2xTY 培養(yǎng)基(含有10(^g/ml氨芐青霉素和l。/。葡萄糖)，37。C搖床培養(yǎng)lh。向第一塊96孔細(xì)菌培 養(yǎng)板的各個(gè)孔中加入一定體積的甘油，使甘油終濃度達(dá)到15%，然后密封一7(TC保存。
(3) 向第二塊96孔細(xì)菌培養(yǎng)板的各個(gè)孔中加入25pl2xTY培養(yǎng)基(含有100ng/ml氨芐青霉 素和1%葡萄糖)和109p.f.uVCS-M13輔助噬菌體。
(4) 將96孔板在37。C靜置30min，然后37。C搖床培養(yǎng)lh。 1800g離心10min，棄上清。
(5) 將菌體沉淀重懸于200pl 2xTY培養(yǎng)基中(含有100|ug/ml氨節(jié)青霉素和25嗎/ml卡那霉 素)中。3(TC搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
(6) 1800g離心10min，取100W上清，按照多克隆噬菌體ELISA (參照2.1)的操作進(jìn) 行檢測(cè)。
結(jié)果以樣品孔的OD45o值繪制柱狀圖，篩選出4個(gè)吸光值最高的克隆C4、 El、 Gl、 H9，其 吸光值均》OD舶值的10倍，見(jiàn)圖4。經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)C4、 Gl、 El、 H9序列相同。 實(shí)施例3抗體可溶性表達(dá)與親和力測(cè)定 3.1抗體可溶性表達(dá)與純化
(l)將單克隆ELISA值高于空白3倍以上的孔中的菌吸取1^1接種于lml2xTY培養(yǎng)基，37。C 搖床培養(yǎng)至OD,-0.5。
11(2) 加入輔助噬菌體VCS-M13 37。C感染30min，感染比例數(shù)為細(xì)菌數(shù)/輔助噬菌體數(shù)=1/20。
(3) 3300rpm離心10min收集菌體，將菌體沉淀重懸于lml 2xTY培養(yǎng)基中(含有100嗎/ml 氨芐青霉素和25pg/ml卡那霉素)中。3(TC搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
(4) 12000rpm離心10min去除菌體，將離心獲得的上清于37。C感染10ml對(duì)數(shù)期的HB2151 30min。
(5) 將感染后的HB2151 3300rpm離心10min收集菌體，加入5ml含有15%甘油的2xTY培 養(yǎng)基重懸，取10pl涂布含有100pg/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖的TYE平板，37"培養(yǎng)過(guò)夜， 剩余的懸液-70'C凍存。
(6) 挑取HB2151單克隆接種于含有100pg/ml氨芐青霉素的2xTY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù) 期OD6C)(p0.5，加入終濃度為lmM IPTG 30'C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
(7) 12000rpm離心10min收集菌體。
(8) 收集的菌體按照每克3ml加入PBS重懸，加入終濃度為lmg/ml的溶菌酶，lmmol/L 的苯甲基磺酰氟化物4度裂解2h， 12000rpm離心20min收集上清。
(9) 將(8)中收集上清0.22pm膜過(guò)濾，上于Ni+親和柱柱床，分別用20mM， 50mM， 100mM， 200mM， 500mM咪唑洗脫。獲得電泳純的融合蛋白可溶性抗人IL-21單鏈抗體，見(jiàn)圖5。 3.2可溶性scFv的ELISA鑒定
(1) 將人IL-21用PBS稀釋至10ng/ml， 5pg/ml每孔添加100pd，室溫包被過(guò)夜。
(2) 以PBS洗板3次，用200nl 3%BSA (PBS配置)封閉2h。
(3) 以PBS洗板3次。取3.1 (9)中獲得的可溶性抗人IL-21單鏈抗體2倍梯度稀釋7次，
每孔加入iooni。
(4) 室溫孵育90min，以含有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(5) 每孔加入IOO"I用3% BSA 1:5000稀釋后的anti-cmyc tag抗體，室溫孵育卯min。以含 有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(6) 加入腳l用3% BSA 1:5000稀釋后的HRP-偶聯(lián)IgG多克隆抗體，室溫孵育90min。 以含有0.05%Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。
(7) 配置底物液。100嗎/mlTMB。底物緩沖液為10Ommol/L乙酸鈉，pH6.0，每50ml緩沖 液加入1(^130%過(guò)氧化氫。
(8) 每孔加入lO(Hil底物液，室溫孵育10min。
(9) 每孔加入5(Hil稀硫酸(O.lmol/L)終止反應(yīng)。
(10) 測(cè)定OD65o和OD45o，并以O(shè)D45o的值減去OD65o的值，作為最后檢測(cè)結(jié)果。 3.3實(shí)施實(shí)例所用試劑3.3.1菌株
1) Griffin合成噬菌體抗體庫(kù)
2) E. coli. TGI: supE hsd △ 5 thi A (lac-proAB) F， [traD36proAB十laclq lacZ A Ml5]
