專利名稱：：病毒純化方法病毒純化方法本申請為于2001年9月25日提交的發(fā)明名稱為"病毒純化方法"的200580005682.4號中國發(fā)明專利申請的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于從宿主細(xì)胞中純化病毒、特別是純化重組腺病毒的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：病毒，無論是天然發(fā)生的還是其重組形式的，均可用于疫苗接種和基因治療領(lǐng)域。許多病毒或者病毒樣顆?？梢园踩行У卦谒拗骷?xì)胞中增殖(見例如WO01/38362，其描述了各種病毒在宿主細(xì)胞El永生化的視網(wǎng)膜細(xì)胞中的增殖)。重組腺病毒是用于基因治療和疫苗接種的一類優(yōu)選的病毒載體。這些重組腺病毒通常至少在E1區(qū)域具有缺陷，并在提供E1區(qū)域的互補細(xì)胞(例如293細(xì)胞)或者El-永生化的視網(wǎng)膜細(xì)胞如PER.C6W細(xì)胞中增殖(見例如美國專利5,994,128)。病毒在宿主細(xì)胞中增殖之后，基本上對于所有應(yīng)用，在進一步應(yīng)用之前均需要從宿主細(xì)胞中純化病毒。國際專利申請WO98/22588描述了生產(chǎn)和純化腺病毒載體的方法。所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞、用腺病毒感染所述宿主細(xì)胞、收獲并裂解宿主細(xì)胞、濃縮粗制裂解物、更換所述粗制裂解物的緩沖液、用核酸酶處理該裂解物、以及使用層析進一步純化病毒。一些其它出版物描述了從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，大多數(shù)注重使用特異性層析基質(zhì)從宿主細(xì)胞裂解物中純化病毒，見例如美國專利6,008,036、6，586，226、5,837,520、6,261,823、6,537,793和國際專利申請WO00/50573、WO02/44348和WO03/078592所述。大多數(shù)所述方法應(yīng)用核酸酶處理步驟降解DNA雜質(zhì)。盡管一些方法描述了不同的層析基質(zhì)，但仍需要從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中純化病毒的替代及優(yōu)選改良方法。本發(fā)明提供了這樣的方法。附圖描述圖1:已知的收獲細(xì)胞方法(T/B)與本發(fā)明的方法(B/T)的示意圖，見實施例1所述。T:Triton，B:Benzonase，p.i.:感染后。圖2:在T/B及B/T方法(示意圖見圖l)后澄清除去宿主細(xì)胞蛋白。圖中示出了5個單獨純化的處理中樣品(inprocesssamples)的銀染SDS-PAGE(4-12%bis-trisNuPAGE,Invitrogen)分析(樣品見實施例1和表1所述)。第2組來自T/B收獲方法，其中裂解后加入核酸酶；第3—7組來自B/T收獲方法，其中核酸酶在裂解之前加入。將收獲物(泳道1)通過0.5pmClarigard濾膜(泳道2)澄清，隨后用0.8/0.45Sartopore2濾膜(泳道3)過濾。M:標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。圖3:在處理期間用高鹽滲濾除去組蛋白(見實施例2)。圖中示出了銀染SDS-PAGE。A.滲透物，樣品l:初始滲透物;2:4x濃度之后;3:第l個DFV0.3MNaCl;4:第3個DFV0.6MNaCl;5:第4個DFV0.6MNaCl;6:第5個DFVl.OMNaCl;7:第6個DFV1.0MNaCl;8:第7個DFV0.3MNaCl;9:第9個DFV0.3MNaCl。M:標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。B.滲余物，樣品l:起始樣品，2:4x濃度之后；3:第l個DFV0.3MNaCl;4:第2個DFV0,6MNaCl;5:第6個DFV0.6MNaCl;6:第7個DFVl.OMNaCl;7:第8個DFV1.0MNaCl;8:第9個DFV0.3MNaCl;9:第9個DFVmillex(樣品8的0.22nm過濾物)。M:標(biāo)記物，以kD表示的Mw在旁邊示出。圖4:本發(fā)明優(yōu)選方法的示意圖(見實施例1)。圖5:從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)(見實施例3實驗3.1詳述)。圖中示出銀染SDS-PAGE(4-12%bis-trisNuPAGE,Invitrogen)。A:起始材料，B:與1%Tween20溫育，C:與2.5MNaCl溫育。箭頭表示NP。圖6:從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白的實驗(見實施例3實驗3.3詳述)。圖7:從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的非還原SDS-PAGE(第1組)和Western印跡(第2組)分析(見實施例3實驗3.3詳述)。泳道A、B、C分別含有產(chǎn)物A、B和C(見圖6和實驗3.3所述)。對于Western印跡分析，使用識別NP的抗體。箭頭表示NP。圖8:從重組病毒中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的RP-HPLC分析。對產(chǎn)物A、B和C進行分析。詳見實施例3實驗3.3所述?？v軸是AU(X1(T3)。在橫軸(洗脫時間)下，箭頭l表示異己酮蛋白的峰，箭頭2表示NP的峰。圖9:示出使用高鹽和過濾從重組病毒制備物中除去埃博拉病毒核蛋白的SDS-PAGE(A組)和Western印跡(B組)分析。在陰離子交換層析后，將樣品用含有5MNaCl的溶液進行緩沖液更換。將樣品直接經(jīng)過0.45nmMillipac20濾膜(Millipore)過濾。泳道1:過濾之前，泳道2:過濾之后。對于Western印跡分析，使用識別NP的抗體。箭頭表示NP。圖10:加樣于Q-XL柱(A組)和帶電濾膜(B組)上的Ad35TFF滲余物的層析圖。B組中的圓圈表示額外的峰，其僅分離自使用帶電濾膜的病毒峰。圖11:帶電濾膜層析的兩種級分的圓盤離心分析。A組示出Ad35病毒峰的沉降模式圖，B組示出額外峰的沉降模式圖(圖10中的圓形所示)。圖12:層析級分Ad35的SDS-PAGE分析(見實施例6)。4一12%bis-tris凝膠用銀染色。凝膠A示出帶電濾膜級分的電泳。1:標(biāo)記物，2:起始物，3:流經(jīng)液，4:峰1(圖10中圓形所示)，5:Ad35峰。凝膠B示出Q-XL級分的電泳。1:起始物，2:流經(jīng)液，3:Ad35峰。發(fā)明描述本發(fā)明提供了一種從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)感染病毒的宿主細(xì)胞，b)向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶，c)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述病毒的裂解物。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法進一步包括d)澄清所述裂解物。在更優(yōu)選的實施方案中，所述方法進一步包括e)優(yōu)選使用至少一個層析步驟進一步純化所述腺病毒。本發(fā)明的方法與迄今為止己揭示的方法最重要的差別是在那些方法中是在細(xì)胞裂解之后或者在純化過程的較晚階段加入核酸酶。根據(jù)本發(fā)明，核酸酶是在細(xì)胞裂解之前加入。如本發(fā)明所揭示，現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致優(yōu)于僅在細(xì)胞裂解之后加入核酸酶的方法的改良。在本發(fā)明的方法中，與在細(xì)胞裂解之后加入核酸酶的方法相比，得自本發(fā)明這種方法的純化的病毒批次含有較少的宿主細(xì)胞DNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是重組腺病毒。在一個實施方案中，步驟b)使用的核酸酶是benzonase。在一個實施方案中，裂解宿主細(xì)胞的步驟(步驟c)使用去污劑進行，在一個實施方案中所述去污劑是Triton-X100。在一個實施方案中，裂解物的澄清(步驟d)包括深層過濾(depthfiltration)和膜過濾。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述膜過濾使用孔徑大小為0.8pm和0.45pm的濾膜組合進行，例如使用包含孔徑大小為0.8pm和0.45pm的兩個不對稱聚醚砜濾膜的組合濾膜，如Sart0p0re-2組合濾膜。在一個實施方案中，將澄清的裂解物(得自步驟d)進行超濾和/或滲濾。在一個優(yōu)選的實施方案中，滲濾導(dǎo)致針對包含0.8—2.0MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液的緩沖液更換(bufferexchange)。在某些優(yōu)選的實施方案中，病毒的進一步純化(步驟e)包括陰離子交換層析。在另一個實施方案中，所述病毒的進一步純化(步驟e)包括大小排阻層析步驟，優(yōu)選以組分離模式(groupseparationmode)進行。在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟e)同時包括陰離子交換層析和大小排阻層析。在本發(fā)明的某些實施方案中，澄清的裂解物和進一步純化的病毒(得自步驟d)處于沒有去污劑、氯化鎂和蔗糖的緩沖液中。另一方面，本發(fā)明提供了包含選自如下一組轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒批次埃博拉病毒(Ebola)核蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、惡性瘧原蟲(尸/osmoof/Mm/fl/czj^nw2)環(huán)子孢子基因和麻疹病毒血凝素，所述重組腺病毒批次特征在于每1E11個病毒顆粒含有少于O.lng宿主細(xì)胞DNA。本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)包含編碼核酸結(jié)合蛋白的核酸序列的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)已經(jīng)感染病毒的宿主細(xì)胞，b)將所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物及其中產(chǎn)生的所述病毒進行宿主細(xì)胞的裂解，以提供包含所述病毒的裂解物，c)將病毒進行陰離子交換層析，其特征在于在陰離子交換層析之后，將含有病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液進行緩沖液更換。優(yōu)選地，所述溶液包含至少1.5MNaCl、更優(yōu)選至少2MNaCl、更優(yōu)選至少3MNaCl、更優(yōu)選大約5MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。優(yōu)選地，將所述病毒使用孔徑優(yōu)選不大于1.2pm的親水性濾膜過濾和/或通過大小排阻層析而進一步純化。所述病毒優(yōu)選是重組病毒，更優(yōu)選是重組腺病毒。所述核酸結(jié)合蛋白可以是核蛋白，如出血熱病毒的核蛋白，所述出血熱病毒例如為埃博拉病毒、馬爾堡病毒(Marburgvirus)或者拉沙病毒(Lassavirus)，優(yōu)選埃博拉病毒。發(fā)明詳述涼主一微本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是所希望的病毒可以在其中繁殖的任何宿主細(xì)胞。例如，重組腺病毒載體的繁殖在可以互補腺病毒中的缺陷的宿主細(xì)胞中進行。這些宿主細(xì)胞優(yōu)選地在其基因組中具有至少一個腺病毒El序列，從而能互補在El區(qū)域中具有缺失的重組腺病毒。