專利名稱：：一種調控植物木質素含量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程領域中一種調控植物木質素含量的方法。
背景技術：
：木質素是由三種醇單體或單木質酚(對香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一種復雜的酚類聚合物。在細胞壁的木質化過程中，木質素滲入到細胞壁中，填充于纖維素構架內，如導管和管胞細胞的形成。由于木質素的滲入，加大了細胞壁的硬度，增強了細胞的機械支持力或抗壓強度，促進機械組織的形成，以有利于鞏固和支持植物體及水分輸?shù)赖茸饔茫瑫r由于木質素的化學特性，如不可溶性和復雜的酚類聚合物，使得木質部具有細胞壁疏水性，也增強了抗病能力。樹木的次生木質部有纖維素(e-l-4-糖苷)木質素(苯基多聚物)和半纖維素(異型多糖)，比例約為2:1:1。在樹木生長時，纖維素微纖絲為細胞壁提供張力，木質素增加纖維素微纖絲的硬度。木質素含量高的木材由于硬度高而廣泛用于建筑和家具領域。但在造紙過程中卻需要清除木質素。目前去除木漿中的木質素一般需借助毒性較高的化學物質，這道工序是造紙工業(yè)中最耗費能源、對環(huán)境危害最大的一個環(huán)節(jié)。無論是提高樹木的木質素含量還是降低木質素含量都將有益于生產。從策略上說，可以從多個方面進行木質素含量控制(l)控制木質素合成途徑中的各種酶系的合成是一個重要途徑，如對從PAL酶到過氧化物酶/漆酶等進行反義基因轉化有可能達到目的；(2)改變木質素的結構組成和化學性質。由于研究木質素含量遺傳變異的重要目的之一就是為工業(yè)造紙服務，在難以直接降低木質素含量情況下，改變木質素的結構組成有可能間接地達到同樣的效果；(3)必須認識到木質素的前體是在細胞質內合成的，然后轉移到細胞壁并進行脫氫聚合形成木質素，因此木質素的合成調控也需注意涉及到一些非酶化學分子的作用，即傳遞運輸過程的控制，但這方面的研究至今卻很少見報道研究。單個酶的作用及多個酶間的相互作用對于探索木質素的合成機理有重要意義，因此木質素合成酶的分子生物學特性及作用機理研究日益受重視。目前直接應用基因工程的方法來改變木質素含量的研究已有報道。Piquemal等從岡尼桉(Eucalyptus)分離出來的CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反義構建載體，通過農桿菌(Agrobacerium)轉化到煙草(^ico"a73ta&c鵬L)上，結果顯示出在穩(wěn)態(tài)時CCRraRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木質部細胞壁呈橙棕色，紫丁香基與愈創(chuàng)木基的比率提高，且出現(xiàn)不正常細胞壁酚類物質。然而CCR活性嚴重下降的植物除了表現(xiàn)出木質素下降外，還表現(xiàn)出形體小、葉形異常和縐縮導管等特征。通常認為CAD(輕基肉桂醇脫氫酶)是催化木質素前體合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能減少木質素前體的合成。Baucher等研究將從毛果楊X美洲黑楊(尸.z^z'c力ocarpa7bnGroyX尸.ofe"ojVes#arW.)分離出來的CAD酶的cDNA通過農桿菌進行正義和反義轉化到歐洲山楊X銀白楊(尸^reM/7a厶X尸.s7力aZ.)中，結果表明3個反義轉化和2個共抑制的品系的木質部組織CAD活性下降70%，在CAD活性少于60%的品系中，可檢測到紅色的木質部，但木質素含量和組成與對照品系相似，并未下降。但是細胞壁的化學特性不同，應用間苯三酚染色后，正常品系的木質部呈典型的淡紅色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕紅色。用NaOH處理后，通過將細胞壁中具有堿溶性的部分進行酸化處理后，具有紅色木質部的品系的木質素可沉淀，而白色木質部的品系的木質素不沉淀。光譜分析顯示出紅色木質部的楊樹香蘭素和紫丁香基醛含量提高。紙漿試驗證明CAD活性下降的品系只有少量的木質素存于紙漿中。類似的報道還有Higuchi等，CAD反義轉化的植株木質素含量并不下降，但木質素的組成和化學性質發(fā)生了改變。CAD反義轉化后木質素含量不下降，這與自然界中火炬松CAD突變體的結果不一致。OMT是重要的控制木質素合成酶，Dwivedi等將美洲山楊中編碼0MT(EC2.1.1.6)酶的反義序列與CaMV35S基因的增強子、啟動子和終止子組裝后轉化到煙草基因組內后，轉基因植株表現(xiàn)出正常的表現(xiàn)型。在4個轉基因植株的莖部中，0MT(咖啡酸0-甲基轉移酶)酶的活性平均下降29%。莖部木材化學分析結果顯示出紫丁香基單位含量下降，木質素含量下降水平與0MT酶活性程度相關。Doorsselaere等應用反義COMT(咖啡酸甲基轉移酶)轉化歐洲山楊X銀白楊后，COMT活性下降為正常的5%，但木質素含量并不下降。根據(jù)應用轉化單酶基因方法改造煙草木質素含量的研究報道，降低單個酶0MT、CAD、P0D(過氧化物酶)、C0MT和F5H(阿魏酸5-羥基化酶)等酶活性，并不影響木質素含量變化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羥基化酶)、和CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)等酶活性，則可以降低木質素含量。通過鑒定樹木與草本植物中木質素合成途徑的酶和基因，以往努力減少樹木中木質素的含量，通過下調編碼咖啡酸o-甲基轉移酶或肉桂醇脫氫酶含量沒有獲得成功，只是修飾了木質素的結構。在轉基因煙草中降低這些酶的含量顯示沒有減少木質素的含量。然而通過在轉基因煙草中降低苯丙氨酸脫氨酶含量，顯著減少了木質素的含量，該酶催化木質素合成途徑中進入苯丙基衍生物的途徑導致了一系列表型不正常。同樣在轉基因擬南芥和煙草中通過降低肉桂酸輔酶A還原酶的含量也降低了(25%-40%)木質素的含量，但導致了細胞壁的委縮和矮化。這些草木系統(tǒng)清晰地表明了修飾次生代謝和木質素質量的可能性。因此，樹木生物技術的問題是能否降低木質素含量而不影響結構的硬度和樹木的生長。楊樹的4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)蛋白Pt4CLl、Pt4CL2催化羥基肉桂酸與CoA的連接反應，為木質素和類黃酮的生物合成提供酚類前體。