專利名稱：埃博霉素b內(nèi)酰胺衍生物的制備方法
埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的制備方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種埃博霉素衍生物的生產(chǎn)方法，具體地說涉及一種通過粘細(xì)菌中纖維堆 囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素D，然后以其為起始原料，通過半合成方法生產(chǎn)埃博霉素B內(nèi)酰胺 衍生物的方法。
背景技術(shù)：
埃博霉素(epothilones)是由黏細(xì)菌纖維素堆囊菌分泌的結(jié)構(gòu)為16元內(nèi)酯大環(huán)為中心 體，噻唑環(huán)配基為側(cè)鏈的一類細(xì)胞毒性化合物，是一種具有類似紫杉醇微管蛋白聚合和微 管穩(wěn)定作用的新抗腫瘤藥物。埃博霉素A和B是在20世紀(jì)90年代由H5fle及其同事最先 從南非Zambesi河岸的泥土中找到 一 種黏細(xì)菌纖維素堆囊菌Somwg/"m ce//w/asM/w(Myxococcales)菌株Soce90，從其培養(yǎng)物中分離提取了一種具有抗癌活性的化 合物。埃博霉素A、 B、 C 、 D結(jié)構(gòu)式如下O OH OEpothllone D R=Me EpothlloneC R=HEpothl，one B R-Me Epothilone A R-H埃博霉素是一種具有類似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤化合物。 埃博霉素目前被世界上公認(rèn)為21世紀(jì)將取代紫杉醇的最有效的抗癌藥物。與紫杉醇比較，埃博霉素水溶性好，注射、口服均可；結(jié)構(gòu)簡單，有利于化學(xué)合成及衍生化；埃博霉素在P-糖蛋白表達(dá)型的多藥耐藥性(MDR)細(xì)胞中也維持很大的細(xì)胞毒性，約為紫杉醇的 2000~5000倍。目前，已有5種埃博霉素類似物進(jìn)入n和in期臨床試驗(yàn)，它們是埃博霉素B、埃博霉素D、 Ixempa(ixabelilone)、 ZK-EPO和BMS-310706。其中施貴寶公司的Ixempa于2007 年10月16日被FDA批準(zhǔn)作為一線乳癌的治療藥物。Ixempa實(shí)際上是一種Aza-epothilone B，即埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。它是由纖維堆囊菌So ce90(DSM6773)經(jīng)UV誘變得到 Soce90B2菌株，然后再經(jīng)亞硝基胍(NTG)誘變育種，得到一株高產(chǎn)菌株SC16408，發(fā) 酵得到埃博霉素B。然后，以發(fā)酵產(chǎn)物埃博霉素B為起始原料轉(zhuǎn)化為埃博霉素B內(nèi)酰胺衍 生物(CN1705662A)。施貴寶公司的另一個專利(WO2004026254)是采用全合成方法經(jīng) 20余步反應(yīng)，得到埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。閻家麒(CN1554659)則是以全合成埃博 霉素B為原料，采用區(qū)域性和立體選擇性鈀催化大環(huán)內(nèi)酯氮化反應(yīng)，促使埃博霉素B開 環(huán)，得到一種氮酸，再經(jīng)三苯膦處理，生成亞氨基正膦，經(jīng)氫氧化銨水解成為氨基酸。最 后用二苯基磷酰疊氮化物(DPPA)和固體碳酸氫鈉促進(jìn)氨基酸環(huán)化反應(yīng)，得到標(biāo)的的埃博 霉素B內(nèi)酰胺衍生物。O OH O埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物(Ixempa ， BMS-247550, Aza-epothilone B)微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)埃博霉素的產(chǎn)量都很低，只有原始文獻(xiàn)(Hofle，Gerth et al， The Journal of Antibiotics, 1996,49:560)埃博霉素A和B產(chǎn)率分別為22和llmg/L。但是，其后 許多文獻(xiàn)重復(fù)Hofle發(fā)酵方法，均未得到該產(chǎn)率。即使經(jīng)誘變選育的"高產(chǎn)菌株"實(shí)際也 只有埃博霉素Al.(K6.0mg/L和埃博霉素B0.5 3.0mg/L。