專利名稱：：聚乳酸電紡纖維固定化漆酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境酶催化
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種可用于降解氯酚類有機(jī)污染物的聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：漆酶(Laccase，E.C.l-10-3-2)是一種含糖的多酚氧化酶，以銅為分子核心。銅離子是漆酶的催化活性中心，是漆酶表現(xiàn)催化活性的決定因素。漆酶一般含有4個(gè)銅離子，據(jù)其光譜特征可劃分為三種類型I型銅離子和II型銅離子各一個(gè)，III型銅離子兩個(gè)，其中1型012+和11型012+呈順磁性。I型C^+呈藍(lán)色，在614nm處有特征吸收峰；II型012+無特征吸收光譜；111型0124+為偶合離子對(duì)(012+-012+)，呈反磁性。漆酶最早從漆樹的分泌物中被發(fā)現(xiàn)，后來人們發(fā)現(xiàn)許多生物，包括植物、真菌、甚至昆蟲體內(nèi)都存在漆酶。最初，人們發(fā)現(xiàn)漆酶可以通過破壞芳香環(huán)和C-C鍵催化木素脫甲基這一降解木素最初的步驟，最終導(dǎo)致木素大分子的破壞分解，去除殘余木素，這樣就可能使這種生物漂白技術(shù)代替造紙工業(yè)中造成嚴(yán)重環(huán)境污染的氯漂法。漆酶具有相當(dāng)寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，能催化許多酚類和芳香胺類物質(zhì)，因而在廢水處理、生物漂白、燃料電池和生物傳感器等方面具有較大的應(yīng)用潛力。但漆酶易溶于水，在水中游離漆酶活力不易保持，不可回收利用，也不能長期存放，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。漆酶的固定化是實(shí)現(xiàn)漆酶重復(fù)使用和穩(wěn)定性改善的有效手段。近年來國際上對(duì)漆酶的固定化進(jìn)行了較廣泛的研究，采用的固定化載體包括殼聚糖、硅膠、活性炭和高分子濾膜等多種材料。漆酶經(jīng)固定化后，可以制成多種形式的反應(yīng)器，既可達(dá)到生物催化效果，又可以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，利于酶與反應(yīng)物的分離。文獻(xiàn)(CN1374403A)以具有活性酯基的聚乙烯醇為載體，在64(TC，pH=2.(M0.0的緩沖溶液中將漆酶通過化學(xué)鍵合法成功地固定于該載體上。文獻(xiàn)(Osiadacz0,etal.J.Biotehcnol,1999,72:141-149)用聚乙烯酰胺凝膠包埋來自于Tvesriocolor的漆酶，固定化酶的活性回收為40%，它可以較高效率的催化氧化分解4-甲基-3-羥基鄰氨基苯甲酸和丁香醛連氮。文獻(xiàn)(PartricioPeralta-Zamaoraetal.AppliedCatalysisB:Envioramental2003,42:131~144)使用IRA-400離子交換樹酯固定漆酶，用于染料脫色時(shí)，可使某些染料完全脫色。但現(xiàn)有的酶固定化材料還不同程度存在固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、可分離性差等缺陷。如以硅膠、活性炭等無機(jī)材料作為固定化載體，則存在與水體分離、親水表面與酶鏈接不緊密等缺陷；而殼聚糖、高分子親水膜等加工復(fù)雜、成本較高、且性質(zhì)不穩(wěn)定。此外現(xiàn)有材料制備工藝過于繁瑣、安置方法復(fù)雜，須借助反應(yīng)器或固定床為支撐部件，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。高壓靜電紡絲聚乳酸纖維可用于酶固定化載體。聚乳酸(PLA)是近年來世界上研究最活躍的生物可降解高分子材料之一，在自然界中可逐漸完全降解為二氧化碳和水，作為固定化漆酶載體，具有良好的生物相容性，并不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染。