Pt4CL2在莖和葉的表皮細胞中表達，與類黃酮合成相關。Pt4CLl是在發(fā)育的木質部維管組織中表達，和木質素的合成相關。發(fā)明創(chuàng)造內容本發(fā)明的目的是提供一種調控植物木質素含量的方法。本發(fā)明所提供的調控植物木質素含量的方法，是將含有4CL1基因的表達載體轉化植物，得到木質素含量升高的植物；將含有反義4CL1基因的表達載體轉化植物，得到木質素含量降低的植物。所述4CL1基因是具有序列表中序列1的多核苷酸序列，所述反義4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。序列表中的序列1由1741個堿基組成，序列2由1637個堿基組成。用于構建所述含有4CL1基因的表達載體或含有反義4CL1基因的表達載體的出發(fā)載體可為Ti類質粒載體和病毒載體，優(yōu)選為Ti類質粒載體。所述Ti類質粒載體優(yōu)選為雙元載體，如pBI121。所述含有4CL1基因的表達載體優(yōu)選為pB4CL;所述含有反義4CL1基因的表達載體優(yōu)選為pBan4CL。所述轉化方法可為農桿菌介導轉化法、基因槍介導轉化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農桿菌介導轉化法。本發(fā)明方法中，所述植物可為草本植物或木本植物，其中，所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。本發(fā)明通過在植物細胞中用載體引入4CL1基因或反義4CL1基因，來生產木質素含量升高或降低的轉基因植物特別是轉基因樹木，為培育木質素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。圖1為35S-4CL1融合基因載體pB4CL構建過程示意圖圖2為pB4CL的PCR鑒定圖譜圖3為轉35S-4CL1融合基因的轉基因煙草植株照片圖4為轉35S-4CL1融合基因煙草的PCR檢測圖譜圖5為轉35S-4CL1融合基因煙草的southern雜交圖譜圖6為轉35S-4CL1融合基因煙草的northern雜交圖譜圖7a為轉35S-4CL1融合基因煙草葉中的4CL1活性分析柱狀7b為轉35S-4CL1融合基因煙草莖中的4CL1活性分析柱狀圖圖8a為轉35S-4CL1融合基因煙草植株照片圖8b為空白煙草植株照片圖9為轉35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的含水量、木質素及纖維素含量比較柱狀圖圖10為轉35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的木質素含量分布曲線圖11為轉35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的纖維素含量分布曲線圖12a為35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構建過程示意圖圖12b為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株的PCR檢測結果圖譜圖13為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株的Southern雜交結果圖譜圖14為蛋白標準曲線圖15a為空白煙草植株中4CL1酶活性動力曲線圖15b為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株中4CL1酶活性動力曲線圖16為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株中4CL1酶活性柱狀圖圖17a為葡萄糖標準曲線圖17b為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的木質素含量比較柱狀圖圖17c為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的纖維素含量比較柱狀圖圖18a為轉35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的木質素含量比較柱狀圖圖18b為轉35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的纖維素含量比較柱狀圖具體實施例方式實施例1、培育木質素含量提高的轉基因煙草本實施例所用的地高新試劑盒的貨號為92445820，31Oct2003，Boehringer公司。1、35S-4CL1融合基因載體pB4CL構建以按照常規(guī)方法提取的楊樹總DNA為模板，在引物F6:CGGATCCGCAATGGACGCCACAATGAATCC，F(xiàn)7:CCGGGTACTGTCTTACGTTGGGTACG的引導下，按照如下循環(huán)程序94度5min;94度30sec，55度45sec，72度90sec，30個循環(huán)；72度10min進行PCR擴增，回收、純化PCR擴增產物，得到4CL1基因片段，分別利用1&7^5>ra7酶切純化的PCR擴增產物和PUC18，然后進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5ct，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質粒，得到亞克隆載體pU4CL。35S-4CL1融合基因載體pB4CL構建過程如圖1所示，具體步驟如下按照常規(guī)方法用J力a//5feal將4CL1基因片段從亞克隆載體pU4CL上切下，并與經(jīng)Jte/A&31酶切的pBI121載體進行連接，獲得含有融合基因35S-4CL1基因的重組載體pB4CL。用質粒pB4CL按照常規(guī)方法轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選后，提取質粒同時進行Tte//Smal酶切和以引物l:CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2:TACTGTCTTACGTTGGGTACG為弓|物進行PCR鑒定，結果如圖2所示，表明4CL1基因已插入表達載體。