邱榮國(CN1629283)采用UV 誘變育種方法，獲得了一種以埃博霉素D為主要代謝產(chǎn)物的新菌株S. celulosum BGS4。獲得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他條件相同的情況下，該類菌株只產(chǎn)生埃 博霉素C和D，而不產(chǎn)生埃博霉素A和B。目前，缺乏一種高產(chǎn)埃博霉素D的生物合成方法，尤其是適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)埃博 霉素D的實(shí)用技術(shù)，進(jìn)而以其為起始材料，采用簡易的半合成方法，制造抗癌藥物埃博霉 素B內(nèi)酰胺衍生物。發(fā)明內(nèi)容粘細(xì)菌的纖維素堆囊菌原始菌株目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率低，采用物理或化學(xué)方法誘變育種， 所得到的菌株生產(chǎn)能力仍然不理想。在埃博霉素生物合成中，影響基因突變的因素很多。纖維素堆囊菌Soce90與埃博霉素生物合成有關(guān)的基因簇進(jìn)行的篩選和全測序，獲得 了埃博霉素合成酶基因的全部序列。埃博霉素生物合酶全長約56kb，是聚酮合酶/非核糖體肽合成酶的雜合體基因簇，即同時含有I型聚酮合酶(PKS)模板和非核糖體肽合成酶 (NRPS)。埃博霉素生物合酶依照轉(zhuǎn)錄順序依次是epoA(l個負(fù)載模板) epoP(l個 NRPS模板)_^epoB(1個PKS模板) epoC(4個PKS模板)一一epoD(2個PKS模板) epoE(l個PKS模板)^ epoF(環(huán)氧酶P450)，這些基因的轉(zhuǎn)錄方向一致，同時 由于epo^/epo尸，卬o5/e/wC中存在基因的重疊現(xiàn)象，推測epo4/epo戶，印oB/e;wC可能共轉(zhuǎn) 錄。而在e/wiy印oB(147bp),e/wi)/e/w五(15bp)和e;w五/e;w^(115bp)基因之間短小的間區(qū)序 列中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止子，這表明所有這些基因可能是由一個異常大的操縱子(》56kb)構(gòu)成。根據(jù)同位素13<:標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果和合成酶全基因簇功能的推測，埃博霉素的生物合成包括5個階段① 聚酮鏈的引發(fā)在?；D(zhuǎn)移酶的作用下，活化載體蛋白，形成活化中心。② 鏈合成的起始和噻唑環(huán)的形成在印OA和印OP模板的共同作用下催化乙?；桶腚装彼幔s合形成埃博霉素合成的特殊起始物一2-甲基噻唑五元雜環(huán)。③ 鏈的延伸和轉(zhuǎn)移埃博霉素骨架每經(jīng)過一個模板就有一個二碳單元結(jié)合到聚酮鏈上，并加以適當(dāng)?shù)男揎?。在延伸階段，埃博霉素骨架依次經(jīng)過印oB(l個PKS模板)、印oC(4個PKS模板)、印oD (2個PKS模板)和印oE (1個PKS模板)，共經(jīng)過了 8個模板， 形成了埃博霉素的16元骨架。④ 鏈合成的終止釋放和環(huán)化在進(jìn)行到印oE的末端的時候，16元環(huán)的骨架從活化位 點(diǎn)轉(zhuǎn)移到印oE末端區(qū)域中硫酯酶的絲氨酸位點(diǎn)上，終止了鏈的合成。在環(huán)化酶的作用下， 自身分子內(nèi)環(huán)化，解離形成16元大環(huán)內(nèi)酯類化合物。⑤ 產(chǎn)物的后修飾:埃博霉素基因序列中的P450(印oF)是由420個氨基酸組成，氨基酸序列與細(xì)胞色素P450氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素C12-C13之間的環(huán)氧化，使 埃博霉素C和D環(huán)氧化成為埃博霉素A和B。突變該基因，可以使埃博霉素的合成停留在 C和D上。本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明以纖維堆囊菌ATCC15384為出發(fā)菌株，首先使用一種epoK的抑制劑，致使 基因突變，由于新菌株缺乏epoK氧化酶功能，抑制了 C12-C13環(huán)氧化反應(yīng)，使得埃博霉 素C和D向埃博霉素A和B的轉(zhuǎn)化受到遏制，因而，該菌株只產(chǎn)生埃博霉素C和D，而 不產(chǎn)生埃博霉素A和B。然后，將該突變菌株通過UV誘變育種，獲得一種埃博霉素D 的高產(chǎn)菌株，用于提高埃博霉素D的產(chǎn)量。