利用靜電紡絲技術(shù)，可以將聚乳酸溶液或熔融體噴射形成直徑在幾十納米至幾微米之間的纖維膜。設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，形成的纖維膜孔隙率高，比表面積大，纖維長徑比高，均一性好，在功能材料領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。電紡技術(shù)和聚乳酸材料的結(jié)合，可為漆酶固定化技術(shù)提供了一種新的工藝方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新型的效率高、穩(wěn)定性好，而價(jià)格相對(duì)低廉、安置方便迅速的固定化漆酶催化劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該固定化漆酶催化劑的制備方法，該制備方法條件溫和，簡(jiǎn)單易行，特別利于快速安置。.本發(fā)明提供的納米纖維膜固定化漆酶是以具有疏水表面的高分子量聚乳酸為載體，將漆酶通過吸附和交聯(lián)固定在該載體上。該聚乳酸電紡纖維固定化漆酶的制備方法包括兩個(gè)步驟載體的合成及對(duì)漆酶的固定；其中載體的合成步驟包括1)將分子量為io萬的聚乳酸顆粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物溶于二氯甲烷中，均勻混合后攪拌至澄清；2)將聚乳酸/聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的二氯甲烷溶液引入高壓電紡系統(tǒng)紡制納米纖維膜，電紡所得纖維膜收集在金屬負(fù)極板上；3)將纖維膜與負(fù)極板分離，烘千，即可獲得固定化用聚乳酸電紡納米纖維膜載體；對(duì)漆酶的固定步驟包括將經(jīng)載體的合成步驟制得的載體成品與漆酶和交聯(lián)劑混合，在4"C下，pH=4.01的磷酸鹽緩沖溶液中搖動(dòng)反應(yīng)12小時(shí)得固定化漆酶，再用同pH值的緩沖溶液洗滌，直到?jīng)]有游離酶被洗出，再經(jīng)真空干燥制成固定化漆酶成品。本發(fā)明方法中，其中載體的合成步驟l)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物為P123、F108、F127之一種。P123的分子式為PEO20-PPO70-PEO20，分子量為5750克/摩爾；F108的分子式為PEO132-PPO50-PEO132，分子量為15500克/摩爾；F127的分子式為PEO106-PPO70-PEO106，分子量為14600克/摩爾。本發(fā)明方法中聚乳酸二氯甲垸溶液的質(zhì)量濃度為10~12%;聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物用量為聚乳酸重量的5%~10%。本發(fā)明提供聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑具有如下優(yōu)點(diǎn)1.固定化載體聚乳酸來源廣泛，生物相容性好，用于環(huán)境污染物降解時(shí)不會(huì)引入二次污染。2.聚乳酸的疏水性界面可高效吸附和固定漆酶，保持其活性和穩(wěn)定性，耳利于疏水性污染物在電紡纖維膜上的吸附降解。3.親水性嵌段共聚物提高了纖維膜整體的親水性，同時(shí)保留了聚乳酸的憎水界面，利于提高有機(jī)污染物和漆酶之間的親和度。4.以電紡技術(shù)制備載體，方法簡(jiǎn)單易行，受環(huán)境條件限制少，可安置于多種界面，適應(yīng)性強(qiáng)。圖1為聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑的掃描電子顯微鏡圖像；圖2為在使用本發(fā)明的聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑催化降解水中五氯酚鈉的過程中，其水溶液的紫外-可見光吸收光譜隨處理時(shí)間的變化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的聚乳酸電紡纖維固定化漆酶的制備方法包括兩個(gè)步驟載體的合成及對(duì)漆酶的固定；載體的合成步驟包括1)將分子量為100000的聚乳酸(外消旋)顆粒溶于二氯甲烷中，加入親水性嵌段共聚體表面活性劑，均勻混合后攪拌1小時(shí)以上得聚乳酸/嵌段共聚物混合溶液，其中嵌段共聚物用量為聚乳酸重量的5%~10%;、2)高壓靜電紡絲設(shè)備由高壓電源、噴絲頭和負(fù)極板組成。