按常規(guī)方法對質粒pB4CL進行測序，結果表明插入的4CL1基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于pB4CL的5827bp-7567bp之間；序列表中的序列1由1741個堿基組成，4CL1基因的開放閱讀框架為自5'端第5位-1627位核苷酸序列。2、煙草的轉化與鑒定分析按改進的An方法，直接轉化農桿菌LBA4404，在鏈霉素(Sm)125mg/L和卡納霉素(Km)50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進行篩選，并挑取單克隆提取質粒進行酶切鑒定，得到陽性克隆。含表達載體的農桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Kra50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋,繼續(xù)培養(yǎng)到00600=0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成O.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉移到含100mg/LKm，500rag/LCar的MS培養(yǎng)基(0.5mg/LIAA，2.Omg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時將未轉化的組織同樣處理作為負對照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當抗性芽長到1-3cm時切下，轉到培養(yǎng)基中長莖。當莖長到3-5cm時，按照文獻(王關林，方宏筠，1998，科學出版社)的方法轉到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基中生根，結果如圖3所示，得到再生苗37株。以在抗性培養(yǎng)基上生根的轉化苗的葉片總DNA與未轉化的煙草葉片的總DNA為模板，在引物1:CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2:TACTGTCTTACGTTGGGTACG的引導下按常規(guī)方法進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖4所示，表明轉化苗樣品中產生一個約1700bp的片段，而未轉化煙草樣品則沒有該片段。初步證明4C11基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。3、轉基因煙草的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉基因煙草和非轉基因煙草的總DNA，以非轉基因煙草為對照，使用BamHI/Smal限制性內切酶在37度酶解3小時后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNa0H)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris—Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進行DNA轉膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時。取lugPCR得到的4CL1基因片段，加蒸餾水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42"C。預雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1呢SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC,0.1%SDS50。C清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100ral馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸，0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時。結果如圖5所示，表明轉基因煙草中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉基因煙草則沒有這條帶，證明該4CL1基因已經(jīng)插入轉基因煙草中。圖5中，CK為非轉基因煙草對照，l-4為轉基因煙草。4、轉基因煙草的Northern雜交按照常規(guī)方法提取轉基因煙草的總RNA，以非轉基因煙草為對照，進行變性瓊脂糖凝膠電泳。使用20XSSC進行RNA轉膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時。用lug由PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻，37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預熱雜交液(地高新試劑盒中自帶)至42'C。預雜交30min。取RNA探針煮沸5min，迅速放置與冰水中。將變性探針RNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡并封口、42°。過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS5(TC清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100ml馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置l小時。結果如圖6所示，表明在轉基因煙草中有明顯的雜交帶，而非轉基因煙草沒有，證明4CL1基因已經(jīng)在轉基因煙草中表達。圖6中，CK為非轉基因煙草，sample為轉基因煙草植株。5.轉基因煙草4CL1酶活性的測定轉基因煙草葉片和莖分別在液氮下粉碎，用提取緩沖液(0.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl2，5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4'C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標準曲線，對蛋白粗提液定量。