本發(fā)明提供的埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的新制備方法，是以埃博霉素D作為起始原 料合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。該方法特征在于埃博霉素D經(jīng)C12和C13環(huán)氧化得到 埃博霉素B，再以埃博霉素B為原料，采用立體選擇性三苯基膦鈀催化大環(huán)內(nèi)酯氮化反應(yīng)， 促使埃博霉素B開環(huán)，得到一種氮酸，再經(jīng)三甲基膦處理，生成亞氨基正膦，經(jīng)水解成為 氨基酸。最后用HOBt-EDCl促進(jìn)氨基酸環(huán)化反應(yīng)，得到標(biāo)的的埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。下面對本發(fā)明方法作進(jìn)一步描述以粘細(xì)菌的纖維堆囊菌ATCC15384為出發(fā)菌株，培養(yǎng)基含有水和其他習(xí)用的組分， 如生物大分子化合物、糖、氨基酸、鹽、核酸、維生素、抗菌素，微量元素，以及來源于 生物材料的酵母提取物、脫脂大豆粉、馬鈴薯淀粉等。突變epoK基因產(chǎn)物-細(xì)胞色素P450氧化酶，采用的epoK抑制劑包括metyrapone和 ketoconazole， itraconazole, miconazole，fiirafylline，sulfaphenazole， proadifen，debrisoquin等具 有炔類作用機(jī)理的不可逆抑制劑。其中更優(yōu)選的是metyrapone。 Metyrapoiie在培養(yǎng)基中 有效地抑制epoK，增加埃博霉素C和D的產(chǎn)量而不抑制菌株的生長。抑制劑加入發(fā)酵培 養(yǎng)基的終濃度為lnM至1M，優(yōu)選1 u M至100mM,更優(yōu)選的是10u M至10mM，在發(fā) 酵開始時一次或發(fā)酵過程中分批加入。通過基因突變處理，致使纖維堆囊菌的epoK基因失活，所獲得的變異菌株，由于缺 乏功能性epoK，產(chǎn)生的埃博霉素A和B大為減少或者不產(chǎn)生埃博霉素A和B。突變菌株 可以通過一次或多次誘變獲得，如紫外線誘變育種，照射200nm~400nm，優(yōu)選 250nm 300nm，所得的突變菌株以埃博霉素C和D為主要產(chǎn)物而不產(chǎn)生埃博霉素A和B。突變菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素的出發(fā)菌株，得到的埃博霉素C和埃博霉素D采用動態(tài)軸向壓縮色譜分離。得到的埃博霉素C可用于半合成埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物，埃博霉素D可用于半合成本發(fā)明標(biāo)的物——埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。半合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的方法是先以埃博霉素D為原料，采用w-CPBA (1.5equiv)環(huán)氧化重排反應(yīng)，立體選擇性(4-5:1)生成埃博霉素B，埃博霉素B在鈀催 化下開環(huán)，在疊氮鈉作用下生成氮酸。鈀催化劑優(yōu)選三苯基膦鈀(lequiv)，然后用三苯基 膦處理，得到一種氨基酸，氨基酸在1-羥基苯基三氮唑(HOBt)和EDCI作用下，得到 埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。上述合成步驟可以分三步進(jìn)行，也可以將三不并成一步(三步 一鍋)。本發(fā)明的新穎性在于1、 纖維堆囊菌(以soce90為例)，無論采取馴化或是UV和NTG誘變育種，只能有 限地提高埃博霉素A和B的產(chǎn)量，而埃博霉素C和D產(chǎn)量極少。本發(fā)明的纖維堆囊菌采 用epoK抑制劑，突變epoK基因產(chǎn)物-細(xì)胞色素P450氧化酶，使纖維堆囊菌中的epoK失 活，該突變菌株可以定向獲得埃博霉素C和D，不產(chǎn)生埃博霉素A和B。2、 產(chǎn)生埃博霉素C和D的突變菌株再經(jīng)UV誘變育種，獲得只產(chǎn)生埃博霉素D的高 產(chǎn)菌株，該菌株用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素D。3、 用突變的新菌株發(fā)酵生產(chǎn)可同時得到兩種埃博霉素產(chǎn)物，埃博霉素C和埃博霉素 D，前者可用于半合成埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物(另一種具有微管解聚抑制劑)，后者可 以半合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。 一舉兩得。4、 以分離得到的埃博霉素D為起始材料，經(jīng)兩步即可合成得到埃博霉素B內(nèi)酰胺 衍生物，合成路線短，產(chǎn)率高(~32%)。適合放大生產(chǎn)。