將l)中所得混合凝膠引入到高壓靜電紡絲裝置中。調(diào)解電源電壓為1215千伏，噴絲頭與負(fù)極板間距10厘米，調(diào)解噴絲頭以獲得穩(wěn)定連續(xù)的噴射。3)在負(fù)極板上收集電紡聚乳酸纖維膜，2小時(shí)后待纖維膜達(dá)到一定厚度，停止紡絲。將所得纖維膜在紅外燈下照射30分鐘使二氯甲烷完全揮發(fā)。4)以去離子水將纖維膜沖洗3次，以脫除表面剩余的親水嵌段共聚物。所得纖維膜在40。C下烘干備用。'對(duì)漆酶的固定步驟包括1)5毫克白腐真菌漆酶溶于5毫升PH值為4.01的磷酸鹽緩沖溶液中，震蕩搖勻至全部溶解。2)截取3X3厘米的電紡膜，將其浸泡于5毫升濃度為5%的戊二醛水溶液中，震蕩1小時(shí)，加入上述酶液，在4。C培養(yǎng)箱中持續(xù)震蕩12小時(shí)。3)取出固定化酶膜后以同pH值磷酸緩沖溶液反復(fù)沖洗，除去多余的游離酶，即得聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑，在4'C下晾干備用。在上述過程中，載體的合成步驟l)中，聚乳酸質(zhì)量濃度為10~12%，嵌段共聚物用量為聚乳酸重量的5%~10%。本發(fā)明中，所采用的高壓靜電紡絲裝置由高壓直流電源和噴絲裝置組成。所用部件包括高壓直流電源、金屬極板、注射器噴絲頭均可自相關(guān)設(shè)備供應(yīng)商獲得，也可自行設(shè)計(jì)搭建。本發(fā)明中，所使用的漆酶為該領(lǐng)域人員所熟知，可以通過較常規(guī)的微生物發(fā)酵獲得，如可以取自白腐真菌(T.gallica)、佛羅里達(dá)側(cè)耳(Pleurotusflorida)、雜色云芝(Polystictusversicoloy)等微生物的分泌物。也可以通過試劑供應(yīng)商直接獲得。本發(fā)明中，所用嵌段共聚體表面活性劑P123、F108、F127之一種。其中，P123的分子式為PEO20-PPO70-PEO20，分子量為5750克/摩爾；F108的分子式為PEO132-PPO50-PEO132，分子量為15500克/摩爾；F127的分子式為PEO106-PPO70-PEO106，分子量為14600克/摩爾。本發(fā)明在聚乳酸體系中引入親水性嵌段共聚物表面活性劑，可顯著降低電紡纖維膜的接觸角，提高浸潤性，同時(shí)保持了聚乳酸的憎水相界面和對(duì)酶的強(qiáng)吸附能力。該固定化漆酶以ABTS為底物，酶活指標(biāo)在700~1000酶活單位(IU)/平方米載體的范圍。酶活指標(biāo)是在室溫下取3乂3厘米的固定化酶與4毫升0.25毫摩爾/升的八8丁8混合，在pH值5.5下反應(yīng)，取反應(yīng)液以紫外分光光度計(jì)在420納米處測(cè)定吸光度。每一分鐘使1微摩爾ABTS氧化所需的酶量定為一個(gè)酶活單位。對(duì)本發(fā)明提供的聚乳酸電紡纖維固定化漆酶的對(duì)氯酚類污染物的降解能力可用如下方法測(cè)試剪取3X3厘米的聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑，然后將其加入到10毫升濃度為10毫克/升的五氯酚鈉或2，4-二氯酚水溶液中，持續(xù)震蕩。每間隔時(shí)間取樣，以紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)fi^分析。降解率(％)=剩余有機(jī)物濃度/初始有機(jī)物濃度)x100。實(shí)施例l1.2克外消旋聚乳酸溶解于10克二氯甲烷中，形成10.7克/克的二氯甲烷溶液。加入0.06克F108嵌段共聚體表面活性劑，不斷攪拌至完全溶解。引入高壓靜電紡絲，置待紡。調(diào)解高壓電源電壓為14千伏，噴絲頭和極板間距10厘米，獲得穩(wěn)定連續(xù)的噴射流。負(fù)極板上覆蓋鋁箔紙收集纖維產(chǎn)品。