另外，所述腺病毒可在E3區(qū)域中具有缺失，這在Ad基因組中是不重要的，因此不必互補這種缺失?？梢允褂萌魏位パaE1的宿主細(xì)胞，如El永生化的人視網(wǎng)膜細(xì)胞例如911(見美國專利5，994，128)、El-轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞(見EP專利1230354)、El-轉(zhuǎn)化的A549細(xì)胞(見例如WO98/39411，美國專利5,891,690)、GH329:HeLa(Gaoetal，2000，HumanGeneTherapy11:213-219)、293等等。優(yōu)選PER.C6tm細(xì)胞(美國專利5,994,128)或者衍生自其中的細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞，因為它們適于各種不同病毒包括但非限于重組腺病毒的繁殖(見例如WO01/38362)。用于重組腺病毒載體的繁殖的進一步的細(xì)胞系和方法例如在美國專利6,492,169和WO03/104467中公開?？梢灾苯佑米魉拗骷?xì)胞以繁殖病毒的或者可以被轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa宿主細(xì)胞以用于復(fù)制缺陷病毒的其它有用哺乳動物細(xì)胞系的實例是Vero和HeLa細(xì)胞及中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、W138、BHK、COS-7、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞，這些細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。本發(fā)明的宿主細(xì)胞被培養(yǎng)以增加細(xì)胞和病毒數(shù)目和/或病毒效價。培養(yǎng)細(xì)胞使得其可以代謝和/或生長和/或分裂和/或產(chǎn)生本發(fā)明感興趣的病毒。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實現(xiàn)，所述方法包括但不限于為細(xì)胞提供營養(yǎng)物，例如在合適的培養(yǎng)基中。所述方法可包括附著在表面生長、懸浮生長，或者這些生長的組合。培養(yǎng)例如可以在培養(yǎng)皿、滾瓶或者生物反應(yīng)器中使用分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、連續(xù)系統(tǒng)、中空纖維等方式進行。為了實現(xiàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)而大規(guī)模(連續(xù))生產(chǎn)病毒，本領(lǐng)域優(yōu)選使細(xì)胞能懸浮生長，并優(yōu)選使細(xì)胞在不含動物或人衍生的血清或者動物或人衍生的血清成分的條件下培養(yǎng)。本領(lǐng)域熟知合適的培養(yǎng)條件(見例如TissueCulture,AcademicPress,KruseandPaterson,editors(1973),禾卩R.I.Freshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique,fourthedition(Wiley-LissInc.，2000,ISBN0-471-34889-9)。本發(fā)明包括培養(yǎng)感染病毒的宿主細(xì)胞使其裂解。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知培養(yǎng)宿主細(xì)胞并使其感染病毒的方法。感染宿主細(xì)胞例如可簡便地將病毒在生理條件下暴露于合適的宿主細(xì)胞，使得宿主細(xì)胞攝取該病毒。對于某些病毒，甚至不需要用病毒本身開始，因為可以使用核酸序列在培養(yǎng)的細(xì)胞中重建該病毒。適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生腺病毒的一些方面和系統(tǒng)也可見于WO98/22588，p.ll-28。培養(yǎng)細(xì)胞及在宿主細(xì)胞中繁殖病毒的方法在例如美國專利6,168,944、5,994,134、6，342，384、6,168,941、5,948,410、5,840,565、5,789,390、6,309,650、6，146，873和國際專利申請WO01/38362、WO01/77304和WO03/084479中也有描述。病毒本發(fā)明的方法適用于廣泛的病毒，包括但不限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、皰疹病毒、乳多空病毒、副粘病毒、正粘病毒(如流感病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、輪狀病毒等等，特別優(yōu)選腺病毒。所述病毒優(yōu)選是重組病毒，但可以包括臨床分離株、減毒的疫苗株等等。在某些實施方案中，本發(fā)明用于濃縮攜帶異源轉(zhuǎn)基因的重組病毒，優(yōu)選腺病毒，以用于基因治療或者疫苗接種。只是為了例證目的，本發(fā)明將更詳細(xì)地描述重組腺病毒，但無限于此之意。優(yōu)選地，腺病毒載體在病毒復(fù)制所需的腺病毒基因組El區(qū)域(例如Ela和域Elb區(qū)域)的至少一個必需基因功能中具有缺陷。在某些實施方案中，所述載體在E1區(qū)域的至少一個必需基因功能和至少部分非必需的E3區(qū)域(例如E3區(qū)域的XbaI切除)中具有缺陷。腺病毒載體可以是"多重缺陷的"，這是指腺病毒載體在腺病毒基因組的兩或多個區(qū)域的每一個區(qū)域均具有一或多個必需基因功能缺陷。例如，前述E1缺陷的或者El-、E3-缺陷的腺病毒載體可以進一步在E4區(qū)域的至少一個必需基因和/或E2區(qū)域的至少一個必需基因(例如E2A區(qū)域和/或E2B區(qū)域)中具有缺陷。缺失全部E4區(qū)域的腺病毒載體可激發(fā)較低的宿主免疫應(yīng)答。合適的腺病毒載體例如包括缺少如下結(jié)構(gòu)的腺病毒載體(a)全部或部分El區(qū)域和全部或部分E2區(qū)域，(b)全部或部分E1區(qū)域、全部或部分E2區(qū)域、及全部或部分E3區(qū)域，(c)全部或部分El區(qū)域、全部或部分E2區(qū)域、全部或部分E3區(qū)域、及全部或部分E4區(qū)域，(d)至少部分Ela區(qū)域、至少部分Elb區(qū)域、至少部分E2a區(qū)域、及至少部分E3區(qū)域，(e)至少部分El區(qū)域、至少部分E3區(qū)域、及至少部分E4區(qū)域，及(f)所有必需腺病毒基因產(chǎn)物(例如僅包含ITR和包裝信號的腺病毒擴增子)。在缺失腺病毒基因組必需區(qū)域的情況中，這些區(qū)域編碼的功能需被反式提供，優(yōu)選通過宿主細(xì)胞反式提供，即當(dāng)腺病毒缺失部分或全部E1、E2和/或E4區(qū)域時，這些區(qū)域需存在于宿主細(xì)胞中，例如整合進基因組中，或者以所謂的輔助腺病毒或者輔助質(zhì)粒形式存在。復(fù)制缺陷的腺病毒載體可以使用腺病毒或者嵌合腺病毒的任何病毒物種、病毒株、亞型，或者這些病毒物種、病毒株或者亞型的混合物作為載體DNA的來源而產(chǎn)生(見例如WO96/26281，WO00/03029)，它們例如可以為腺病毒載體提供具有感染某些希望細(xì)胞類型的能力。腺病毒載體可以是能在細(xì)胞中生長的任何腺病毒載體，其一些主要部分(盡管不必需是實質(zhì)上地)衍生自或者基于腺病毒基因組。腺病毒載體可包含野生型腺病毒C群、特別是血清型5(即Ad5)或者Ad2的腺病毒基因組。腺病毒載體還可以包含衍生自腺病毒B群例如Adll、Ad35、Ad51等的腺病毒基因組或者至少一種纖維蛋白(見例如WO00/70071)，這些實施方案具有在種群中很少遇到針對這些血清型的中和抗體的優(yōu)勢，并且賦予靶定其它類型細(xì)胞的可能性，因為這些腺病毒載體的向性與衍生自Ad5的那些載體不同。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知也可以應(yīng)用任何其它血清型。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到使用例如美國專利6，492，169或者WO03/104467及其參考文獻當(dāng)中所論述的方法而繁殖特異于宿主細(xì)胞的不同血清型的腺病毒載體的可能性。本領(lǐng)域熟知腺病毒載體、構(gòu)建腺病毒載體的方法及繁殖腺病毒載體的方法，見例如美國專利No.5,559,099、5,837,511、5,846,782、5，851，806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040，174、6,020，191禾卩6,113,913，及ThomasShenk,"AdenoviridaeandtheirReplication",M.S.Horwitz，"Adenoviruses",Chapters67and68，respectively,inVirology,B.N.Fieldsetal.,eds.，3ded.，RavenPress,Ltd.,NewYork(1996)及其它參考文獻所揭示。本領(lǐng)域熟知腺病毒載體的構(gòu)建，其包括標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，例如Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)，Watsonetal"RecombinantDNA,2ded.,ScientificAmericanBooks(1992)及Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)，及其它參考文獻所述。在一個實施方案中，本發(fā)明的病毒是野生型病毒，或者在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中仍具有感染力的其突變體或一部分。在另一個實施方案中，所述病毒是包含異源信息的重組病毒，其可用于基因治療目的中的治療性方案，或者作為抗原用于免疫接種目的。優(yōu)選使用例如腺病毒載體。所述異源信息是指"轉(zhuǎn)基因(transgene)"。本發(fā)明的方法可適用于包含任何轉(zhuǎn)基因的病毒、優(yōu)選腺病毒，因此轉(zhuǎn)基因自身的性質(zhì)對于本發(fā)明無關(guān)重要。一些可能的轉(zhuǎn)基因例如在WO98/22588,p.42-49中描述?？纱嬖谟诒景l(fā)明的病毒中的轉(zhuǎn)基因例如可以是治療性基因，如腫瘤抑制基因，包括但不限于p53、p16、APC、DCC、NF-1、WT-1、p21、BRCA1、BRCA2等；酶，如胞嘧啶脫氨酶、HGPRT、葡糖腦苷脂酶、HSV胸苷激酶或者人胸苷激酶等等；激素，如生長激素、促乳素、紅細(xì)胞生成素、絨毛膜促性腺激素、甲狀腺剌激激素、瘦素(leptin)、ACTH、血管緊張素、胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、降鈣素、加壓素等等；白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子，如IL-1、IL-3、IL-12、G-CSF、GM-CSF、TNF等等；在特殊疾病中缺少或突變的置換基因(replacementgene)，如ADA、因子IX、CFTR等等；其它治療基因如血管發(fā)生抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑等等；抑制例如癌基因表達(dá)的反義構(gòu)建體，所述癌基因如ras、myc、jun、bcl、abl等等；以及疫苗抗原如病毒抗原，例如衍生自小核糖核酸病毒、冠狀病毒、披膜病毒、黃病毒、彈狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒、呼腸孤病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒等等，及例如更特異性的來自流感病毒(具有潛在抗原例如HA和/或NA)、乙型肝炎病毒(具有潛在抗原乙型肝炎表面抗原)、西尼羅腦炎病毒(WestNileVirus)、狂犬病病毒、SARS-CoV、單純皰疹病毒1和2、麻疹病毒，小痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、HIV(具有潛在抗原例如fflV-l衍生的gag、env、nef，或者其修飾物，包括密碼子優(yōu)化的形式，見例如WO02/22080所述)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒，拉沙病毒的抗原；或者細(xì)菌抗原、真菌抗原、寄生蟲(包括錐蟲、絳蟲、線蟲、蠕蟲、瘧原蟲等等)抗原等等。顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇可用于所設(shè)計的治療方案的感興趣的基因，其用于基因治療和/或免疫接種，并且不限于上述那些基因。同樣顯而易見，轉(zhuǎn)基因的控制區(qū)域優(yōu)選地存在于用于表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的重組病毒載體中，例如包括啟動子和聚腺苷酸化信號。這些均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不需要進一步描述。一些控制區(qū)域在wo98/22588，p.49-55中論述。本發(fā)明使用的一些腺病毒在實施例中進一步論述。微綜主一智應(yīng)在腺病毒感染后，所述病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并從而被擴增。腺病毒感染最終導(dǎo)致被感染的細(xì)胞裂解。腺病毒的裂解特性因此使得可以用兩種不同形式進行病毒生產(chǎn)。第一種形式是在細(xì)胞裂解之前使用外部因素使細(xì)胞裂解而收獲病毒。第二種形式是在產(chǎn)生的病毒使得細(xì)胞(幾乎)完全裂解之后收獲病毒上清(見例如美國專利6,485,958所述，其描述了不用外部因素使得宿主細(xì)胞裂解而收獲腺病毒)。對于后一種形式，需要較長的溫育時間以達(dá)到完全的細(xì)胞裂解及因此的高病毒產(chǎn)量。另外，宿主細(xì)胞成分逐漸流至培養(yǎng)基中可能對于獲得的病毒的完整性和產(chǎn)量有害處。因此，本發(fā)明優(yōu)選使用外部因素主動裂解細(xì)胞?？捎糜谥鲃恿呀饧?xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如WO98/22588，p.28—35所論述。這方面有用的方法例如是冷凍一解凍、固體剪切(solidshear)、高滲和/或低滲性裂解、液體剪切(liquidshear)、超聲、高壓擠壓、去污劑裂解、上述方法的組合等。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用至少一種去污劑使細(xì)胞裂解。使用去污劑進行裂解的優(yōu)勢是這是一種簡便的方法，并且可易于規(guī)模生產(chǎn)。在另一個實施方案中，細(xì)胞是使用中空纖維超濾通過剪切裂解的，如WO03/084479所述。去柳根據(jù)本發(fā)明可以使用的去污劑及其應(yīng)用方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所己知。一些實例例如在WO98/22588，p.29—33中揭示。本文所用術(shù)語"去污劑"可包括陰離子、陽離子、兩性離子和非離子去污劑。去污劑例如包括但非限于?；悄懰?，脫氧膽酸，?；敲撗跄懰?，鯨蠟(cetylpyridium)，殺藻胺，ZWITTERGENT-3-14,CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl]dimethylammoniol)-l-丙磺酸鹽水合物，Aldrich)，BigCHAP,DeoxyBigCHAP,TritonX-100,TritonX-114,C12E8，辛基-B-D-吡喃葡糖苷，PLURONIC-F68,TWEEN-20,TWEEN-80(CALBIOCHEMBiochemicals)，Thesit,NP-40,Brij-58，辛基葡糖苷等。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚去污劑的濃度可以在例如大約0.1%—5%(w/w)范圍內(nèi)變化。在某些實施方案中，所述去污劑以大約1%(wAv)的濃度存在于裂解溶液中。在本發(fā)明人的一些前導(dǎo)性實驗中，使用Triton與使用一些其它測試的去污劑(Tween20、Tween80、脫氧膽酸)相比產(chǎn)生較低粘性的溶液。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用的去污劑是TritonX-IOO。本發(fā)明應(yīng)用核酸酶除去污染的即主要是宿主細(xì)胞的核酸。適用于本發(fā)明的核酸酶例如包括Benzonase、Pulmozyme⑧或者本領(lǐng)域通用的任何其它DNA酶和/或RNA酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸酶是Benzonase,其通過水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵使核酸快速水解，從而降低細(xì)胞裂解物的粘性。Benzonase⑧可商購自MerckKGaA(編號W214950)。應(yīng)用的核酸酶的濃度優(yōu)選在1一100單位/ml范圍。根據(jù)本發(fā)明，所述核酸酶在細(xì)胞裂解之前使用。其可以在裂解步驟之前幾秒鐘加入(或者實際上同時加入)，但優(yōu)選在裂解步驟之前至少1分鐘加入到培養(yǎng)物中。然后將加入了核酸酶的細(xì)胞培養(yǎng)物在高于處理溫度的溫度溫育，例如在大約40°C，或者在培養(yǎng)溫度(例如在大約35'C—37°C)、或者在室溫(大約2(TC)或者更低溫度溫育，在較低溫度溫育通常需要較長的時間達(dá)到相同的結(jié)果(見Benzonase手冊MerckKGaA編號W214950)。作為非限制性例子，溫育可以在例如大約37'C進行大約IO分鐘，之后裂解細(xì)胞。顯然，核酸酶可以并優(yōu)選在裂解步驟之后仍然可以主動降解核酸，在本發(fā)明的某些實施方案中，在裂解之后細(xì)胞與核酸內(nèi)切酶的溫育延長大約50分鐘(導(dǎo)致核酸酶處理的總時間為大約1小時，這個時間可以更長，因為預(yù)期核酸酶仍發(fā)揮作用直至其在隨后的純化步驟中被除去)。這個時間與WO98/22588公開的溫育過夜的時間相比顯著縮短。當(dāng)然，較長的溫育時間，例如2小時或者過夜或者更長時間溫育(在Benzonase手冊MerckKGaA編號W214950中，提供了溫育時間直至30小時的數(shù)據(jù))，本發(fā)明的方法也是可能的，但這不是獲得可接受的結(jié)果所必需的。很清楚在這些實施方案中使用的裂解步驟(即，將含有在其中產(chǎn)生的病毒的細(xì)胞進行裂解)是指應(yīng)用外部因素如去污劑進行的裂解步驟(見上面"裂解宿主細(xì)胞"所述)。顯然，在培養(yǎng)在其中腺病毒進行繁殖的細(xì)胞期間，一些細(xì)胞在沒有任何外部裂解因素的情況下由于病毒而已經(jīng)被裂解。因此，在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)開始核酸酶處理時，這種在沒有外部因素的情況下發(fā)生的宿主細(xì)胞裂解低于50%，優(yōu)選低于40%，更優(yōu)選低于30%，更優(yōu)選低于20%，即優(yōu)選當(dāng)細(xì)胞存活力分別為至少50%、60%、70%、80%時加入核酸酶。盡管非優(yōu)選(見上述)，但可以使用在沒有外部因素的情況下依賴于宿主細(xì)胞裂解的方法。包含"自發(fā)"裂解的方法己經(jīng)被描述，其中不提倡使用Benzonase(見美國專利6,485,958)。然而，根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)的晚期階段期間，即優(yōu)選當(dāng)病毒在其中繁殖的宿主細(xì)胞仍具有至少5%、優(yōu)選至少10%、更優(yōu)選至少20%存活力時(即當(dāng)分別低于95%、90%、80%的細(xì)胞裂解時)，在這種系統(tǒng)中加入核酸酶也是有益的。預(yù)期當(dāng)應(yīng)用這樣的步驟時將改良獲得的病毒的質(zhì)量。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種從宿主細(xì)胞中純化能裂解宿主細(xì)胞的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)包含能裂解所述宿主細(xì)胞的病毒的宿主細(xì)胞，b)在無外部因素裂解細(xì)胞的情況下在病毒釋放進培養(yǎng)液之后收獲病毒，其特征在于在95。％的宿主細(xì)胞被裂解之前向培養(yǎng)物中加入核酸酶。在某些實施方案中，在90%、優(yōu)選80%的宿主細(xì)胞被裂解之前向培養(yǎng)物中加入核酸酶。在本發(fā)明這些方面中加入核酸酶的最佳時刻(即相應(yīng)于被裂解的細(xì)胞的最佳百分比)依賴于加入的核酸酶的量及溫育期間核酸酶的比活性的降低，這個時刻可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定，現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明人揭示了向培養(yǎng)物自身中加入核酸酶的優(yōu)點。顯而易見，根據(jù)本發(fā)明這個方面獲得的裂解物可以應(yīng)用本文所述的方法和步驟進一步純化，如經(jīng)過濾和層析純化。國際專利申請WO03/097797描述了從細(xì)胞裂解物中純化腺病毒顆粒的另外的方法，包括加入選擇性沉淀劑以沉淀雜質(zhì)DNA。盡管在該申請中闡述了當(dāng)使用其所述方法時不需要核酸酶步驟，但這一步驟還是在后期階段被應(yīng)用以得到更好的結(jié)果。本發(fā)明的方法，包括在宿主細(xì)胞裂解之前加入核酸酶的步驟，可以與在裂解后加入選擇性沉淀劑組合，從而使得在過程后期加入核酸酶的步驟(如在WO03/097797中所優(yōu)選的)潛在多余。國際專利申請WO02/070673應(yīng)用連續(xù)離心方法從宿主細(xì)胞中分離病毒將細(xì)胞培養(yǎng)物在使細(xì)胞有效濃縮為粒狀沉淀(pellet)的條件下進行連續(xù)離心，將粒狀沉淀細(xì)胞在有效裂解細(xì)胞的條件下從離心機中排至收集容器中，從而獲得裂解物。顯然，這種方法的細(xì)胞裂解也在本發(fā)明"裂解宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)，因此預(yù)期這種方法應(yīng)從本發(fā)明中獲益，即在進行連續(xù)離心方法之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶，由此改良的方法在裂解物及最終的純化產(chǎn)物中產(chǎn)生較低量的核酸污染。澄薪c/ar折c加,owj^在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，包含病毒的宿主細(xì)胞被澄清。澄清可以通過除去細(xì)胞碎片和其它雜質(zhì)的過濾步驟進行。合適的濾膜可利用纖維素濾膜、再生的纖維素纖維、纖維素纖維組合無機過濾助劑(例如硅藻土，珍珠巖，煅制氧化硅)、纖維素纖維組合無機過濾助劑及有機樹脂，或者其任何組合，及聚合物濾膜(例如包括但不限于尼龍、聚丙烯、聚醚砜)，以達(dá)到有效除去及可接受的回收。通常地，優(yōu)選但非必需多階段的方法。例如兩階段或三階段的方法包括經(jīng)一個流經(jīng)濾膜(coursefilter)除去較大的沉淀物和細(xì)胞碎片，隨后通過標(biāo)稱孔徑大于0.2微米但小于1微米的第二個分級濾膜(stagefilter)濾清。最佳的組合可以是沉淀物大小分布以及其它變量的函數(shù)。另外，也可以使用應(yīng)用相對緊密的濾膜或者離心的單級操作進行澄清。更通常地，任何澄清方法包括無流動(dead-end)過濾、微濾、離心、或者過濾助劑(例如硅藻土)的主體加料與無流動或深層過濾組合(其提供了適當(dāng)澄清度的濾液，在隨后的步驟中不淤塞濾膜和/或樹脂)，均可用于本發(fā)明的澄清步驟中。在一個實施方案中，使用深層過濾和膜過濾。這方面可商購的產(chǎn)物例如在WO03/097797,p.20-21中提及。可以使用的濾膜可由不同的材料組成，可以孔徑大小不同，并且可以組合使用。這些濾膜可以商購自一些供應(yīng)商。本發(fā)明人己經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中某些濾膜與其它濾膜相比，出乎意料地得到了更好的結(jié)果，提供更加改良的澄清(見實施例4)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，組合使用0.8拜和0.45(im的濾膜，優(yōu)選Sartopore-2濾膜，進行澄清。在本發(fā)明的某些實施方案中，在整個過程中對病毒懸浮液進行至少一次超濾/滲濾，例如以濃縮病毒和/或進行緩沖液更換，和/或濃縮和滲濾澄清的收獲物。根據(jù)本發(fā)明的方法用于濃縮病毒的過程可包括任何過濾過程(例如超濾(UF)),其中病毒的濃度通過迫使稀釋劑穿經(jīng)濾膜而增加，從而稀釋劑被從病毒制備物中除去，而病毒不能通過該濾膜，由此以濃縮的形式保留在病毒制備物中。UF在例如MicrofiltrationandUltrafiltration:PrinciplesandApplications,L.ZemanandA.Zydney(MarcelDekker，Inc.,NewYork,NY,1996)中詳細(xì)描述。一種優(yōu)選的過濾方法是切向流過濾(TangentialFlowFiltration,TFF)，例如在MILLIPORE目錄中題目為"PharmaceuticalProcessFiltrationCatalogue"pp.177-202(Bedford,Massachusetts,1995/96)的文章中描述。TFF廣泛用于生物處理工業(yè)，用于細(xì)胞收獲、澄清和產(chǎn)物(包括病毒)濃縮。這個系統(tǒng)由三個不同的工業(yè)生產(chǎn)液流組成補料溶液、滲透物和滲余物。根據(jù)應(yīng)用情況，可以使用不同孔徑的濾膜。在本發(fā)明的一個實施方案中，滲余物是產(chǎn)物，如果需要可進行進一步純化。對于這個實施方案，選擇的特殊超濾膜的孔徑要足夠小得能保留病毒，但足夠大得能有效地清除雜質(zhì)。根據(jù)廠商和膜類型，對于腺病毒而言，標(biāo)稱分子量截斷值(NMWC)在lOO—lOOOkDa之間是合適的，例如具有300kDa或者500kDaNMWC的膜。膜的組成可以是但不限于再生纖維素、聚醚砜、聚砜或其衍生物。膜可以是扁片狀或者是中空纖維。UF通常是指使用孔徑小于0.1nm的濾膜進行過濾。產(chǎn)物通常被保留，而體積通過滲透而減少。生物制藥業(yè)中對于TFF最常用的兩種幾何結(jié)構(gòu)是平板&框架以及中空纖維模塊。進行超濾和微濾的中空纖維裝置由Amicon和Ramicon在1970年代前期揭示(Cheryan,M.UltrafiltrationHandbook),目前還有多家供應(yīng)商，包括Spectrum和A/GTechnology。中空纖維模塊由具有致密外層的自持纖維的陣列組成，使膜具有滲透選擇性。纖維直徑范圍是0.5mm—3mm。中空纖維模塊的一個優(yōu)勢是能提供從小膜面積(ca.16cm"直至非常大膜面積(ca.28m"的濾膜，使得可以線性和簡便地擴大規(guī)模。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，中空纖維用于TFF。據(jù)報道這些中空纖維與平面篩選膜(flatscreenmembrane)相比剪切較少，而病毒顆粒/感染單位(VP/IU)比率更好。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用0.05pm的中空纖維。使用超濾膜的滲濾(DF)或者緩沖液更換是除去和更換鹽、糖、從結(jié)合的物質(zhì)中經(jīng)非水性溶劑分離游離的物質(zhì)、除去低分子量材料或者快速改變離子和/或pH環(huán)境的一種理想方式。微溶質(zhì)通過向超濾的溶液中以與UF速度相同的速度加入溶劑而被最有效地除去。這樣以恒定體積從溶液中洗去微量物質(zhì)，純化保留的病毒。本發(fā)明利用DF步驟更換裂解物的緩沖液，之后進行進一步層析或者其它純化步驟。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過TFF進行DF以進行緩沖液更換，其中加入緩沖液等于除去滲透物?？梢栽诩兓牟煌瑫r期使用UF/DF濃縮和/或緩沖液更換本發(fā)明的病毒懸浮液，例如純化裂解物和/或已經(jīng)經(jīng)過層析的那些進一步純化的病毒懸浮液。在本發(fā)明的一個實施方案中，裂解物通過UF/DF濃縮5倍，將所得濃縮的病毒懸浮液使用恒定體積的滲濾方法用6個滲濾體積(DFV)的包含1MNaCl的緩沖液進行緩沖液更換。發(fā)現(xiàn)這種高鹽濃度顯著改良所得病毒的性質(zhì)，因為許多不希望的蛋白質(zhì)在這個步驟期間被去除(見實施例2)。因此本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是將澄清的裂解物用包含0.8—2.0MNaCl、例如大約1MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液更換。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白鹽的陰離子和陽離子均可以改變。在將所述病毒懸浮液進行陰離子交換層析之前，可以用包含0.4MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的緩沖液進行緩沖液更換。在一個實施方案中，這可以通過恒定體積滲濾方法，使用4個DFV的希望的緩沖液而實現(xiàn)。遂一步鄉(xiāng)根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，已經(jīng)通過本發(fā)明的方法獲得的病毒懸浮液優(yōu)選在裂解物澄清之后例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行進一步純化。這可以例如通過密度梯度離心方法而實現(xiàn)，如WO98/22588,p.59-61所論述。然而，優(yōu)選進一步純化應(yīng)使用至少一個層析步驟，例如WO98/22588，p.61-70所論述。已經(jīng)描述了進一步純化病毒的許多方法，其中包括層析步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些方法，并且可以改變應(yīng)用層析步驟的實際方式以優(yōu)化本發(fā)明的方法。例如可以通過組合陰離子交換和陽離子交換層析步驟純化某些病毒，見美國專利6,008,036所論述。也可以應(yīng)用羥磷灰石介質(zhì)純化腺病毒，見WO02/44348所論述。也可以使用反向吸附步驟，例如WO03/097797,p.26所描述。對于腺病毒純化，優(yōu)選使用至少一個陰離子交換層析步驟。在陰離子交換層析步驟之后，所述病毒可以是足夠純的。然而在某些實施方案中，進一步進行大小排阻層析步驟以增加純化過程的強度。這個步驟可以在陰離子交換層析步驟之前或之后進行。顯然，也可以將其它純化步驟與陰離子交換層析步驟適當(dāng)?shù)亟M合。陰離子交換層析在純化腺病毒中的應(yīng)用已經(jīng)充分描述，這方面因此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。已經(jīng)應(yīng)用了許多不同的層析基質(zhì)純化腺病毒并且是合適的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于發(fā)現(xiàn)純化該病毒的最佳陰離子交換材料，例如如下文獻的指導(dǎo)。美國專利5,837,520(也見于Huygheetal.，1995,HumanGeneTherapy6:1403-1416)描述了一種純化腺病毒的方法，其中將宿主細(xì)胞裂解物用核酸酶處理，隨后進行陰離子交換和金屬離子親和層析。美國專利6,485,958描述了使用強陰離子交換層析方法純化重組腺病毒。陰離子交換層析已經(jīng)與流化床層析柱(fluidizedbedcolumn)—起應(yīng)用以純化腺病毒顆粒，見WO00/50573所述。另外，純化腺病毒顆粒的膨脹床(expandedbed)陰離子交換層析及進行陰離子交換層析的某些層析樹脂已經(jīng)在美國專利6，586,226中描述。除了陰離子交換層析柱之外，陰離子交換膜層析產(chǎn)品如Pall(例如MustangTM系歹!j)和Sartorius(例如Sartobind系列)生產(chǎn)的那些產(chǎn)品也是合適的。關(guān)于這些濾膜的應(yīng)用及其在腺病毒純化中的優(yōu)點見例如WO03/078592所述。顯然，這些濾膜的應(yīng)用'也在本文所用術(shù)語"陰離子交換層析"的范圍內(nèi)。美國專利6,537,793描述了使用離子交換層析從宿主細(xì)胞中純化腺病毒的方法，特別教導(dǎo)優(yōu)選使用QSepharoseXL類型層析支持物。在本發(fā)明的一個實施方案中，腺病毒使用QSepharoseXL層析柱進一步純化。如上所述，所述方法可進一步適當(dāng)?shù)貞?yīng)用大小排阻層析步驟。國際申請WO97/08298描述了使用某些層析基質(zhì)以防止對病毒的損害的腺病毒純化方法，包括陰離子交換和大小排阻步驟。美國專利6,261,823描述了一種純化腺病毒的方法，其中將腺病毒制備物進行陰離子交換層析，隨后進行大小排阻層析。在大小排阻步驟中，可以從低分子量的雜質(zhì)中進行病毒顆粒的組分離。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，將大約15—30%、優(yōu)選大約20%的柱體積加樣于大小排阻層析柱中(大小排阻層析的組分離模式)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的腺病毒懸浮液使用陰離子交換層析步驟和大小排阻層析步驟進一步純化。WO03/078592描述了使用高通量陰離子交換濾斷即含有陰離子交換基團的帶電濾膜)進行腺病毒(Ad5)純化。如下描述了這種帶電濾膜與陰離子交換層析柱相比的優(yōu)勢(i)較快的流速；(ii)較高的結(jié)合容量；(iii贈高的病毒回收程度；(iv)對于臨床應(yīng)用不需要包裝或者清潔確認(rèn)；(v)當(dāng)使用一次性濾筒時無有效期或者貯存問題。如上所述，這種陰離子交換濾膜的使用是本發(fā)明的一個實施方案，并且是被認(rèn)為包括在本發(fā)明的"陰離子交換層析"范圍內(nèi)的一個實施方案。然而，除了是柱層析的等價物之外，本發(fā)明人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)使用陰離子交換濾膜與使用陰離子交換層析柱相比純化腺病毒血清型35(Ad35)的一個優(yōu)點未摻入腺病毒顆粒中的某些腺病毒蛋白質(zhì)通過使用陰離子交換濾膜而不是通過陰離子交換層析柱而從腺病毒顆粒中分離出。這些游離的腺病毒蛋白質(zhì)先前在重組腺病毒顆粒制備物中未被發(fā)現(xiàn)，并且通常檢測不到，但是現(xiàn)在可以使用如下步驟而除去將包含游離腺病毒蛋白質(zhì)的重組腺病毒制備物用含有陰離子交換基團的帶電濾膜進行過濾。使用帶電濾膜的這種效果在WO03/078592中未注意到。另外，WO03/078592未公開應(yīng)用陰離子交換濾膜純化Ad35或者B亞群的其它腺病毒顆粒。