圖1為埃博霉素生物合成路線圖2為由ATCC15384經(jīng)epoK抑制劑處理得到的突變菌株發(fā)酵產(chǎn)生的埃博霉素C和D圖3為突變菌株經(jīng)UV誘變處理得到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)生埃博霉素D具體實(shí)施方式
實(shí)施例l基因突變和定向篩選，得到一個含有失活epoK基因的纖維堆囊菌突變菌株 出發(fā)菌株為粘細(xì)菌菌株中的纖維堆囊菌(Som"g/"wceZ/"/cw"w) ATCC15384，是從美 國菌種保藏中心得到。上述菌株接種在固體培養(yǎng)基上，斜面固體培養(yǎng)基成分為大豆蛋白胨8g/L,馬鈴薯粉20g/L,酵母提取物10g/L,無水葡萄糖5g/L， CaCl2'H20 lg/L， MgS04'7H20 lg/L， Fe-EDTA8mg/L，瓊脂粉15g/L。 30。C培養(yǎng)5d后，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。液體發(fā)酵培養(yǎng) 基成分為大豆蛋白胨10g/L，馬鈴薯淀粉20g/L，酵母提取物4g/L，無水葡萄糖15g/L， CaCl2.H20 lg/L， MgS04'7H20 lg/L, Fe-EDTA8mg/L，樹脂XAD-16 20ml/L。 30°C， 120 轉(zhuǎn)/分，搖床培養(yǎng)4d。加入epoK抑制劑Mytyrapone使終濃度為5mM至10mM。 30'C， 120 轉(zhuǎn)/分，搖床繼續(xù)培養(yǎng)7d。檢測培養(yǎng)物中產(chǎn)生的埃博霉素C和埃博霉素D:取培養(yǎng)物50ml，用尼龍篩(孔隙150um)過濾，用少量水沖洗保留在尼龍篩上的樹 脂，然后與濾膜一起置于50ml離心管中，加入異丙醇10ml，密封。以180轉(zhuǎn)/分搖動lh， 將埃博霉素溶液下來，然后離心分離1.5ml液體，將約0.8ml上清液用移液管轉(zhuǎn)移到HPLC 試管中。依據(jù)樣品的HPLC分析結(jié)果決定哪一個培養(yǎng)物中含有最高量埃博霉素C和D，在 上述相應(yīng)菌落的部分平皿上用塑料杯將lci^瓊脂區(qū)域的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml G52培養(yǎng)基(馬 鈴薯淀粉8g/L，葡萄糖2g/L，脫脂大豆粉2g/L，酵母浸膏2g/L， Na-FeIII-EDTA 8mg/L， CaCl2'2H20 lg/L， MgS04'7H20 lg/L， HEPES 11.5g/L，用KOH調(diào)節(jié)pH 7.4)中，在3(TC， 180轉(zhuǎn)/分條件下培養(yǎng)7d。將培養(yǎng)物5ml轉(zhuǎn)移到250ml錐型燒瓶中的50ml G52培養(yǎng)基中， 在30'C， 180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3d。第一次基因突變獲得了缺失epoK基因的突變菌株，該菌株只 產(chǎn)生埃博霉素C和D。進(jìn)一步的篩選和UV誘變，即獲得埃博霉素D突變高產(chǎn)菌株。埃博霉素D突變高產(chǎn)菌株的UV誘變上述獲得的缺失印oK基因的突變菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將孢子用生理鹽水洗下， 加入到富培養(yǎng)基(馬鈴薯淀粉20g/L，無水葡萄糖15g/L,黃豆粉10g/L，酵母提取物4g/L， 金屬離子等)中，培養(yǎng)5h后，使孢子萌發(fā)，離心，并洗滌孢子。轉(zhuǎn)移至帶玻璃珠的三角 燒瓶中，劇烈震蕩15min后，以玻璃棉過濾獲得單孢子懸液。調(diào)整孢子濃度至106個/1111。 