2小時(shí)后待纖維膜達(dá)到一定厚度，停止紡絲。將所得纖維膜在紅外燈下照射30分鐘使二氯甲垸完全揮發(fā)。以去離子水將纖維膜沖洗3次，以脫除表面剩余的親水嵌段共聚物。所得纖維膜在40度下烘干備用。即得到靜電紡絲聚乳酸固定化漆酶載體。該載體(下同)在氮?dú)馕矫摳奖缺砻娣e孔分布測(cè)定儀上(SSA-4000系列全自動(dòng)孔隙及比表面分析儀，北京彼奧德電子技術(shù)有限公司)進(jìn)行比表面積測(cè)定，其比表面積為62平方米/克。在(JSM-6700F冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子公司)掃描電子顯微鏡下進(jìn)行纖維形貌表征，其纖維平均直徑500700納米，纖維表面光滑，直徑分布均勻。10毫克白腐真菌漆酶溶于5毫升PH值為4.01的磷酸鹽緩沖溶液中，葶蕩搖勻至全部溶解。剪取3X3厘米的電紡膜，將其浸泡于5毫升濃度為2%的戊二醛水溶液中，震蕩1小時(shí)，加入上述酶液，在4"C培養(yǎng)箱中持續(xù)震蕩12小時(shí)，取出后以磷酸緩沖溶液反復(fù)沖洗，除去多余的吸附酶，即得聚乳酸電紡纖維固定化漆酶催化劑(1#)，在4C下晾千備用。該酶催化劑活力為885UI/平方米。實(shí)施例21.3克外消旋聚乳酸溶解于10克二氯甲烷中，形成11.5克/克的二氯甲垸溶液。加入O.l克F108嵌段共聚體表面活性劑，攪拌至完全溶解。調(diào)解高壓電源電壓為12千伏，噴絲頭和極板間距10厘米，獲得穩(wěn)定連續(xù)的噴射流。2小時(shí)后待纖維膜達(dá)到一定厚度，停止紡絲。紅外燈下照射30分鐘使二氯甲烷完全揮發(fā)。以去離子水將纖維膜沖洗3次，以脫除表面剩余的親水嵌段共聚物。所得纖維膜在40度下烘干備用。該樣品比表面積為43平方米/克。在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行纖維形貌表征，其纖維平均直徑約500納米，整體形態(tài)完整，有少量珠粒。漆酶固定化方法同實(shí)施例l(2#)。該酶催化劑活力為924UI/平方米。實(shí)施例31.2克外消旋聚乳酸溶解于10克二氯甲烷中，形成10.7克/克的二氯甲烷溶液。加入0.12克P123嵌段共聚體表面活性劑，不斷攪拌至完全溶解。引入高壓靜電紡絲裝置待紡。調(diào)解高壓電源電壓為15千伏，噴絲頭和極板間距10厘米，2小時(shí)后待纖維膜達(dá)到一定厚度，停止紡絲。將所得纖維膜在紅外燈下照射30分鐘，以去離子水將纖維膜沖洗3次，以脫除表面剩余的親水嵌段共聚物。所得纖維膜在40度下烘干備用。即得到靜電紡絲聚乳酸固定化漆酶載體。該樣品比表面積為39平方米/克。在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行纖維形貌表征，其纖維平均直徑約600納米，整體形態(tài)完整，有少量珠粒。漆酶固定化方法同實(shí)施例1(3#)。該酶催化劑活力為712UI/平方米。實(shí)施例41.4克外消旋聚乳酸溶解于IO克二氯甲垸中，形成12.3克/克的二氯甲烷溶液。加入0.09克F127嵌段共聚體表面活性劑，不斷攪拌至完全溶解。引入高壓靜電紡絲裝置待紡。調(diào)解高壓電源電壓為13千伏，噴絲頭和極板間距10厘米，獲得穩(wěn)定連續(xù)的噴射流。2小時(shí)后停止紡絲。將所得纖維膜在紅外燈下照射30分鐘，以去離子水將纖維膜沖洗3次。所得纖維膜在40度下烘干備用。該樣品比表面積為43平方米/克。在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行纖維形貌表征，其纖維平均直徑約550納米，整體形態(tài)完整，有少量珠粒。漆酶固定化方法同實(shí)施例1(4#)。該酶催化劑活力為1012UI/平方米。將上述催化劑分別應(yīng)用于不同的催化降解反應(yīng)中，活性結(jié)果實(shí)例如下反應(yīng)l:截取3X3厘米W樣品，將其加入到10毫升濃度為10毫克/升的五、氯酚鈉水溶液中，震蕩反應(yīng)，每2小時(shí)取樣，取上層清液在紫外-可見光譜儀(Varian，cary50，下同)上進(jìn)行分析。