3) E. coli.HB215h K12 ara thi A (lac-proAB) F， [proAB+laclq lacZ △ M15]
4) Wild Type VCS國(guó)M 13 3.3.2培養(yǎng)基與緩沖液
1) 2xTY: 16gTyptone， 10g Yeast Extract, 5gNaCl，定容至1L，高壓滅菌。
2) TYE: 2xTY添加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌。
3) PBS:稱取NaC15.84g， Na2HP04'12H20 11.9g， NaH2P04'2H20 2.64g，溶解于800ml蒸餾 水，NaOH調(diào)pH7.2， 121。C高壓滅菌20min。室溫保存，備用。
4) PEG/NaCl:稱取PEG20g， NaCl 14.6g，溶解于蒸餾水定容至100ml， 121'C高壓滅菌20min。 室溫保存，備用。
5) lmol/L Tris-Cl:稱取Tris堿1.21g，溶解于8ml蒸餾水，HC1調(diào)pH7.4定容至10ml， 121 'C高壓滅菌20min。室溫保存，備用。序列表
<110>中國(guó)藥科大學(xué)
<120>全人源抗人白介素21單鏈抗體
<160>1
<210>1
<212>DNA
<211>750
<213>智人(Homo Sapiens) <400>1
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctatggca tgcactgggt gcgccaggtc 120
catgcacaag ggcttgagtg gatgggattg gtgtgeccta gtgatggcag cacaagctat 180
gcacaaaagt tccaggccag agtcaccata accagggaca catccatgag cacagcctac 240
atggagctaa gcagtctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagagaat 300
ccgtctgatc agcgttgtgt ttggggccaa ggtaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt agtgcacttg agattgtgat gacccagact 420
ccactctctc tgtccgtcac ccctggacag ccggcctcca tctcctgcaa gtctagtcag 480
agcctcctgc atagtgatgg aaagacctat ttgtattggt acctgcagaa gccaggccag 540
cctccacagc tcctgatcta tgaagtttcc aaccggttct ctggagtgcc agataggttc 600
agtggcagcg ggtcagggac agatttcaca cagaaaatca gccgggtgga ggctgaggat 660
gttggggttt attactgcat gcaaagtata cagcttctac agactacgtt cggccaaggg 720
accaagctgg aaatcaaacg tgcggccgca 750
1權(quán)利要求
1.包含具有序列1的IL-21抗體，所述抗體免疫特異性結(jié)合于人IL-21多肽。
2. 包含具有序列1的可變重鏈區(qū)的基因序列的IL-21抗體，所述抗體免疫特異性結(jié)合于人 IL-21多肽。
3. 包含具有序列1的可變輕鏈區(qū)的基因序列的IL-21抗體，所述抗體免疫特異性結(jié)合于人 IL-21多肽。
4. 權(quán)利要求l、 2或3的抗體，其中所述抗體是全人源抗體。
5. 權(quán)利要求l、 2或3的抗體，其中所述抗體偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì)和治療劑。
6. 包含權(quán)利要求l、 2或3的抗體的診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因工程設(shè)計(jì)、表達(dá)的與人白介素21有特異性親和力的全人源多肽類單鏈抗體。此工程抗體多肽是由一條柔性連接肽將抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)首尾相連而形成的，輕鏈和重鏈可變區(qū)的骨架與互補(bǔ)決定區(qū)均來(lái)源于人。本發(fā)明通過(guò)“富集-洗脫-富集”的循環(huán)操作，篩選出對(duì)人白介素21具有特異親和力的抗體，后通過(guò)分泌表達(dá)系統(tǒng)、親和純化系統(tǒng)獲得全人源的可以特異性結(jié)合人白介素21。本發(fā)明抗體可以應(yīng)用于偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì)和治療劑。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101298480SQ200810124160
公開(kāi)日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者娟 張, 弢 張, 李海鑫, 迪 浦, 旻 王, 衛(wèi) 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)