專利名稱：通過(guò)同源重組在人細(xì)胞中生產(chǎn)人突變蛋白的制作方法
通過(guò)同源重組在人細(xì)胞中生產(chǎn)人突變蛋白
本申請(qǐng)是專利申請(qǐng)?zhí)?8807438. 9，申請(qǐng)日1998年07月22日的同 名專利的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種通過(guò)同源重組在真核細(xì)胞中生產(chǎn)真核多肽的突變蛋 白的方法。本發(fā)明另外還涉及一種生產(chǎn)人細(xì)胞的方法，所述人細(xì)胞適合 生產(chǎn)人突變蛋白。最后，本發(fā)明涉及通過(guò)所述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞和可從 其獲得的突變的人蛋白質(zhì)以及含這些突變蛋白的藥物制劑。
重組人蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)是生物技術(shù)領(lǐng)域中已知的。這樣獲得的蛋 白質(zhì)可用作治療劑。通過(guò)缺失、添加或/和取代個(gè)別的氨基酸或整個(gè)肽片 段生產(chǎn)突變的人蛋白質(zhì)(它們不同于相應(yīng)的天然人蛋白質(zhì))的重組生產(chǎn)方 法也是已知的。
尤其在藥物應(yīng)用方面常需要在真核細(xì)胞中生產(chǎn)人多肽，因?yàn)榕c在原 核細(xì)胞例如大腸埃希氏菌(E. coli)中生產(chǎn)的多JIM目比，這些多肽被糖基 化了，因而與在體內(nèi)內(nèi)源性地出現(xiàn)的多肽差別較小，于是更不常觀察到 不希望的副作用(例如增大的免疫原性或較差的耐受性)的出現(xiàn)。
以前已通過(guò)異源重組基因表達(dá)生產(chǎn)了突變的人蛋白質(zhì)。為此，將核 酸構(gòu)建物引入所期望的真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞含有在啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記 基因的控制下編碼所述突變多肽的核酸序列。在該方法中，所述核酸構(gòu) 建物被位點(diǎn)非特異性地整合入所述細(xì)胞的基因組。
在該異源重組基因表達(dá)中，可能由于位點(diǎn)非特異性整合而經(jīng)常出現(xiàn) 不希望的、不利的過(guò)程。例如，在整合入基因組的過(guò)程中可能在編碼蛋 白質(zhì)的序列中出現(xiàn)突變且尤其是缺失。此外，所述整合可能在基因組中 順式元件所處的位點(diǎn)上進(jìn)行，該順式元件對(duì)核酸構(gòu)建物的表達(dá)控制序列 有阻抑效果，結(jié)果獲得的細(xì)胞重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率減少了。表達(dá)構(gòu)建物整合 入所述細(xì)胞的重要基因或者導(dǎo)致該細(xì)胞死亡，或者導(dǎo)致有機(jī)能障礙的重 組細(xì)胞，它尤其會(huì)導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率的減少。
插入也能導(dǎo)致以這種方式獲得的細(xì)胞穩(wěn)定性的降低，于是在長(zhǎng)時(shí)間 后它們失去其表達(dá)重組蛋白質(zhì)的能力。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種在穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞中以良好的產(chǎn)率 生產(chǎn)糖基化真核多肽的糖基化的方法，所i^l基化盡可能與天然蛋白的 糖基化相似，所以至少部分地消除了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。
該目的是按本發(fā)明通過(guò)生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法實(shí)現(xiàn)的，其
中
(i) 將一種能同源重組的核酸分子引入含編碼內(nèi)源性乾多肽的靼核 酸序列的真核細(xì)胞，所述核酸分子包括
(a) 至少一M列片段，該序列片段與所述靼核紗列的基因 座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性乾核酸序列相 比，在成熟多肽的編碼區(qū)具有突變，以及
(b) —段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，
(ii) 將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培 養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靼多肽的突變蛋白的突變乾核 醋列，
(iii) 選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及