取10ml液體于帶磁棒的培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行紫外誘變，使用15W紫外燈管，提前預(yù)熱20min 后，距離培養(yǎng)皿約20cm進(jìn)行照射(250~300nm)，分別照射時間為1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15min。不同時間照射完成后，從培養(yǎng)皿中取出lml培養(yǎng)液，放入含有VII號 培養(yǎng)基(馬鈴薯淀粉13g/L，無水葡萄糖4g/L，黃豆粉4g/L，酵母提取物2g/L，金屬離 子等)的試管中，用黑布包嚴(yán)，避光搖床培養(yǎng)10h， 32°C， 150轉(zhuǎn)/分。10h后取出試管， 每管取20W菌液用無菌水稀釋至2m1,取20nl稀釋后菌液涂布平板。固體培養(yǎng)基成分為 Vll號培養(yǎng)基中加入m瓊脂。培養(yǎng)3d后，挑單菌落，轉(zhuǎn)入VII號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d， 收獲。使用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，少量甲醇溶解后，經(jīng)HPLC分析產(chǎn)物。結(jié)果表明，該高產(chǎn)菌株只產(chǎn)生埃博霉素D，產(chǎn)率8~llmg/L，而埃博霉素C、 A和B僅為痕跡量。實(shí)施例2突變高產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素D連續(xù)種子培養(yǎng):從液氮中取出的lml冷凍突變高產(chǎn)菌種接種到10ml的G52培養(yǎng)基中， 并在3(TC， 180轉(zhuǎn)/分，25mm位移條件下培養(yǎng)3d。將5ml種子培養(yǎng)物加入到45ml的G52 培養(yǎng)基中生長3d。然后將此50ml的培養(yǎng)物加入到450ml的G52中生長3d。以后每34d ， 以10%接種量將50ml種子培養(yǎng)物接種到450ml的G52培養(yǎng)基中，以進(jìn)行連續(xù)的種子培養(yǎng)。20 L中間種子培養(yǎng):在30L發(fā)酵罐中裝18L G52培養(yǎng)基，接種前種子培養(yǎng)液2L， 30°C， 250轉(zhuǎn)/分，0.5L空氣/L/min,過壓為0.5bars條件下培養(yǎng)3d培養(yǎng)34d，加入10ml硅樹脂 消泡劑，防止泡沫形成。250L發(fā)酵培養(yǎng)1B12培養(yǎng)基(馬鈴薯淀粉NoreduxA-150(Blattmann，Waedenswil，Swizerland)2%,脫 脂大豆粉Soy咖ine 50T(Lucas Meyer, Hamburg, Germany) 1.1%, EDTAiFe(III)-Na鹽(8g/L) lml，用KOH調(diào)節(jié)pH為7.8.) 150L裝入250L發(fā)酵罐，加入2%XAD-16后進(jìn)行滅菌，接 種15L中間種子培養(yǎng)物。在30°C、 200轉(zhuǎn)/min、 0.5L空氣/L/min,過壓為0.5bars用硫酸控 制pH值7.6±0.5條件下發(fā)酵培養(yǎng)6~7d。產(chǎn)品分析取樣50ml，用150um孔徑的尼龍篩濾得樹脂，棄濾液。用去離子水洗滌 樹脂2 3次。加入10ml甲醇搖動30min，取2ml離心后的上清液用于HPLC分析。樣品 注射通過4.6X10mm的保護(hù)柱中，然后以從35%到100%乙腈的梯度，以lml/min的流速， 在UV250nm下10min內(nèi)通過一個長分離柱(4.6X150咖，Inertsil, 0DS-3， 5um)。埃博 霉素D (峰面積最大)在9.9min時洗脫出來，埃博霉素C在9.1min洗脫出來，而埃博霉 素A和B分別在6.5min和7.3min洗脫出來，峰面積很小。從250L發(fā)酵培養(yǎng)物中分離代謝產(chǎn)物過濾收集XAD-16,水洗滌后，用甲醇洗脫， 減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯抽提余下的水相，減壓蒸干，然后均溶于甲醇中，濾除不溶物， 將溶液上SephdexLH20柱，甲醇洗脫，將含目的物的餾份濃縮至干并再次溶于甲醇中， 上動態(tài)軸向壓縮色譜(C18反相硅膠，10~20um)，柱床預(yù)先用3體積50%甲醇平衡，上 樣后依次用50%、 55%、 60%、 65%甲醇洗脫。餾份用UV檢測儀250nm檢測。目的餾份 減壓至干，在丙酮中重懸浮固體，濾去不溶物，丙酮濾液中加入活性炭攪拌脫色l~2h， 過濾，濾液減壓至干。然后，在攪拌下用甲醇重懸浮干燥物，并緩慢加入水于66%時達(dá)到 飽和)。