lml酶反應液中包括.0.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(分別為4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液于24t:反應12分鐘，然后測定A333，A346，A35。的增加。每個樣品做3個平行實驗。結果如表l、表2、圖7a和圖7b所示，表明在轉基因煙草的葉中4CL1酶活性提高2-4倍，而在轉基因煙草的莖中4CL1酶活性提高40%-50%。在轉基因煙草的葉中4CL1酶活性增加比例比較多。但是轉基因煙草葉莖中4CL1酶活性的絕對增加量基本是相同的，說明在該系列的轉基因煙草中，4CL1酶在轉基因煙草各組織中得到大量而平均的表達。圖7a和圖7b中，CK為非轉基因煙草植株，1-9為轉基因煙草植株。表l.轉基因煙草葉中4CL1靡E活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2.轉基因煙草莖中4CL1酶活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6、轉35S-4CL1融合基因煙草的含水量、木質素及纖維素分布分析(1)轉35S-4CL1融合基因煙草的形態(tài)觀察在相同組織培養(yǎng)條件下成苗的轉35S-4CL1融合基因煙草植株和非轉基因煙草植株移栽入花盆中，在相同條件下培育45天，轉35S-4CL1融合基因煙草植株的苗高58.5cm，根長12.5cm，葉片數(shù)52枚，非轉基因煙草植株的苗高58.Ocm，根長15cm，葉片數(shù)48片。通過從移栽到煙草的開花、結籽整個生長發(fā)育過程的觀察及上面所測數(shù)據(jù)分析，轉基因植株與空白煙草植株(非轉基因植株)除形態(tài)表現(xiàn)正常外(圖8a和圖8b)，開花、結果的時間也沒有明顯的差異。因此，初步認為轉4CL1基因能夠有效調控木質素的生物合成而不影響植物的正常生長發(fā)育。(2)轉35S-4CL1融合基因煙草的根、莖、葉的含水量、木質素及纖維素含量轉35S-4CL1融合基因煙草的根、莖、葉的含水量、木質素及纖維素含量如表3、圖9所示，表明轉35S-4CL1融合基因煙草中根、莖、葉的含水量與空白相差不大，而木質素的含量分別高于空白煙草植株中的含量，而纖維素的含量變化則與之相反，這與上面對整株植株的比較結果相一致。圖9中，Trans表示轉35S-4CL1融合基因煙草，CK表示空白煙草(非轉基因)。表3.轉基因煙草與空白煙草的含水量、木質素及纖維素含量比較測定項目轉基因煙草空白煙草根莖葉根莖葉含水量(%)91.6588.2690.5591.8988.4191.08木質素含量a)6356.3534532.531變化量+18+23.822—————纖維素含量(%)3.2113.395.4115.1634.730.04變化量-11.85-21.31-24.63—一一(3)轉35S-4CL1融合基因煙草的木質素含量分布分析選取煙草根及莖段(每10cm—段)樣品，按由低到高的順序一次編號l,2,3，4，5，6，7。按照常規(guī)方法分別測定轉35S-4CL1融合基因煙草和空白煙草的木質素及纖維素含量，結果如表4、表5、圖10、表6、表7和圖11所示，表明轉35S-4CL1融合基因煙草的木質素含量隨其高度的增加而減少，而纖維素的含量則隨其高度的增加而增加，這可能是由于(1)植物中老組織的細胞比新生幼嫩組織的細胞要成熟，所以使得外源基因在組織中表達更充分些；(2)植物莖基部的木質部較發(fā)達，而新生嫩組織的木質部形成層還不成熟。由此形成木質素含量的連續(xù)降低趨勢和纖維素含量的連續(xù)增長趨勢。另外，在空白植株中也表現(xiàn)出同樣的遞增和遞減趨勢，但是在其木質素及纖維素含量上與轉基因植株有明顯差別表現(xiàn)在空白植株各部分的木質素含量相對于轉基因植株各部分的木質素含量要低，而纖維素含量則高些。圖10和圖11中，Trans表示轉35S-4CL1融合基因煙草，CK表示空白煙草(非轉基因)。表4.轉35S-4CL1融合基因煙木質素含量樣品號烘干前重(g)烘干后重(g)木質素重(g)木質素含量(%)11.88481.89110.00636321.96641.97320.00686831.90381.910.00626241.94071.94660.00595951.88431.88980.00555561.95861.96350.00494971.92111.92560.004545表5.空白煙草木質素含量樣品號烘千前重(g)烘干后重(g)木質素重(g)木質素含量(W11.92311.92760.004545<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2、培育木質素含量降低的轉基因煙草1、35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構建以按照常規(guī)方法提取的楊樹總DNA為模板，在引物FAN1:CTCTAGATTATATGCCTGCCAACTTTTC，F(xiàn)AN2:CCCCGGGATGGACGCCACAATGAATCCAC的引導下，按照如下循環(huán)程序94度5min;94度30sec，55度45sec，72度90sec，30個循環(huán)；72度10min進行PCR擴增，回收、純化PCR擴增產物，得到反義的4CL1基因片段，分別利用Xtei^6i/;a7酶切純化的PCR擴增產物和PUC18，然后進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質粒，得到亞克隆載體pUan4CL。35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構建過程如圖12a所示，具體步驟如下按照常規(guī)方法用1&//6)/;s/將反義4CL1基因(anti-4CL1)片段從亞克隆載體pUan4CL上切下，并與經(jīng)Jte//5fes/酶切的pBI121載體進行連接，獲得含有融合基因35S-反義4CL1基因的重組載體pBan4CL。用質粒pBan4CL按照常規(guī)方法轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選后，提取質粒按常規(guī)方法對質粒pBan4CL進行測序，結果表明反義4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于pBan4CL的5827bp-7463bp之間；序列表中的序列2由1637個堿基組成。