(iv) 從所述細(xì)胞或/和細(xì)胞上清液分離突變蛋白。 突變的真核蛋白質(zhì)(尤其是突變的人蛋白質(zhì))可通過(guò)本發(fā)明的方法在
同源細(xì)胞中生產(chǎn)。意外地，這使得能以高產(chǎn)率獲得具有與天然蛋白質(zhì)4艮 相似的糖基化型式的突變蛋白。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，蛋白質(zhì)可 在真核細(xì)胞中被突變，并且通過(guò)該細(xì)胞合成的突變蛋白與內(nèi)源性地出現(xiàn) 的細(xì)胞蛋白質(zhì)相似。本發(fā)明方法進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)在于，生成的細(xì)胞(該細(xì)胞 生產(chǎn)突變蛋白)的性能不因位點(diǎn)非特異性基因整合而被不利地改變。因 此，該細(xì)胞的基因組除了待表達(dá)蛋白質(zhì)的基因座以外未以任何方式改變， 于是排除了相關(guān)的不利效果。
通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的人突變蛋白由于缺失、添加或/和取代個(gè)別 的氛基酸或整個(gè)肽片段而不同于相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)。優(yōu)選生產(chǎn)的突變蛋 白在N端和/或C端具有突變，例如缺失、插入、取代或/和與其它蛋白
質(zhì)(例如人蛋白質(zhì))融合。
本發(fā)明的突變蛋白優(yōu)選是非天然存在的多肽，并且與待突變的多肽 的等位基因變異(這在其它起始細(xì)胞中是天然出現(xiàn)的)不同之處在于至少
一個(gè)氨基酸不同。非天然的突變蛋白特別優(yōu)選地由于缺失、添加或/和插 入個(gè)別的M酸或肽片段而不同于天然的等位基因變異。
應(yīng)用于本發(fā)明方法中的細(xì)胞是任意的真核細(xì)胞，它具有待突變的靶 基因的至少一個(gè)內(nèi)源性拷貝。該細(xì)胞優(yōu)選是人細(xì)胞，特別優(yōu)選是無(wú)限增
殖4匕人細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞或HT 1080細(xì)胞。
意外地發(fā)現(xiàn)了，當(dāng)應(yīng)用的起始細(xì)胞含增大數(shù)量的染色體(乾基因處于 其上)時(shí)，可通過(guò)同源重組生產(chǎn)細(xì)胞，與只含兩個(gè)拷貝的耙基因的細(xì)胞相 比，該細(xì)胞生產(chǎn)增大產(chǎn)率的突變的人蛋白質(zhì)。這類起始細(xì)胞的實(shí)例是具 有基因重排的腫瘤細(xì)胞系，例如HeLaS3(Puck等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.) 103 (1996)， 273 ~ 284)和Namalwa (Nadkarni等，癌(Cancer)， 23 (1969)， 64~79)，它們含增大的染色體7拷貝數(shù)。
可進(jìn)行突變耙基因的內(nèi)源基因激活以進(jìn)一步改善突變多肽的表達(dá)。 為此，可將另外的積極地影響表達(dá)產(chǎn)率的序列引入基因組，其中例
替代:該2源表達(dá)控制i列可能含一個(gè)異源i動(dòng)子或/和增強(qiáng)子，:亥異源
表達(dá)控制序列優(yōu)選含一個(gè)病毒啟動(dòng)子，尤其是CMV啟動(dòng)子。當(dāng)應(yīng)用合適 的啟動(dòng)子時(shí)，內(nèi)源啟動(dòng)子的替代不但能使表達(dá)增強(qiáng)，還容許合成突變蛋 白。所述異源啟動(dòng)子可以是可調(diào)啟動(dòng)子或構(gòu)建型啟動(dòng)子。此外，該啟動(dòng) 子可用于鈍化對(duì)內(nèi)源啟動(dòng)子有阻抑效果的順式元件。這還可導(dǎo)致產(chǎn)率的 增大。
被虧1入起始細(xì)胞的核酸分子包括至少一M列片段，該序列片段容 許在靶基因的基因座中通過(guò)同源重組整合，并且適合將突變引入成熟靶 多肽的編碼區(qū)。所述核酸分子優(yōu)選含兩個(gè)側(cè)翼序列，它們與耙基因座的 區(qū)域是同源的。該側(cè)翼序列優(yōu)選各自具有至少150bp的長(zhǎng)度并且含編碼 成熟耙多肽的耙基因座序列的區(qū)域，該序列與天然序列相比被修飾了 。
此外，所述核酸分子含一種選擇標(biāo)記基因。這可以是真核細(xì)胞的任
意合適的選擇標(biāo)記基因，它導(dǎo)致在表達(dá)時(shí)的可選擇表型，例如抗生素抗 性、輔源營(yíng)養(yǎng)，表面蛋白的表達(dá)等。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因是特別優(yōu)選 的選擇標(biāo)記基因。