反應(yīng)2:稱取3X3厘米2存樣品，將其加入到10毫升濃度為10毫克/升的2，4-二氯酚水溶液中，震蕩反應(yīng)，每2小時(shí)取樣，取上層清液進(jìn)行分析。反應(yīng)3:稱取3X3厘米3弁樣品，將其加入到10毫升濃度為10毫克/升的2，4-二氯酚水溶液中，震蕩反應(yīng)，每2小時(shí)取樣，取上層清液進(jìn)行分析。反應(yīng)4:稱取3X3厘米賴樣品，將其加入到10毫升濃度為10毫克/升的五氯酚鈉水溶液中，震蕩反應(yīng)，每2小時(shí)取樣，取上層清液進(jìn)行分析。表l為詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種聚乳酸電紡纖維固定化漆酶的制備方法，該方法包括兩個(gè)步驟載體的合成及對(duì)漆酶的固定；其中載體的合成步驟包括1)將分子量為10萬的聚乳酸顆粒和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物溶于二氯甲烷中，均勻混合后攪拌至澄清；2)將聚乳酸/聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的二氯甲烷溶液引入高壓電紡系統(tǒng)紡制納米纖維膜，電紡所得纖維膜收集在金屬負(fù)極板上；3)將纖維膜與負(fù)極板分離，烘干，即可獲得固定化用聚乳酸電紡納米纖維膜載體；對(duì)漆酶的固定步驟包括將經(jīng)載體的合成步驟制得的載體成品與漆酶和交聯(lián)劑混合，在4℃下，pH＝4.01的磷酸鹽緩沖溶液中搖動(dòng)反應(yīng)12小時(shí)得固定化漆酶，再用同pH值的緩沖溶液洗滌，直到?jīng)]有游離酶被洗出，再經(jīng)真空干燥制成固定化漆酶成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中載體的合成步驟l)中所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物為P123、F108、F127之一種。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，P123的分子式為PEO20-PPO70-PEO20，分子量為5750克/摩爾；F108的分子式為PEO132-PPO50-PEO132,分子量為15500克/摩爾；F127的分子式為PEO106-PPO70-PEO106，分子量為14600克/摩爾。4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中聚乳酸二氯甲烷溶液的質(zhì)量濃度為10~12%。5.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的制備方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物用量為聚乳酸重量的5%~10%。6.—種固定化漆酶，其特征在于是以聚乳酸電紡納米纖維為載體，將漆酶通過如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的制備方法共價(jià)鍵合固定在該載體上。全文摘要本發(fā)明涉及一種可用于環(huán)境中氯酚類污染物降解的固定化酶催化劑—電紡聚乳酸纖維固定化漆酶及其制備方法。該固定化漆酶是以高分子量聚乳酸為載體，將漆酶通過化學(xué)鍵合和交聯(lián)固定在該載體上。其制備方法包括兩個(gè)步驟載體的合成及對(duì)漆酶的固定。載體的合成是以高壓靜電紡絲技術(shù)將含聚乳酸的有機(jī)溶液紡制成纖維直徑為納米級(jí)別的無紡纖維膜；對(duì)漆酶的固定是將載體與漆酶混合，在4℃下，pH＝4.01的緩沖溶液中反應(yīng)得固定化漆酶，洗滌，干燥得固定化漆酶成品。本發(fā)明提供了一種新型的固定化漆酶催化劑，該酶穩(wěn)定性好、活性高，且制備方便、安置迅速。文檔編號(hào)C12N11/08GK101407803SQ20081012602公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者佳劉,陽李,殷立峰,沈珍瑤,牛軍峰申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)