2、煙草的轉化與鑒定分析按改進的An方法，直接轉化農桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進行篩選，并挑取單克隆提取質粒進行酶切鑒定，得到陽性克隆。含表達載體的農桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到OD600二0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到00600=0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成0.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉移到含100mg/LKm，500mg/LCar(羧卞霉素)的MS培養(yǎng)基(0.5mg/LIAA，2.0mg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時將未轉化的組織同樣處理作為負對照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當抗性芽長到l-3cra時切下，轉到培養(yǎng)基中長莖。當莖長到3-5cm時，按照文獻(王關林，方宏筠，1999，科學出版社)的方法轉到含有卡那霉素和羧芐霉素到生根培養(yǎng)基中生根，得到再生苗。以在抗性培養(yǎng)基上生根的轉化苗的葉片總DNA、pBan4CL質粒以及未轉化的煙草葉片的總DNA為模板，在引物Fanl—TTATATGCCTGCCAACTTTTC和Fan2—ATGGACGCCACAATGAATCCAC的引導下按常規(guī)方法進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖12b所示，表明轉化苗樣品中產生一個約1700bp的片段，而以未轉化植株為負對照的PCR產物在L7Kb處無條帶。證明反義4CL1融合基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。圖12b中，十ck為pBan4CL植物二元表達載體，一ck為未轉化煙草樣品，M為核酸分子量標準，Trans為轉35S-反義4CL1融合基因煙草樣品。3、轉基因煙草的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉基因煙草和非轉基因煙草的總DNA，以非轉基因煙草為陰性對照，以pBan4CL植物二元表達載體為陽性對照，使用vSs/sMA&al限制性內切酶在37度進行酶解3小時，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進行DNA轉膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時。用lugPCR制得得反義4CL1基因作為模板DNA加蒸餾水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH二8.0)，混勻。預熱雜交液(地高新試劑盒自帶)至42。C。預雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS50。C清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液(100ml馬來酸緩沖液(0,1M馬來酸，0.15MNaQ，pH7.5)中加入0.3mltween20)清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時。結果如圖13所示，表明轉基因煙草中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉基因煙草則沒有這條帶，證明該反義4CL1基因已經(jīng)插入轉基因煙草中。圖13中，CK為非轉基因煙草陰性對照，l為陽性對照pBan4CL植物二元表達載體，2-4為轉35S-反義4CL1融合基因煙草。4、轉35S-反義4CL1融合基因煙草中4CL1酶活性的測定轉基因煙草葉片和莖在液氮下粉碎，用提取緩沖液(0.2MTris-HC1pH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4'C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標準曲線，對蛋白粗提液定量。蛋白標準曲線的測定值如表8所示，得到的標準曲線如圖14所示。lml酶反應液中包括O.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl"0.8mMATP，0.lmM底物(分別為4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液，于24'C分別反應5、10、15、20、25、30、35分鐘，然后測定A，A346，A35。，得到如圖15a和15b所示的空白煙草對照和轉35S-反義4CL1融合基因煙草中4CL1酶活性曲線，表明4CL1酶在15min時的活性最高，因此，本研究在測定轉基因植株與空白植株中4CL1的活性時采用反應時間為15rain時的酶活性。而且轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株的4CL1酶活性明顯低于空白植株的酶活性。lml酶反應液和25-30ul粗提液，于24。C分別反應15分鐘測定A,A346，A350的減少。每個樣品做3個平行實驗。結果如表9和圖16所示，表明轉35S-反義4CL1融合基因煙草中的4CL1酶活性明顯低于空白煙草中的4CL1酶活性。圖16中，CK1，CK2和CK3為空白煙草植株，Samplel-Sample6為轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株。表8.蛋白標準曲線測定值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(1)從獲得的80多株轉35S-反義4CL1融合基因煙草植株中取5、6株，分別檢測了它們與空白煙草植株中木質素含量及纖維素含量變化，結果如圖17b和圖17c所示，表明轉基因煙草植株的木質素含量比空白植株平均下降了19.1%，同時，纖維素含量平均升高了11.4%。