本發(fā)明因此提供了一種從重組腺病毒制備物中除去游離腺病毒蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟將包含游離腺病毒蛋白質(zhì)的重組腺病毒制備物用含有陰離子交換基團的帶電濾膜進行過濾。不希望受理論的約束，但確信B亞群的重組腺病毒顆?？赡艿妮^低穩(wěn)定性(見例如WO2004/001032)產(chǎn)生迄今未被檢測到的似乎未摻入腺病毒顆粒中的游離腺病毒蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的這種特殊方法可以特別有益于純化B亞群的重組腺病毒，如Ad35、Adll等等。然而，這種方法也可以改良更穩(wěn)定的基于Ad5或Ad2的腺病毒的純化。本發(fā)明提供了使用陰離子交換濾膜從重組腺病毒制備物中除去游離的(即未摻入病毒顆粒中的)腺病毒蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述重組腺病毒制備物包含重組B亞群腺病毒，如重組Ad35。本發(fā)明還提供了一種純化重組的B亞群腺病毒顆粒如Ad35顆粒的方法，所述方法包括將重組B亞群如Ad35顆粒用陰離子交換濾膜進行純化步驟。適用于本發(fā)明這些方法中的陰離子交換濾膜為本領(lǐng)域所已知并且可商購(見WO03/078592,段落[40]-[41])，例如可購自Pall(例如Mustang系列)和Sartorius(例如Sartobind系列)。緩rW根據(jù)本發(fā)明，在病毒純化期間可使用許多種緩沖液。在本發(fā)明的一些實施方案中，用于UF/DF和陰離子交換層析的緩沖液通常含有0.4—1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5，其中NaCl的濃度根據(jù)進行的步驟而定。在某些優(yōu)選的實施方案中，在澄清之后使用的緩沖液不含去污劑、氯化鎂和蔗糖。這些添加劑的缺乏使得這些緩沖液與已知已確立的方案中使用的那些緩沖液不同。然而無論如何，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的方法時，獲得了純化的和基本上未聚集的腺病毒。使用不含這些添加劑的緩沖液的優(yōu)點是較易于制備、較廉價、并且不需要檢驗這些添加劑的去除情況。在本發(fā)明的一個實施方案中，將腺病毒在組分離期間及最后的貯存期間用緩沖液進行緩沖液更換，所述緩沖液也用于AdenovirusWorldStandard(Hogansonetal,Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002，p.43-48》20mMTrispH8，25mMNaCl，2.5%甘油。顯然，可以使用許多其它緩沖液，適合純化的(腺)病毒制備物貯存及藥物學(xué)給藥的配方的一些實例可例如見歐洲專利No.0853660和國際專利申請WO99/41416、WO99/12568、WO00/29024、WO01/66137、WO03/049763所述。^有淳#絲裙乂沐游載沐在本領(lǐng)域，通常認(rèn)為轉(zhuǎn)基因自身與純化方法無關(guān)。然而，如本文所示，轉(zhuǎn)基因在特定情況中可通過其在宿主細(xì)胞或病毒中的表達(dá)影響病毒的性質(zhì)或者可對純化病毒的過程有影響。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的一種這樣的非限制性的特殊情況是其中所述轉(zhuǎn)基因是埃博拉病毒核蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法純化含有埃博拉病毒核蛋白基因的腺病毒載體導(dǎo)致表達(dá)的埃博拉病毒核蛋白的共純化。未觀察到一些其它轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的共純化(例如未觀察到與埃博拉病毒糖蛋白dTM(Sudan)、埃博拉病毒糖蛋白dTM(Zaire)、麻疹血凝素蛋白(MV-H)的共純化)。這提示埃博拉病毒核蛋白與腺病毒之間的特異性相互作用，這種作用似乎依賴于埃博拉病毒核蛋白的特性。預(yù)期其它核酸結(jié)合蛋白具有相似的特性，并預(yù)期與腺病毒相互作用導(dǎo)致共純化。對于具有這種轉(zhuǎn)基因包括核酸結(jié)合蛋白如核蛋白如埃博拉病毒核蛋白的腺病毒，將緩沖液更換為鹽濃度高于1MNaCl及使用例如2—5MNaCl緩沖液以改良終產(chǎn)物質(zhì)量是有益的(見實施例3)。緩沖液更換可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^TFF進行。或者，可以使用其它緩沖液更換方法，例如通過添加固體材料或者濃縮的溶液，鹽可以直接逐步加入病毒懸浮液中。本發(fā)明的這個方面與本發(fā)明的其它方面組合是有益的，例如與在細(xì)胞裂解之前加入核酸酶組合，但不限于此。本文描述了使用這種高鹽緩沖液出乎意料地未導(dǎo)致聚集問題，也未導(dǎo)致純化的病毒顆粒的感染性或完整性顯著劣化。在本發(fā)明的這個方面中，緩沖液更換步驟優(yōu)選在病毒從陰離子交換層析中洗脫之后進行，優(yōu)選在進一步純化步驟之前進行，這種進一步純化步驟例如是以組分離模式進行的大小排阻步驟。這一最后步驟可用于濾清病毒懸浮液，即除去在陰離子交換后可能仍存在的少量雜質(zhì)，也可以用于直接在組分離柱上進行緩沖液更換?；蛘?，代替大小排阻層析，進一步純化步驟可包括通過親水性濾膜過濾包含高濃度鹽的病毒懸浮液，所述濾膜例如是DuraporePVDF濾膜(例如Millipore的Millipac)或者Sartopore2濾膜。所述濾膜優(yōu)選孔徑為1.2pm，更優(yōu)選孔徑更小例如l.Opm，更優(yōu)選孔徑更小例如為0.8pm、0.45pm或者0.22pm。出乎意料地發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒的核蛋白(NP)在這些條件下通過被濾膜滯留而從重組腺病毒中分離，而NP(分子量為大約100kD)預(yù)期與腺病毒一起通過濾膜孔。使用這些濾膜提供了從病毒中分離核蛋白的快速方案，這種方法不需要在高鹽濃度中延長溫育時間，同時可以從病毒中完全除去核蛋白(圖9)。當(dāng)然，在這種過濾步驟后仍可以應(yīng)用大小排阻層析步驟，以除去其它少量污染物和/或進行緩沖液更換。使用高鹽除去DNA結(jié)合蛋白是本發(fā)明的一方面，預(yù)期可用于除了腺病毒之外的其它病毒。在這種情況中可以應(yīng)用另一個柱層析步驟代替陰離子交換層析。重要的因素似乎是要在應(yīng)用高鹽步驟之前充分除去污染物，當(dāng)然這種除去可以通過除了陰離子交換層析之外的其它方式進行，對于重組腺病毒也如此。因此，本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)包含編碼核酸結(jié)合蛋白的核酸序列的病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)已經(jīng)感染了病毒的宿主細(xì)胞；b)將所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物和其中產(chǎn)生的所述病毒進行宿主細(xì)胞的裂解，提供包含所述病毒的裂解物；c)將病毒進行陰離子交換層析，其特征在于在陰離子交換層析后將含有病毒的混合物用包含至少1MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液進行緩沖液更換。優(yōu)選地，將病毒使用至少一個包含親水性濾膜過濾的步驟和/或使用至少一個包含大小排阻層析的步驟而進一步純化。對于這些實施方案，將包含至少1MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液稱作"高鹽"溶液。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知陰離子和陽離子均可以被改變，只要提供足夠的離子強度而無沉淀或者其它不希望的副作用如病毒失活即可，因為所述方法很可能依賴于破壞DNA結(jié)合蛋白與純化的病毒之間的離子相互作用。例如，NaCl可以部分或全部由其它的鹽代替，例如由KC1、磷酸鈉、CsCl、LiCl、(NH4)2S04、NH4C1、NaBr、Nal、KBr、KI、KN03、NaHC03、KHS04等等代替。本發(fā)明實施例中使用的5X稀釋的緩沖液(包含5MNaCl)電導(dǎo)率為78一79mS/cm。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在可以例如容易地對含有其它鹽并具有相似或更高電導(dǎo)率的緩沖液進行測試，以測試其從部分純化的病毒中除去DNA結(jié)合蛋白的適合性。預(yù)期這個實施方案直至飽和的NaCl濃度(即大約6MNaCl)都將是有效的，但因為一些實際的原因優(yōu)選使用不飽和的緩沖液，例如5MNaCl。優(yōu)選地，所述溶液包含至少1.5MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少2MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少3MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少4MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。更優(yōu)選地，所述溶液包含至少5MNaCl，或者提供相等離子強度的另一種鹽。包含病毒的高鹽溶液可溫育一定時間，優(yōu)選至少1小時，更優(yōu)選至少2小時。一般地，實施例示出當(dāng)溫育時間更長、至少直至過夜溫育時，從病毒中純化的DNA結(jié)合蛋白增多。另夕卜，較高的離子強度看起來改良純化。因此，可以想像即使在1M或者1.5MNaCl的離子強度和延長的溫育時間例如至少2天或1周的情況下，也可以從病毒中純化DNA結(jié)合蛋白。這可以通過本發(fā)明所述的實驗常規(guī)檢測。在包含5MNaCl的緩沖液中過夜溫育表達(dá)埃博拉病毒核蛋白的重組腺病毒從病毒中除去了污染性的核蛋白至低于檢測限，因此這是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。在優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是一種重組腺病毒。在某些實施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白是病毒的核蛋白。在某些實施方案中，所述核酸結(jié)合蛋白是埃博拉病毒核蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，緩沖液更換步驟在陰離子交換層析之后及過濾和/或大小排阻層析步驟之前進行。進一步優(yōu)選包括用核酸酶處理裂解物，其中根據(jù)本發(fā)明的其它方面優(yōu)選在細(xì)胞裂解完成之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶。代替高鹽，或者除了高鹽之外，可以加入去污劑以從污染性的DNA結(jié)合蛋白中純化病毒。在一個實驗中，本發(fā)明人示出加入1%Tween20在表達(dá)埃博拉病毒核蛋白的重組腺病毒中顯著降低污染性的核蛋白。當(dāng)然，也可以適當(dāng)?shù)販y試其它去污劑，濃度可以變化(例如在大約0.2%—5%之間)，以發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明從重組病毒制備物中除去DNA結(jié)合蛋白的最佳條件。在這個方面，優(yōu)選加入至少1%的去污劑。然而，本發(fā)明人的第一個實驗表明高鹽溫育具有更高的再現(xiàn)性，并因此是優(yōu)選的。翻麟毒微汰一方面，本發(fā)明提供了包含選自如下一組的轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒批次埃博拉病毒核蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子基因、麻疹病毒血凝素，所述批次的特征在于每1E11病毒顆粒含有少于O.lng宿主細(xì)胞DNA。