必要時加入少量晶種促進(jìn)結(jié)晶形成。實(shí)施例3以埃博霉素D為起始材料合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物埃博霉素D 129g(262.2mmol)溶于無水氯仿10.5L，在-18。C下加入m-CPBA97.5g (390mmo1)，反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌5h，然后用二氯甲烷42L稀釋，加入飽和碳酸氫 鈉45L終止反應(yīng)。分層，水層用二氯甲烷萃取3次，合并的有機(jī)相通過硫酸鎂干燥，過濾 后減壓濃縮，殘留物上動態(tài)軸向壓縮色譜(硅膠，用正己烷-乙酸乙酯，1:1洗脫)，得到 埃博霉素B 108g (81%)。埃博霉素B 101.2g(199.4mmol)和疊氮鈉15.54g(240mmol)懸浮于THF-H20(5:1)混合 液1.92L中，用氮脫氣20min，然后用催化量三苯基膦鈀24g(19.94mmol)在氬氣下處理， 反應(yīng)混合物升溫至45'C， 20min，再冷至25'C。反應(yīng)混合物呈嫩黃色均相溶液，該溶液用 l.OM三甲基膦-THF溶液(THF498ml，498mmo1)在25'C下處理，在室溫下攪拌2h。得到 一種氨基酸。上述氨基酸混合物用MeCN-DMF (20:1) 9.0L稀釋，冷卻至0°C ，先用1-羥基苯并三 氮唑(HOBt) 27g(199.4ramol)后用EDCI 95.6g(498鵬o1)處理，反應(yīng)混合物升溫25。C， 攪拌12h。用乙酸乙酯萃取(4LX4)，有機(jī)層依次用水8L、飽和鹽水8L洗滌，無水硫酸 鈉干燥，減壓濃縮，殘留物上動態(tài)軸向壓縮色譜(硅膠，2%甲醇-氯仿洗脫)，得到埃博霉 素B內(nèi)酰胺衍生物24g(23%)，純度》98%。
權(quán)利要求
1、一種制備埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的方法，其特征在于首先采用粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)生物合成埃博霉素C和D，然后以埃博霉素D為原料合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的方法，其特征在于，所述的 粘細(xì)菌纖維堆囊菌(5^朋^騰"http:// //0 /附)為ATCC15384，該菌種首先經(jīng)基因突變，使 epoK基因失活，致使在生物合成過程中阻止埃博霉素C和D的環(huán)氧化，即不再進(jìn)一步 產(chǎn)生埃博霉素A和B。產(chǎn)物只有埃博霉素C和D。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2，其特征在于突變菌株再經(jīng)UV誘變育種，得到埃博霉素D的高產(chǎn)菌株， 用以發(fā)酵產(chǎn)生單一的埃博霉素D。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l,其特征在于合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的起始材料為埃博霉素D。 埃博霉素D經(jīng)環(huán)氧化、開環(huán)、氮化反應(yīng)，得到埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。
全文摘要
一種制備抗癌藥物埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的方法，該方法采用基因突變方法，使用eopK抑制劑，促使epoK基因產(chǎn)物——細(xì)胞色素P450氧化酶失活，定向獲得埃博霉素C和D而不產(chǎn)生埃博霉素A和B。上述突變菌株進(jìn)一步進(jìn)行UV誘變育種，得到埃博霉素D的高產(chǎn)菌株，使用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素D，再以埃博霉素D為起始材料經(jīng)過兩步反應(yīng)合成埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物。
文檔編號C12N1/20GK101323869SQ20081013292
公開日2008年12月17日 申請日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者閻家麒 申請人:湖北荊工藥業(yè)有限公司;閻家麒