對實施例1中得到的6株轉35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株木質素與纖維素含量進行分析，結果如圖18a和圖18b所示，表明轉35S-4CL1融合基因植株的木質素含量比空白植株平均升高了36.83%，同時，纖維素含量平均下降了23.70%。通過對轉35S-4CL1融合基因、35S-反義4CL1融合基因煙草植株的分析發(fā)現(xiàn)，無論正義還是反義基因轉化獲得的轉基因植株木質素與纖維素之間均表現(xiàn)出相互補償?shù)年P系。即木質素含量在下降的同時，纖維素含量則有所上升；反之亦然。實施例3、培育木質素含量升高的轉基因毛白楊7411、毛白楊741的轉化將構建好的35S-4CLl植物二元表達載體pB4CL，按改進的An方法，直接轉化農桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進行篩選，并挑取單克隆提取質粒進行酶切鑒定，得到陽性克隆。含表達載體的農桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sra100rag/1，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到0D60(H).2-0.3。將毛白楊741無菌苗的葉片剪下，切成0.5-1.0cm的小塊，在菌液中浸泡IOmin，其間不斷搖動，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在毛白楊741葉片分化培養(yǎng)基上一MS培養(yǎng)基(0.lmg/LNM，1.0mg/LBA)，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉移到含100mg/LKm，250mg/LCar(羧卞霉素)的葉片分化MS培養(yǎng)基(0.lmg/LIAA，1.0mg/LBA)，28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時將未轉化的組織同樣處理作為負對照。每隔M天換一次培養(yǎng)基。當莖長到3-5cm時，轉到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(O.3mg/LNAA，1.Omg/LBA)中生根，結果得到再生苗14株。2、轉基因毛白楊741的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉基因毛白楊741和非轉基因毛白楊741的總DNA，以非轉基因煙草為對照，使用5)^I限制性內切酶在30度酶解10小時后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進行DNA轉膜過夜，用2XSSC洗膜，于80。C干燥2小時。用lug由PCR得到的4CL1基因片段作探針，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42t。預雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS50°C清洗2次，每次5min。用lOOml洗滌液一100ml馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸，0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時。結果表明轉基因毛白楊741中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉基因毛白楊741則沒有這條帶，證明該4CL1基因已經(jīng)插入轉基因毛白楊741中。3、轉基因毛白楊7414CL1酶活性的測定將一年生的轉基因毛白楊741葉片在液氮下粉碎，用提取緩沖液(O.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶月太(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4。C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標準曲線，對蛋白粗提液定量。lml酶反應液中包括.0.2MTris-HCl，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24'C反應12分鐘，然后測定A333的增加。每個樣品做3個平行實驗。結果如表ll所示，表明轉基因毛白楊741的葉片的4CL1酶活性有所增加。表11.轉基因毛白楊741葉片中4CL1酶活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4、轉35S-4CL1融合基因毛白楊741葉片的木質素、纖維素分析按照文獻(willis.A.lignin.MethodsinEnzymology，1988，161;13-30)描述的方法測定了一年生轉基因毛白楊741與空白毛白楊741植株的硫酸木質素及纖維素含量，結果如表12所示，表明35S啟動的毛白楊7414C11基因在穩(wěn)定表達的轉基因毛白楊741中，可以改變轉基因毛白楊741葉片的木質素和纖維素含量。表12.轉基因毛白楊741葉片木質素、纖維素分析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例4、培育木質素含量降低的轉基因毛白楊7411、毛白楊741的轉化按改進的An方法，將實施例2中構建好的35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL直接轉化農桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進行篩選，并挑取單克隆提取質粒進行酶切鑒定，得到陽性克隆。含表達載體的農桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(SmlOOmg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到0D600二0.2-0.3。