當(dāng)然，這些轉(zhuǎn)基因與天然發(fā)現(xiàn)的野生型序列(包括所有分離株或亞型)相比任選可含有缺失、添加和/或突變，這些轉(zhuǎn)基因在本發(fā)明的范圍內(nèi)。顯然，如果不是審批目的所需的，對于對對象進行給藥，提供這種具有低劑量污染性宿主細(xì)胞DNA的批次是有益的。在優(yōu)選的方面，所述批次特征在于每IO"個病毒顆粒含有少于0.08ng、優(yōu)選少于0.06ng、更優(yōu)選少于0.04ng宿主細(xì)胞DNA。實施例如下實施例是為了通過本發(fā)明的某些實施方案進一步例證本發(fā)明，而無限制本發(fā)明范圍之意。實應(yīng)夠/:廚潘應(yīng)潛養(yǎng)^^,求力涼主潘應(yīng)麥蘼激^勿入拔變艨改虔瘋毒縱方法在這個實施例中，示出在細(xì)胞裂解之前向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入核酸酶減少最終純化的產(chǎn)物中殘留的宿主細(xì)胞DNA的量。在實驗1和實驗2中，將10升？￡1^.6@細(xì)胞培養(yǎng)物在感染腺病毒載體后2.5天用1%TritonX-100(Sigma)裂解。在裂解后30分鐘，加入Benzonase⑧(MerckKgaA,50單位/ml)和MgCl2(2mM)。再過30分鐘后，將TritonX-10(f/Benzonase⑧(T/B)收獲物通過過濾澄清。這是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進行的實驗。在實驗3—8中，將Benzonase(50U/ml)禾BMgCl2(2mM)力卩入10升PERC.6細(xì)胞培養(yǎng)物中(感染后2.5天)，溫育10分鐘后將細(xì)胞用1%TritonX-100裂解。再溫育50分鐘后，通過過濾澄清Benzonase/TritonX-100(B/T)收獲物。這兩種方法的不同之處在于核酸酶(Benzonase)和去污劑(TritonX-100⑧)加入的順序傳統(tǒng)上首先裂解細(xì)胞，隨后加入核酸酶(在此稱作T/B收獲物)，而在本發(fā)明的方法中，首先加入核酸酶，隨后使細(xì)胞裂解(在此稱作B/T收獲物)。見圖1所示。然后將樣品進一步純化。通過深層過濾(0.5^mClarigard濾膜，Millipore)進行澄清，隨后經(jīng)過0.8/0.45pmSartopore2(Sartorius)濾膜進一步澄清。將澄清物經(jīng)過0.05pm中空纖維(Spectrum)濃縮5倍，隨用用6體積的1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5禾Q4體積的0.4MNaCl/50mMTrispH7.5滲濾。將經(jīng)滲濾的滲余物加樣于SepharoseQ-XL(Amersham)柱上，用0.55MNaCl/50mMTRISpH7.5洗脫病毒級分。將此級分進一步純化并用Sepharose4FF(Amersham)柱進行緩沖液更換。將產(chǎn)生的純化產(chǎn)物使用中空纖維(0.05imi孔徑，Spectrum)濃縮至希望的濃度，經(jīng)0.22pm濾膜過濾并等份。通過Q-PCR分析純化的產(chǎn)物樣品中殘留的宿主細(xì)胞DNA。T/B處理導(dǎo)致在進一步后續(xù)處理之后DNA含量減少，可以正好符合對終產(chǎn)物(filledandfinishedmaterial)的要求。活體病毒配制品中殘留的宿主細(xì)胞DNA的規(guī)定量是<10ng/劑(假定一劑含有1E11病毒顆粒)。如表1所示，顛倒TritonX-100⑧和Benzonasea⑧步驟顯著減少了純化產(chǎn)物中殘余的宿主細(xì)胞DNA的量在主動裂解細(xì)胞之前加入核酸酶可以使殘余宿主細(xì)胞DNA的量減少10—40倍，直至小于0.1ng4d病毒顆粒。另外，從SDS-PAGE分析(圖2)中顯然可見通過深層過濾和膜過濾B/T收獲物，在澄清期間除去了許多宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，其中包括顯著量的組蛋白(在凝膠上分子量為大約10—20kD，通過質(zhì)譜分析證實)，而這些蛋白質(zhì)顯然仍存在于澄清的T/B收獲物中。因此，本發(fā)明的方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)已知的那些方法。不希望受理論約束，對于實驗1和2(T/B)與實驗3—8(B/T)之間差別的解釋可包括1.通過加入Benzonase,由于病毒的產(chǎn)生而從裂解的細(xì)胞中釋出的DNA可能已經(jīng)被消化。只要DNA從Triton裂解的細(xì)胞中一釋出，存在的Benzonase⑧立即消化該DNA，從而防止大的DNA聚集體形成。未聚集的DNA的消化可能比大的DNA聚集體的消化效率更高。2.Benzonase⑧的總溫育時間增加30分鐘，導(dǎo)致更有效的消化(見Benzonase手冊MerckKGaA編號W214950)。3.當(dāng)DNA在釋出后立即被消化時，可能形成較大的組蛋白復(fù)合物，這些較大的顆粒通過澄清濾膜滯留。在澄清期間組蛋白-DNA復(fù)合物的滯留可能也有助于減少殘留的宿主細(xì)胞DNA。一些陰離子交換樹脂已經(jīng)被測試，例如QAE550C和SuperQ650M(購自Tosoh)，QSepharoseHP,ANXS印harose4FF，DEAESepharose，QSepharoseXL,QSepharoseBigBead禾口QSepharoseFF(購自Amersham)。盡管所有這些樹脂均適于純化重組腺病毒，但我們發(fā)現(xiàn)基于從宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞DNA中分離病毒和流動特性，QSepharoseXL最適合我們的目的。一些大小排阻樹脂被測試，例如SephaciylS300，SephaciylS500Sepharose4FF和Sepharose6FF(均購自Amersham)。盡管所有這些樹脂均適于純化重組腺病毒，但我們發(fā)現(xiàn)基于從宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA中分離病毒的能力，Sepharose4FF最適于我們的目的?；谶@些及其它結(jié)果(見下文)，本發(fā)明的一個優(yōu)選方法示于圖4。實蘑翔^屑/^^緩^^遂療緩,發(fā)更襲改虔瘋毒必遝將PER.C6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長并用Ad5.Adapt.MV-H(用麻疹病毒血凝素作為轉(zhuǎn)基因，在WO2004/037294中描述)感染。感染后2.5天，將細(xì)胞用1%TritonX-100裂解，30分鐘后加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2并再溫育30分鐘。將收獲物經(jīng)過0.5pmClarigard濾膜及隨后經(jīng)過MillistakDE30/60濾膜(Millipore)過濾澄清。將澄清的收獲物用等體積的0.6MNaCl/50mMHEPESpH7.5稀釋，導(dǎo)致終濃度為0.3MNaCl，將稀釋的澄清收獲物用500kDflatscreencassette(Biomax500,Pellicon2moduleMillipore沐縮4倍，隨后用2個滲濾體積(DFV)的0.3MNaCl/50mMHEPESpH7.5;2個DFV的0.6MNaCl/50mMHEPESpH7.5;2個DFV的1.0MNaCl/50mMHEPESpH7.5及3個DFV的0.3MNaCl/50mMHEPESpH7.5滲濾。測定產(chǎn)生的滲透物的電導(dǎo)率，并通過SDS-PAGE分析樣品(圖3)。數(shù)據(jù)示出當(dāng)滲透物(及因此的滲余物)的鹽濃度在0.55和0.85MNaCl范圍或更高時，組蛋白(在凝膠上分子量為大約10—20kD，通過質(zhì)譜分析證實)穿過濾膜孔。一種可能的解釋是在這些鹽條件下靜電相互作用被破壞，導(dǎo)致組蛋白從復(fù)合物中釋出，穿過500kD孔。從這個實驗中推斷在UF/DF步驟期間導(dǎo)入高鹽緩沖液可以更有效地除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，特別是組蛋白。盡管在這個實施例中首先使細(xì)胞裂解，隨后用核酸酶處理(T/B)，但預(yù)期針對高鹽強度(高于0.55MNaCl，例如1MNaCl)的緩沖液進行滲濾在本發(fā)明的方法中也是有益的，其中在細(xì)胞裂解之前向其中加入核酸酶(B/T，見實施例l),盡管在B/T方法中已經(jīng)只有少量組蛋白污染(見圖2)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，澄清的裂解物用包含0.8—2.0MNaCl、優(yōu)選大約1MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液更換(見實施例1和圖4)。實嚴(yán)辨丄.A置邀癆毒煮y備激^餘去《染游樣歪力具有埃博拉病毒核蛋白作為轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒的產(chǎn)生如實施例5所描述。在這個實施例中描述了這種病毒的純化。實驗3.1Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP使用所述方案純化(見實施例1，圖4)。這種方法導(dǎo)致表達(dá)的埃博拉病毒核蛋白(NP)轉(zhuǎn)基因與病毒的共純化。將終產(chǎn)物(filledandfinishedproduct)用含有5MNaCl(終濃度為2.5M)或者2%Tween20(終濃度為1%)的緩沖液以1:2稀釋，在室溫溫育1小時，之后加樣于Sepharose4FF柱上。對空的(void)和滯留級分通過SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖5)示出空的級分含有不含污染性完整NP的5型腺病毒。迄今為止，用高鹽獲得的結(jié)果看起來可再現(xiàn)，而用去污劑的則不能再現(xiàn)，因此優(yōu)選高鹽。然而對于去污劑的最佳條件可以通過改變使用的去污劑及其濃度而測試。結(jié)論Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP載體可以從埃博拉病毒核蛋白中純化，所述純化通過在含有2.5MNaCl或者l。/oTween、優(yōu)選2.5MNaCl的緩沖液中溫育，隨后在4FFsepharose上分離而實現(xiàn)。實驗3.2Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP使用所述方案純化(見實施例1,圖4)。終產(chǎn)物使用10kD膜用含有1、2、3或者5MNaCl的50mMTRIS緩沖液pH7.5透析。將Ad5.Ebo.NP在這些緩沖液中溫育2小時或者過夜，之后加樣于Sepharose4FF柱上。對空的和滯留的級分通過SDS-PAGE分析。結(jié)果示出空的級分含有明顯較少NP的5型腺病毒。如表2所示，NP除去的量與鹽濃度和溫育時間相關(guān)。結(jié)論通過在含有2—5MNaCl的緩沖液中溫育，隨后在4FFsepharose上分離，Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP載體可以從埃博拉病毒核蛋白中純化。在4FF柱分離之前較長的溫育時間和較高的鹽濃度產(chǎn)生較高純度的Ad5.Ebo.NP載體(除去更多的核蛋白)。使用相同的方法，以較長時間溫育(例如2天，1周)對1M和1.5MNaCl濃度進行測試，以發(fā)現(xiàn)在這些鹽強度下進行較長時間溫育是否可以滿足純化需要。實驗3.3這個實驗示于圖6。將PERC.6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長并用Ad5.dE3x.Adapt.Ebo.NP感染。