此外，所述核酸分子可以任選地含一種負(fù)選擇標(biāo)記基因，例如HSV 胸苷激酶基因，在選擇劑的存在下，它的表達(dá)破壞細(xì)胞。
如果希望在細(xì)胞中擴(kuò)增修飾的乾基因，則所述核酸分子含一種擴(kuò)增 基因。合適的擴(kuò)增基因的實(shí)例有二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸 脫羧酶等。二氫葉酸還原酶基因是特別優(yōu)選的擴(kuò)增基因。
當(dāng)存在擴(kuò)增基因時(shí)，可在同源重組后擴(kuò)增突變耙核酸序列以便增大 細(xì)胞中的拷貝數(shù)。
本發(fā)明的方法能使應(yīng)用的細(xì)胞基因組中存在的全部?jī)?nèi)源性基因突 變。所述粑核酸序列優(yōu)選是組織纖溶酶原激活物(tPA)、促紅細(xì)胞生成素、 胰島素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體序列。通過(guò)本發(fā) 明的方法獲得的突變蛋白特別優(yōu)選是一種其生物性質(zhì)與相應(yīng)的天然蛋白 質(zhì)的性質(zhì)不同的多肽，例如得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽 (EP 0 382 174)。
可應(yīng)用已知技術(shù)分離所述突變蛋白。該突變蛋白優(yōu)選是從在懸浮液 中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。可在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)于大規(guī)模生 產(chǎn)是特別有利的。這大為簡(jiǎn)化了在生產(chǎn)過(guò)程中所需的培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 這導(dǎo)致大為節(jié)省生產(chǎn)時(shí)間和生產(chǎn)資源，于是顯著減少了費(fèi)用。所述突變 蛋白特別優(yōu)選是從在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。與存 在血清時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞相比，從無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞可以更簡(jiǎn)便、 更廉價(jià)地分離突變蛋白，因?yàn)樾枰俚募兓襟E。
本發(fā)明進(jìn)一步的主^SA可通過(guò)前述方法之一^v細(xì)胞獲得的突變的 人多肽，其特征在于A^I基化和不存在所述物種的外源多肽。"不存在 所述物種的外源多肽"表示相對(duì)于所需蛋白質(zhì)的量來(lái)說(shuō)少于3w"/。的所述 物種的外源多肽雜質(zhì)，優(yōu)選少于lwt%，最優(yōu)選少于0. lwt%。
本發(fā)明進(jìn)一步的主題是生產(chǎn)一種表^靶多肽的突變蛋白的人細(xì)胞 的方法，其特征在于
(i)將一種核酸分子與1入含編碼內(nèi)源性靶多肽的M,列的人細(xì) 胞，所述核酸分子包括
(a) 至少一^列片段，該序列片段與所述靼核紗列的基因 座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相 比，在成熟耙多肽的編碼區(qū)具有突變，
(b) 任選地一種所述乾核酸序列的異源表達(dá)控制序列，以及
(c) 一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，
(i i)將所述細(xì)胞在l吏得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培 養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變耙核 醋列，
(iii) 選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及
(iv) 分離這樣選擇的細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子另外還含一種擴(kuò)增基因， 并且所述突變把核酸序列在同源重組后,皮擴(kuò)增了 。
本發(fā)明又一主題是可通過(guò)前述方法獲得的人細(xì)胞，它含至少一個(gè)編 碼突變的人多肽的內(nèi)源基因。
本發(fā)明的細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并且它優(yōu)選是在懸浮液 中生長(zhǎng)的細(xì)胞，特別優(yōu)選是在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞。
本發(fā)明又一主題是通過(guò)前述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞在生產(chǎn)人多肽的突變 蛋白方面的應(yīng)用。