將毛白楊741無菌苗的葉片剪下，切成0.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡IOmin，其間不斷搖動，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在毛白楊741葉片分化培養(yǎng)基上一MS培養(yǎng)基(0.lmg/LNAA，l.Omg/LBA)，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉移到含lOOmg/LKm,250mg/LCar(羧卞霉素)的葉片分化MS培養(yǎng)基(0.lmg/LIAA，l.Omg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時將未轉化的組織同樣處理作為負對照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當莖長到3-5cm時，轉到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(O.3mg/LNAA，1.Omg/LBA)中生根，結果得到再生苗19株。2、轉基因毛白楊741的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉基因毛白楊741和非轉基因毛白楊741的總DNA，以非轉基因煙草為對照，使用5i^I限制性內切酶在30度酶解10小時后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進行DNA轉膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時。用lugPCR得到的反義4CL1基因片段作探針，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42X:。預雜交30min。取DNA探針(25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42"C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS5CTC清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100mlMaleicacidbuffer(0.1MMaleticacid0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse,封口，夾X光片，室溫放置l小時。結果表明轉基因毛白楊741中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉基因毛白楊741則沒有這條帶，證明反義4CL1基因已經(jīng)整合到轉基因毛白楊741中。3、轉35S-反義4CL1融合基因毛白楊741中4CL1酶活性的測定將一年生的轉基因毛白楊741葉片在液氮下粉碎，用提取緩沖液(O.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Le叩印tin))提取，提取液在18000g、4。C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標準曲線，對蛋白粗提液定量。lml酶反應液中包括.O.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24'C反應12分鐘，然后測定A333的增加。每個樣品做3個平行實驗。結果如表13所示，表明轉35S-反義4CL1融合基因毛白楊741中的4CL1酶活性明顯低于空白毛白楊741中的4CL1酶活性。表13.轉基因毛白楊741與空白毛白楊741植株中4CL1酶活性測定值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>4、一年生轉基因毛白楊741，樹干的樹皮和木質部的含水量、木質素及纖維素含量測定按照文獻(willis.A.lignin.MethodsinEnzymology，1988，161;13-30)描述的方法測定了一年生轉基因毛白楊741與野生毛白楊植株的含水量、硫酸木質素及纖維素含量，結果如表14所示，表明轉基因毛白楊741木質部和樹皮的含水量和木質素含量均低于野生毛白楊相應部位，轉基因毛白楊741木質部的纖維素含量低于野生毛白楊的木質部，轉基因毛白楊741樹皮的纖維素含量高于野生毛白楊的樹皮。表14.一年生轉35S-反義4CL1融合基因毛白楊741的含水量、木質素及纖維素分布分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>a^gitcttaatgaccctgaggcaacctcaagaacaatagacaaagaaggatggctgcacac1260aggcgatatcggctacattgatgatgatgatgagcttttcatcgttgacagattgaagga1320attgatcaagtataaagggtttcaggttgctcctgctgaactcgaagctttgttaatagc1380ccatccagagatatccgatgctgctgtagtaggattgaaagatgaggatgcgggagaagt1440tcctgttgcatttgtagtgaaatcagaaaagtctcaggccaccgaagatgaaattaagca1500gt3tatttc3aaacaggtgatattctacaagagaataaaacgagttttcttcattgaagc1560tattcccaaggcaccatctggcaagatcctgaggaagaatctgaaagaaaagttggcagg1620catataactgaagatgttactgaacatttaatcctctgtcttatttctttaatacttgag1680eiatc3ttgt3gtgttgaaccaagcatgcttggaaaagacacgtacccaacgtaagacagt174031741<210>2〈211〉1637〈212〉腿〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2ctctagattatatgcctgccaacttttcttgtgccttgggaatagcttcaatg犯gaaaagttttgaaatatactgcttaatttcatcttcaaatgcaacaggaacttctcccgcatcctatatctctggatgggctatt犯caaagctttatacttgatcaattccttc3atctgtc3aagccgatatcgcctgtgtgcagccatccttggtcattaagatatcctttcatgatctgattcctcggtagagaggcccctgtttctgggtcagtcccacatgcacctggttttatgtcgacteigaac3ggtcctgcctcggtcattccattagctctgacagtatcttcaagttccttgctcaaagaagacaagtcatgcttgtcaagattcagattcttcctcaggatcttgccagatg60ctcgttttattctcttgtagaatatcacct120cggtggcctgagacttttctgatttcacta180catxtttcaatcctactacagcagcatcgg240cgagttcagcaggagcaacctgaaaccctt300cgatgaaaagctcatcatcatcatcaatgt360ctttgtctattgttcttgaggttgcctcag420caccccggatgcagatctcaccaggctggt480caacaatcttcatctctgceittcctgacta540atggttccttggcaaatgccaagcacattg600atccctgaccaagtctagcctgaggaaact660ccaatggagcccctccagattttatcatcc了20caggtgacttagcaa/ttgacatcatcacag780gtggaacaaccggtgctatagataccttgtacttctcaatcaatcccagtaaagaaccaa840tctcaaactttggcattatcaaaatcggggcaccgactctcagcccgcagagcattattg900aattcagagcatagettatggaacataggcagcacacacagaatcacatcttcactgtgaa960aatacaggttaggattgtctccatctacctgttgagcaacactggttattagccctttgt1020gcgttaacatgaccccttttggcaaccctgtagtccctgatgaataaggcaatgctacga1080catcatcgggactaatgtcgacctgaggcgcttcattttcgtctgcctgtgttagctctg1140aaaagtgcaagcatccatccggggcagagtccacgcacatgaccttaacatcactttctc1200gggcaaaatctttaaccttctcgtagtaacaagcctgtgttatcagaagctttgctctcg1260aggccttggcatgttttgctagctctgcaggggtggagaaaggattggcagcagtgataa1320tggcacctctgtgtgaagcgcctaggaaagcaagcacgaattcaggtgaacttggtagga1380agagcatgatcacgtcaccttgttgaataccaatcttgttcagaccagaagcaactcttc1440ttgctgtgagctcaacgtcagcataggtgtagacatctccattcgcgccatttatcaggc1500aaggttttgatgaatggttagacaagttttcaagaacgtatgaatgcaggggaaggtttt1560tcgggatgtagatgtctggtaattttgagcgaaagatgaattcttcttgtggattcattg1620tggcgtccatcccgggg163權利要求1、一種調控植物木質素含量的方法，是將含有反義4CL1基因的表達載體轉化植物，得到木質素含量降低的植物。2、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述反義4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。3、根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于用于構建所述含有反義4CL1基因的表達載體的出發(fā)載體為Ti類質粒載體和病毒載體。4、根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述出發(fā)載體為Ti類質粒載體。5、根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述Ti類質粒載體為雙元載體。6、根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述雙元載體為pBI121。7、根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述含有反義4CL1基因的表達載體為pBan4CL。8、根據(jù)權利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。9、根據(jù)權利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述轉化方法為農桿菌介導轉化法、基因槍介導轉化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農桿菌介導轉化法。全文摘要本發(fā)明公開了一種調控植物木質素含量的方法。本發(fā)明所提供的調控植物木質素含量的方法，是將含有4CL1基因的表達載體轉化植物，得到木質素含量升高的植物；將含有反義4CL1基因的表達載體轉化植物，得到木質素含量降低的植物。本發(fā)明通過在植物細胞中用載體引入4CL1基因或反義4CL1基因，來生產木質素含量升高或降低的轉基因植物特別是轉基因樹木，為培育木質素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。文檔編號C12N15/82GK101319227SQ20081012646公開日2008年12月10日申請日期2004年7月22日優(yōu)先權日2004年7月22日發(fā)明者蔣湘寧,趙艷玲,海陸,陳雪梅申請人:北京林業(yè)大學