感染后2.5天，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2，10分鐘后將細(xì)胞用l°/。TritonX-100裂解，再溫育50分鐘。將收獲物經(jīng)過0.5^imClarigard濾膜澄清，隨后經(jīng)過Sartopore2濾膜(0.8/0.45nm，Sartorius)澄清。將澄清的收獲物分成兩部分。一部分使用0.5pm中空纖維(Spectrum)濃縮5倍并用含有5MNaC1/50mMTrispH7.5的緩沖液滲濾。這樣導(dǎo)致跨膜壓力(TMP)增加和滲透物流量減少，同時滲余物看起來變?yōu)榘咨该鞫冉档?，表明蛋白質(zhì)沉淀。將澄清的收獲物的第二部分使用0.5^m中空纖維(Spectrum)濃縮5倍，并用6DFV的l.OMNaCl/50mMTRISpH7.5及隨后用4DFV的0.4MNaCl/50mMTRISpH7.5滲濾。最終的滲余物經(jīng)過SepharoseQ-XL柱(Amersham)純化。將Q-XL洗脫物也分成兩部分。將一部分以組分離模式(加樣20%柱體積)經(jīng)過大小排阻柱(Sepharose4FF)進一步純化并用25mMNaCl/20mMTRIS/2.5。/。甘油(配制緩沖液)進行緩沖液更換，這樣產(chǎn)生圖6所示產(chǎn)物A。將另一部分使用0.05pm中空纖維(Spectrum)用6DFV的5MNaCl/50mMTRISpH7.5滲濾，這被進一步稱作高鹽病毒級分。盡管中空纖維的孔徑(0.05pm，大約800kD)足夠大，可以通過100kD核蛋白，但在滲透物中無核蛋白可被檢測到，并且在滲余物中核蛋白的量未見減少?？赡苁且换蚨鄠€TFF參數(shù)的調(diào)節(jié)(例如剪切增加)可以改良核蛋白的純化。我們進一步使用大小排阻(組分離)方法實現(xiàn)這個目標(biāo)。將高鹽病毒級分再次分成兩部分，一部分經(jīng)過大小排阻(組分離)柱直接純化并用配制緩沖液進行緩沖液更換(圖6中產(chǎn)物B)，而第二部分在室溫貯存過夜，之后經(jīng)過大小排阻(組分離)柱純化和進行緩沖液更換(圖6中產(chǎn)物C)。對這三個純化的產(chǎn)物進行分析以確定純度、感染性、產(chǎn)量、聚集和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。SDS-PAGE和Western分析示于圖7，示出完整的核蛋白以及NP降解產(chǎn)物(通過質(zhì)譜分析證實是NP降解產(chǎn)物)分別從產(chǎn)物A、B和C中逐步增加地被除去。反向分析(RP-HPLC)(圖8)示出完整核蛋白以及NP降解產(chǎn)物(在39分鐘洗脫)的量通過進行高鹽滲濾步驟從大約50%(產(chǎn)物A)降低至<5%(產(chǎn)物B)，在5MNaCl中室溫貯存過夜后甚至低于檢測限度1°/。(產(chǎn)物C)。使用這兩種分析方法均未觀測到對病毒蛋白的作用。轉(zhuǎn)基因表達(dá)示出，感染性未受影響及無聚集發(fā)生(對于所有這三個產(chǎn)物A、B和C)。顯然，重組病毒在高鹽中甚至溫育過夜也不導(dǎo)致病毒質(zhì)量的明顯降低。代替使用或者除了使用延長溫育時間的高鹽和隨后的大小排阻層析之外，將用5MNaCl緩沖液更換的病毒懸浮液直接使用0.45pm親水性濾膜(Millipac20)過濾。出乎意料地，這樣導(dǎo)致NP完全從病毒中除去(圖9)。使用不同孔徑(例如1.2、1.0、0.8、0.22nm)的濾膜重復(fù)這個實驗以確定可能的孔徑范圍。對0.8/0.45|imSartopore-2組合也進行了測試。這個過濾步驟可適當(dāng)?shù)嘏c隨后的大小排阻層析步驟組合，并且在高鹽溶液中可能需要較短的病毒溫育時間，使得處理時間可能縮短。結(jié)論1.用5MNaCl對澄清的收獲物進行滲濾是不可能的，可能是因為發(fā)生宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)沉淀。2.高度純化的Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP在5MNaCl中溫育，隨后在Sepharose4FF上分離或者通過親水性濾膜過濾導(dǎo)致Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP從埃博拉病毒核蛋白中純化。3.使得溫育步驟從2小時延長至過夜導(dǎo)致殘留的核蛋白從<5%進一步減少至<1%。通過親水性濾膜的過濾可減少需要的溫育時間而獲得相同的結(jié)果。因此，可以通過在至少2MNaCl、優(yōu)選至少3MNaCl、更優(yōu)選5MNaCl中溫育而從表達(dá)核酸結(jié)合蛋白如核蛋白，例如埃博拉病毒核蛋白的重組病毒中除去這些蛋白質(zhì)，從而純化成批的這種病毒。淑舒澄微不離篪將PER.C6細(xì)胞在10L生物反應(yīng)器中生長，并在獨立實驗中用不同的重組腺病毒感染。在感染后2.5天，將細(xì)胞用1%TritonX-100裂解，30分鐘后加入Benzonase(50單位/ml)和MgCl2并再溫育30分鐘。將收獲物用于澄清實驗。深層濾膜例如Clarigard和Polygard濾膜具有高度回收(>90%)及良好的除去細(xì)胞碎片能力(顯微鏡分析)，發(fā)現(xiàn)其可適合用作初始的澄清濾膜。然而，過濾物看起來仍然是乳白色的。發(fā)現(xiàn)MillistakDE30/60和CE50不太適合用于過濾T/B收獲物，因為會喪失病毒(20—45%)。在后來的級分中，產(chǎn)量增加但乳白色的滲余物降低，表明達(dá)到過濾容量。對一些濾膜進行測試以進一步澄清通過Clarigard過濾產(chǎn)生的過濾物；例如Milligard0.5nm、1.2jam和1.2/0.22jim，Durapore0.22和0.65iam，Lifegard1.0禾B2.0nm(全部Millipore)禾卩Sartopore-20.8/0.45pm(Sartorius)。Sartopore2濾膜在這些測試的濾膜中是唯一具有乳白色物良好滯留、高容量(>20ml/cm"以及高病毒產(chǎn)量(>95%)的濾膜。將澄清的收獲物使用平板篩(flatscreen)或者中空纖維模塊濃縮和滲濾。測試一些濾膜過濾終滲余物的情況，優(yōu)選0.45Kim孔徑，以使得終滲余物適于層析，所述濾膜例如Millipack20，Lifegardl.Opm，Polygard0.6|am，InterceptQ、Milligard1.2/0.5(im。同樣，Sartopore2濾膜是測試的那些濾膜中唯一具有乳白色物良好滯留、高容量以及高病毒產(chǎn)量(>95%)的濾膜。盡管這些實驗使用T/B收獲物進行，但隨后的實驗證實上述結(jié)果也同樣產(chǎn)生于根據(jù)本發(fā)明的B/T收獲物，因此使用本發(fā)明的方法，Sartopore2濾膜提供非常好的結(jié)果。因此，對于本發(fā)明方法中的澄清步驟，優(yōu)選使用0.8nm和0.45^im濾膜的組合，優(yōu)選使用Sartopore2濾膜。實細(xì)5.'豬游置蘊嚴(yán)蘇游產(chǎn)主辦靴使用本發(fā)明的方法純化各種重組腺病毒。這些病毒可例如根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，通過在包裝細(xì)胞中基因組的左側(cè)端部分(有時稱作"銜接子質(zhì)粒(adapter-plasmid)"，用于方便地克隆轉(zhuǎn)基因)和右側(cè)端部分的同源重組而產(chǎn)生，例如EP0955373、WO03/104467和WO2004/001032所述。病毒可以在本領(lǐng)域已知的包裝細(xì)胞中增殖，這些包裝細(xì)胞例如為293細(xì)胞、PER.C6TM細(xì)胞(例如在ECACC中以保藏號96022940保藏的細(xì)胞，見美國專利5,994,128所述)或者表達(dá)Ad35的E1B55K蛋白的PER.E1B55K細(xì)胞(見美國專利6,492,169所述)。根據(jù)本發(fā)明的方法純化的重組腺病毒的構(gòu)建在這個實施例中描述。具有埃博拉病毒轉(zhuǎn)基因的腺病毒，游產(chǎn)f使用正向引物64015'GCACCGGTGCCGCCATGGATTCTCGTCCTCA3'(SEQ.ID.NO.l)和反向引物64015'GCGCTAGCTCACTGATGATGTTGCAG3'(SEQ.ID.NO.2)，將編碼埃博拉病毒Zaire亞型核蛋白的基因通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增，以導(dǎo)入限制性核酸內(nèi)切酶識別位點和最佳翻譯起始的共有序列(KozakM,1987,AtleastsixnucleotidesprecedingtheAUGinitiatorcodonenhancetranslationinmammaliancells.JMolBiol.20:947-950)，以在pAdApt;TM中定向克隆(見EP0955373)。PCR反應(yīng)在BiometraTl或T3熱循環(huán)儀中進行，使用10nm每種引物、0.75plVRC6401的微量制備的DNA(見WO03/028632)、1.5單位/VoDNA聚合酶、5|il10XPCR緩沖液、0.5pl20mMdNTP，在如下條件下進行反應(yīng)I個循環(huán)5'94'C、1'50。C、4'72。C;5個循環(huán)1'94。C、1'50。C、4'72。C;20個循環(huán)1'94。C、1'62。C、4'72。C;l個循環(huán):1'94。C、1'62。C、10'72。C。隨后將正確大小的PCR產(chǎn)物用戶/"AI的同切點酶)消化，連接進用尸/"AI和//;^I消化的pAdAptTM載體中。在將片段在室溫連接2小時后，將50%的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5aT1R細(xì)胞，并鋪板于補加了50pg/ml氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板上。挑取20個菌落并在補加了氨芐青霉素的LB中在37-c生長過夜。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)進行提取。在用///"dm和^^I進行限制酶分析之后，選擇正確的克隆，通過DNA序列分析進一步檢測。.￡』G7YZ」游產(chǎn)主使用正向引物6001(5'CCCAAGCTTGCCGCCATGGGCGTTACAGG3')(SEQ.ID.NO,3)和反向引物6001(5'GGCTCTAGATTACTAAAAGACAAATTTGC3')(SEQ.ID.NO.4)，將編碼埃博拉病毒Zaire亞型全長糖蛋白的基因通過PCR擴增。PCR反應(yīng)在BiometraTl或T3熱循環(huán)儀中進行，使用10pM每種引物、100ng和25ngVRC6001的DNA(見WO03/028632)、1.5單位iVoDNA聚合酶、5|il10XPCR緩沖液、0.5^U20mMdNTP，在如下條件下進行反應(yīng)1個循環(huán)5'94°c、1'55。c、4'72。c;5個循環(huán)1'94。c、1'55。c、4'72。c;20個循環(huán)1'94。c、1'64。c、4'72。c;1個循環(huán)1'94。c、1'64。c、10'72。c。隨后將正確大小的pcr產(chǎn)物用/f^nn和J^ai消化，連接進同樣消化的pAdAptTM載體中。在室溫將片段連接2小時后，將50%的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5aTlR細(xì)胞，并鋪板于補加50pg/ml氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板上。挑取菌落并在37t:在補加氨芐青霉素的LB平板上生長過夜。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)進行提取。在用/^"dIII和WaI進行限制酶分析后，選擇正確的克隆并通過DNA序列分析進一步檢觀IJ。