本發(fā)明又一主M—種藥物制劑，其特征在于，它含作為活性物質(zhì) 的前述突變蛋白，以及任選含其它活性物質(zhì)或/和常規(guī)藥物載體、輔助物 質(zhì)或添加劑。
實(shí)施例
含K2域和P域的t-PA突變體的構(gòu)建 a)載體構(gòu)建
導(dǎo)向載體包括如下元件(按5' -3'順序列出) A: 6kb Bgin片段，它含約3. 5kb的t-PA基因5'上游區(qū)(Friezner 等，1986，生物化學(xué)雜志(JBC) 261 (15): 6972)。B:大約5.2基因激活序列(作為Agel片段)，它含處于RSV啟動(dòng)子 和作為終止子的SV40的晚期聚腺苷酸化位點(diǎn)控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶(NE0)基因，編碼鼠二氬葉酸還原酶(DHFR)的精氨酸突變體(Simonsen 等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院才艮(Proc.Natl. Acad, Sci. USA) 80 (1983) ， 2495) 的基因，該基因受早期SV40啟動(dòng)子和作為終止子的早期SV40聚腺苷酸 化位點(diǎn)(Kaufmann等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol.)， 2 (1982)， 1304; 0kayama等，分子細(xì)胞生物學(xué)，3 (1983)， 280以及Schimke，生 物化學(xué)雜志(J， Biol. Chem.), 263 (1988)， 5989)和巨細(xì)胞病毒(CMV) 啟動(dòng)子(Boshart等，細(xì)胞(Cell)， 41 (1995)， p21)的控制。
C:從t-PA cDM分離的大約200bp片段，它相應(yīng)于核普酸位置l-199，并且它含信號(hào)序列的編碼區(qū)和成熟t-PA的最先三個(gè)氨基酸 (Pennica等,1983,自然(Nature) 301: 214)。
D:大約1.5kb EcoRI片段，它含tPA基因的內(nèi)含子G的大部分 (Friezner等，在上面所引的文獻(xiàn)中，Ny等,1984， PNAS， 81: 5355)。
這些元件是從合適的起始原料分離的，并且是通過(guò)PCR和適當(dāng)?shù)娜?合PCR引物裝配的。接著將融合的元件連接入pBR322并引入大腸埃希氏 菌。還可將所述片段從相應(yīng)的起始原料切割下來(lái)再通過(guò)接頭連接。
b)人細(xì)胞系
將HeLa用作進(jìn)行內(nèi)源性基因激活的細(xì)胞系，其中證實(shí)t-PA基因的 轉(zhuǎn)錄可通過(guò)添加醋酸佛波豆蔻酯來(lái)誘導(dǎo)(Waller和Schleuning, 1985， 生物化學(xué)雜志，260: 6354)。在通過(guò)電穿孔法引入導(dǎo)向載體后，通過(guò)添 加G418選擇含該栽體的細(xì)胞。通過(guò)用能檢測(cè)所需多肽的表達(dá)的 ELISA (Imubind-Total tPA， American Diagnostics)領(lǐng)'J試所述細(xì)胞的上 清液鑒定由于同源重組而分泌了具有t-PA的K2域和P域的多肽的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法，其中(i)將一種能同源重組的核酸分子引入含編碼內(nèi)源性靶多肽的靶核酸序列的真核細(xì)胞，所述核酸分子包括(a)至少一段序列片段，該序列片段與所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的編碼區(qū)具有突變，以及(b)一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(ii)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變靶核酸序列，(iii)選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv)從所述細(xì)胞或/和細(xì)胞上清液分離突變蛋白。
2. 權(quán)利要求l的方法， 其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞是HeLa細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞或HT 1080細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求1 3之一的方法， 其中應(yīng)用了在復(fù)染色體上含靼核酸序列的起始細(xì)胞。
5. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中另外，所述靼核^列的表達(dá)是通過(guò)引入異源表達(dá)控制序列而激活的。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述異源表達(dá)控制序列是病毒啟動(dòng)子，并且特別是CMV啟動(dòng)子。
7. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中所述編碼選擇標(biāo)記的核酸片段是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
8. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中所述被引入細(xì)胞的核酸分子另外還含一種擴(kuò)增基因，并且所述突變 靼核酸序列在同源重組后被擴(kuò)增了 。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中二氫葉酸還原酶基因被用作擴(kuò)增基因。
10. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中所述耙核酸序列是組織纖溶酶原激活物(t-PA)、促紅細(xì)胞生成素、 胰島素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體序列。
11. 權(quán)利要求1 9之一的方法，其中所述突變蛋白是得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽。
12. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中所述突變蛋白是從在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。
13. 前述權(quán)利要求之一的方法， 其中所述突變蛋白是從在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。
14. 可通it^利要求1 ~ 13之一的方法v^A細(xì)胞獲得的突變的人多 肽，其特征在于A^t基化和不存在所述種的外源多肽。
15. 生產(chǎn)一種表達(dá)人靶多肽的突變蛋白的人細(xì)胞的方法， 其中 (i)將一種核酸分子《1入含編碼內(nèi)源性耙多肽的M酸序列的人細(xì) 胞，所述核酸分子包括(a) 至少一M列片段，該序列片段與所述靼核紗列的基因 座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性乾核^列相 比，在成熟靼多肽的編碼區(qū)具有突變，(b) 任選地一種所述M酸序列的異源表達(dá)控制序列，以及(c) 一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(i i)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的M下培 養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)耙多肽的突變蛋白的突變靼核 餅列，(iii) 選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv) 分離這樣選擇的細(xì)胞。
16. 權(quán)利要求15的方法， 其中所述核酸分子另外還含一種擴(kuò)增基因，并且所述突變靶核酸序列在 同源重組后被擴(kuò)增了。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中二氬葉酸還原酶基因被用作擴(kuò)增基因。
18. 可通過(guò)權(quán)利要求15~17之一的方法獲得的人細(xì)胞，它含至少一 種編碼突變的人多肽的內(nèi)源性基因。
19. 權(quán)利要求18的人細(xì)胞在生產(chǎn)人多肽的突變蛋白方面的應(yīng)用。
20. 藥物制劑， 其中它含有作為活性物質(zhì)的、權(quán)利要求14的突變蛋白以及任選含其它活 性物質(zhì)或/和常規(guī)藥物載體、輔助物質(zhì)或添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)同源重組在真核細(xì)胞中生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法。本發(fā)明另外還涉及一種生產(chǎn)人細(xì)胞的方法，所述人細(xì)胞適合生產(chǎn)人突變蛋白。最后，本發(fā)明涉及通過(guò)所述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞和可從其獲得的突變的人蛋白質(zhì)以及含這些突變蛋白的藥物制劑。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101348789SQ20081013004
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月23日
發(fā)明者A·斯特恩, K·霍諾德 申請(qǐng)人:羅切診斷學(xué)有限公司