如上述相似地將編碼缺失C末端29個氨基酸的長跨膜結(jié)構(gòu)域的埃博拉病毒Zaire亞型和Sudan/Gulu糖蛋白的密碼子優(yōu)化的序列(分別為GPdTM(Z)和GPdTM(S)，也見WO03/028632所述)克隆進pAdapt中。具有埃博拉病毒轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒的產(chǎn)生將具有不同插入體的pAdapt質(zhì)粒(pAdapt.EbolaNP、pAdapt.EbolaGP(Z)、pAdapt.EbolaGPdTM(S)、pAdapt.EbolaGPdTM(Z)),用于通過與包含腺病毒5型基因組的剩余部分的質(zhì)粒(質(zhì)粒PWE/Ad.AflII-rITRspAE3，其是在E3區(qū)域(XbaI區(qū)域)具有1878bp缺失的pWE/Ad.Aflll-rlTRsp(見EP0955373)，其用于腺病毒基因組的右端)根據(jù)熟知的方法(例如EP0955373所述方法)進行同源重組形成重組腺病毒，產(chǎn)生分別稱作Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP(Z)、Ad5dE3x,Adapt.Ebo.GPdTM(S)和Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z)的病毒。當(dāng)然，所述轉(zhuǎn)基因可以相似地克隆進不同血清型的腺病毒載體中，如克隆進Ad35中，產(chǎn)生衍生自那些血清型的重組腺病毒(見例如WO00/70071所述)。具有瘧原蟲轉(zhuǎn)基因的腺病毒.CS.準(zhǔn)/c浙p4—535.GS.，/c游產(chǎn)主如WO2004/055187所述，合成惡性瘧原蟲的密碼子優(yōu)化的環(huán)子孢子(CS)基因并克隆進pCR-script(Stratagene)中，產(chǎn)生克隆02-659。將CS基因克隆進pAdapt和pAdapt535(見WO2004/001032)中，以分別產(chǎn)生重組Ad5和重組Ad35載體。將克隆02-659和兩種pAdapt載體均用fl7"din和Bam//1消化并連接。在室溫將片段連接2小吋后，將50%的混合物通過熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5aT1R細(xì)胞，鋪板于補加了50(ig/ml氨芐青霉素LB瓊脂上。挑取菌落并在補加氨芐青霉素的LB中在37'C生長。微量制備的DNA使用QiagenminiprepSpin試劑盒進行提取。在用州'mniI和J^al進行限制酶分析后，選擇正確的克隆并通過DNA序列分析進一步檢測。如下產(chǎn)生具有惡性瘧原蟲CS基因的重組腺病毒血清型5(見例如EP0955373所述，也見于WO2004/055187所述)。將pAdapt.CS.Pfalc用Pacl限制酶消化以釋放Ad基因組的左端部分。含有Ad5基因組右端部分的質(zhì)粒pWE/Ad.AfllI-rlTRspAE3在E3區(qū)域缺失1878bp(Xbal缺失)，并且也用Pacl消化。將消化的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染進如在ECACC中以保藏號96022940保藏的PER.C6細(xì)胞中。基于重疊序列的同源重組，形成稱作Ad5AE3.CS,Pfalc的重組病毒。相似地產(chǎn)生具有惡性瘧原蟲CS基因的重組腺病毒血清型35，但是現(xiàn)在Pacl消化的pAdapt535.CS.Pfalc用作病毒基因組的左端，NotI-消化的pWE,Ad35.pIX-rlTRAE3(見WO2004/001032)用作病毒基因組的右端，將這兩個載體均轉(zhuǎn)染進PER-E1B55K生產(chǎn)細(xì)胞(具有衍生自Ad35的E1B-55K序列；細(xì)胞已經(jīng)在美國專利6,492,169中描述)中?；谥丿B序列的同源重組，形成稱作Ad35AE3.CS.Pfalc的重組病毒。當(dāng)然，也可以將Ad35病毒主干(backbone)中的E4-orf6蛋白改變?yōu)锳d5的E4-orf6，以使得這種病毒可以在表達(dá)Ad5的E1B蛋白的包裝細(xì)胞如PER.C6或者293細(xì)胞上繁殖(見WO03/104467)。Ad5AE3.CS，Pfalc和Ad35AE3.CS.Pfalc根據(jù)本發(fā)明的方法純化。另夕卜，基于具有Ad35主干的pAdapt535.CS.Pfalc，構(gòu)建了具有CS基因的Ad35載體，其在E3中有缺失并另外包含Ad5的E4-or傷，這個載體進一步稱作Ad35.CS。將一些腺病毒載體在2—20L規(guī)模用所述方法純化(實施例1，圖4):Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z)、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(S)、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP和Ad5dE3x.Adapt.Empty。對終產(chǎn)物(FilledandFinished,F&F)通過反向和SDS-PAGE分析純度，發(fā)現(xiàn)被純化為接近同質(zhì)(homogeneity)(除了在具有埃博拉病毒核蛋白作為轉(zhuǎn)基因的載體制備物中存在埃博拉病毒核蛋白之外)。殘留的宿主細(xì)胞DNA的量通過Q-PCR測定，并且低于100pgDNA/1E11VP(如表1所示)。通過在320和260nm測定光密度及通過圓盤離心而測定聚集。無一批次示出聚集。在所有批次中均通過低于10的VP/IU比率示出潛力，在A549細(xì)胞中示出轉(zhuǎn)基因表達(dá)。根據(jù)規(guī)模，最終產(chǎn)量范圍是20—50%:2L:24—26%(n=2);10L:30-37%(n=3);20L:46%(n=l)。實應(yīng)激6,使帝歷,7交橫屋橋與伊I^冶濾蘑錄眾^3J將PER.C6細(xì)胞在攪拌罐中生長至細(xì)胞密度為大約1百萬個細(xì)胞/ml。用Ad35.CS載體感染細(xì)胞，MOI為40。在病毒產(chǎn)生4天后，將感染的細(xì)胞培養(yǎng)物如實施例1所述用Benzonase和TritonX-100處理(B/T方法)。如實施例1所述澄清B/T收獲物。將澄清的收獲物通過TFF濃縮5倍(使用0.05^im中空纖維)，隨后用10個滲濾體積的0.1MNaCl、0.05%PS80、50mMTrispH7.5滲濾。將濃縮和滲濾的滲余物經(jīng)0.45nm濾膜過濾，加樣于捕獲柱或濾膜上。作為一個捕獲步驟，測試Q-XL柱(3ml柱，15cm柱床高度)或者Sartobind75濾膜(含有陰離子基團的帶電濾膜，Sartorius)。將結(jié)合的成分在基于TRIS的緩沖液中以0—1MNaCl梯度洗脫。帶電濾膜的洗脫模式示出在梯度開始處的一個額外峰，其與Ad35峰分離。與Q-XL樹脂、0.39MNaCl(從0.19開始，以0.53MNaCl結(jié)束)相比，Ad35病毒峰在較高鹽濃度0.44MNaCl(從0.41開始，以0.49MNaCl結(jié)束)以更尖銳的峰洗脫自帶電濾膜。將洗脫級分通過SDS-PAGE、HPLC-AEX、圓盤離心和TCID50分析。當(dāng)通過HPLC-AEX層析和圓盤離心分析時，額外峰未表現(xiàn)是完整的Ad35病毒顆粒(圖11)。對層析級分進行SDS-PAGE分析示出如下結(jié)果(圖12):在兩種實驗中均未觀測到蛋白質(zhì)或者觀測到極低量蛋白質(zhì)。帶電濾膜層析的額外峰示出一些但非全部的Ad35蛋白質(zhì)。在額外峰中，病毒蛋白質(zhì)IIIa、V、VI和VII看起來不見了，而病毒蛋白質(zhì)II、III、IV和52.55k存在。從這些分析中可以推斷帶電濾膜可以從完整的病毒顆粒中分離出病毒蛋白質(zhì)，而Q-XLsepharose不能。如果未發(fā)生分離，則很可能不能被如RP-HPLC或SDS-PAGE等評估純度的測定檢測到，因為在額外峰中存在的所有蛋白質(zhì)也均存在于完整的病毒粒中。表l:通過將T/B顛倒為B/T收獲方法，在純化的產(chǎn)物樣品中殘余宿主細(xì)胞DNA的量的減少。收獲物在2-20L規(guī)模純化。詳細(xì)描述參見實施例1。<table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表2:在不同離子強度下和不同溫育時間后的NP清除。詳細(xì)描述參見實施例3。<table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>序列表<110>克魯塞爾荷蘭公司<120>病毒純化方法<130>0100WO00ORD<160>4<170>Patentlnversion3,2<210>1<211>31<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerforward6401<400>1gcaccggtgccgccatggattctcgtcctca31<210>2<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerreverse6401<400>2gcgctagctcactgatgatgttgcag26<210>3<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerforward6001<400>3cccaagcttgccgccatgggcgttacagg29<210>4<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>primerreverse6001<400>4ggctctagattactaaaagacaaatttgc29權(quán)利要求1.一種從重組腺病毒制備物中除去游離腺病毒蛋白的方法，所述方法包括如下步驟用含有陰離子交換基團的帶電濾膜處理包含游離腺病毒蛋白的重組腺病毒制備物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組腺病毒制備物包含B亞群重組腺病毒。3.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述重組腺病毒是Ad35重組腺病毒。4.純化B亞群重組腺病毒顆粒的方法，所述方法包括對所述B亞群重組腺病毒顆粒進行陰離子交換濾膜純化步驟。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述B亞群重組腺病毒是Ad35重組腺病毒。6.包含陰離子交換基團的帶電濾膜在去除重組腺病毒制備物中的游離腺病毒蛋白中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種從宿主細(xì)胞中純化病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，b)用病毒感染所述宿主細(xì)胞，c)用核酸酶處理所述細(xì)胞培養(yǎng)物，d)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述病毒的裂解物。所述病毒優(yōu)選是重組腺病毒。本發(fā)明還提供了一種純化重組病毒的方法，所述重組病毒表達(dá)一種能結(jié)合核酸的異源蛋白質(zhì)，所述方法包括如下步驟a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，b)用所述重組病毒感染所述宿主細(xì)胞，c)裂解所述宿主細(xì)胞以提供包含所述重組病毒的裂解物，d)將所述重組病毒進行陰離子交換層析和大小排阻層析，其特征在于將含有病毒的混合物用包含至少2MNaCl或者提供相等離子強度的另一種鹽的溶液進行至少一次緩沖液更換。文檔編號C12N7/00GK101343625SQ200810130050公開日2009年1月14日申請日期2005年2月21日優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日發(fā)明者埃米爾·約安內(nèi)斯·約瑟夫斯·瑪麗亞·范考文,米蘭達(dá)·韋格曼申請人:克魯塞爾荷蘭公司