專利名稱：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備和儲存應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及燒傷藥物，尤其是涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的 制備和儲存應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
皮膚創(chuàng)傷、燒傷等皮膚損傷用傳統(tǒng)的方法治療還不是很理想。雖然近年來 人工復(fù)合皮膚已被用來治療皮膚損傷，但薄層全厚移植物是一種不完美的全厚
皮膚替代物，存在下列問題1.人工復(fù)合皮較厚，柔軟性較差，不能完全貼 緊皮膚凹凸不平的創(chuàng)面。在用其覆蓋創(chuàng)面后，創(chuàng)面的分泌物可使復(fù)合皮隆起； 2.目前使用的人工復(fù)合皮種子細(xì)胞一般是用自體或異體的表皮細(xì)胞，自體表 皮細(xì)胞有時來源不足；而異體表皮細(xì)胞則涉及排異問題；3.由于人工復(fù)合皮 含有活細(xì)胞，而活細(xì)胞在皮膚支架中又不易接觸細(xì)胞凍存液，因而活細(xì)胞的凍 存復(fù)蘇有一定困難。如果臨時制備則需要幾周的時間，而皮膚損傷，必須在盡 快的時間內(nèi)使用復(fù)合皮；4.目前使用的復(fù)合皮不具有使創(chuàng)面新生皮形成血管 的能力，因而復(fù)合皮易于壞死。因此，需要尋找治療皮膚損傷所需的新種子細(xì) 胞來源和新制備方法。
間充質(zhì)干細(xì)胞已被證明是細(xì)胞治療的有效種子細(xì)胞。首先報道的是來自骨 髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，但是，作為臨床應(yīng)用，采集骨髓時手續(xù)較復(fù)雜，提供者較 痛苦。此外，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是隨提供者年齡的增加，其數(shù)量會減少， 分化能力也會降低。近年來，發(fā)現(xiàn)臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓來源的間 充質(zhì)干細(xì)胞的4艮好替代物，它不僅幼稚、生長能力強(qiáng)，而且由于胎兒的免疫功 能發(fā)育不完全，臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫源性較低，異體排斥反應(yīng)也較 小。臍帶血本是廢棄物，其來源較多而且易得。臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可 培員長時間，可以分化為所有三個胚原基。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，除可分化 為骨、軟骨和脂肪外，還可分化為神經(jīng)膠質(zhì)和肝細(xì)胞樣細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和多 極神經(jīng)元等各種細(xì)胞類型。文獻(xiàn)報iiA臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外條件下可分 化為上皮細(xì)胞，形成3-4層上皮。申請人的實驗也證明，該類細(xì)胞具有向皮膚 表皮和真皮分化的能力，并可形成孩bk管。但;U濟(jì)帶血在應(yīng)用上的最大問題是 有許多臍帶血標(biāo)本其單個核細(xì)胞不能形成間充質(zhì)干細(xì)胞，因而其推廣應(yīng)用受到 很大的限制。近年來發(fā)現(xiàn)大多數(shù)臍帶的華頓氏膠能形成間充質(zhì)干細(xì)胞，但目前 所報道的分離純化方法或分離步驟多而費(fèi)時，或間充質(zhì)干細(xì)胞純化程度不高

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種新的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法，該方法的特點是先用膠原酶和胰蛋白酶兩種酶混合同時消化，并
用搖床振蕩，使消化時間大大縮短，獲取細(xì)胞數(shù)量也較多；然后用網(wǎng)篩研磨臍 帶華頓氏膠組織小片，可加快并促進(jìn)細(xì)胞分離。處理臍帶時，去除臍帶表面的 羊膜上皮層，并抽去血管，避免了上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁其它組織 細(xì)月包混入。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制 備方法，該方法的特點是將甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞混合 制備成一種創(chuàng)面涂抹劑。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的儲 存方法，它是將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基分別儲存，人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用液氮凍存，曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基4°C保存，應(yīng)用時混合 配制，解決了含細(xì)胞的創(chuàng)面涂抹劑凍存復(fù)蘇的困難，方法簡便。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的快 速配制應(yīng)用方法，它解決了快速提供創(chuàng)面涂抹劑的問題。
本發(fā)明的第一個目的是這樣實現(xiàn)的
一種人臍帶間充質(zhì)千細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法
a、 經(jīng)過家屬同意，將正常足月分娩胎兒的臍帶在5%洗必泰中浸泡IO分鐘， 同時用洗必泰沖洗臍帶中的血管，除去血管中的血液，用手術(shù)剪將臍帶剪成3-4 厘米長的小段，置于含5。/。洗必泰50ml離心管中浸泡5分鐘，再用生理鹽水浸 泡漂洗3次，每次3分鐘；
b、 將每段臍帶沿縱軸切開，剝?nèi)ケ砻嫜蚰ど掀?，暴露臍動脈和臍靜脈， 剝離并抽去臍動脈和臍靜脈，留下的華頓氏膠(wharton， s jelly)組織再進(jìn)行 清洗;
c、 將華頓氏膠組織切成小片，每兩小段臍帶的華頓氏膠組織片置入濃度 為lmg/ml的膠原酶溶液和含月夷蛋白酶2. 5mg/ml—乙二胺四乙酸(EDTA ) 0.2 mg/ml生理鹽水的聯(lián)合消化液15 ml中，在37°C、轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分鐘的搖床 中振蕩消化2小時；
d、 取出振蕩消化后的華頓氏膠組織片，置于下面連接有不銹鋼杯的100 目不銹鋼網(wǎng)篩上研磨組織塊并用生理鹽水沖網(wǎng)篩；
e、 收集不銹鋼杯中的過濾細(xì)胞，用生理鹽水稀釋過濾細(xì)胞，然后再1500 轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸去上清，在50ml離心管中加入伊斯科夫改良刀比科 氏培養(yǎng)基(Iscove' s modified Dulbecco' s medium ; IMDM)， 混勻過濾細(xì)胞， 再1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，并重復(fù)洗滌過濾細(xì)胞3次，得到單個M的過濾 細(xì)胞；
f 、將濃度為lxlOVml的過濾細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和10—6 M氫化可 的松的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，置入172ci^的培養(yǎng)瓶中，在37°C、 5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7日后換液，以后每4日換液-次，得到原代的人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)月包；間充質(zhì)干細(xì)月包；
g、當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)80。/。融合時，用2. 5mg/ml胰蛋白酶-0. 2 mg/ml乙二胺四 乙酸(EDTA)進(jìn)行消化，然后將l x l(T培養(yǎng)細(xì)胞置于預(yù)先在瓶底鋪有L-多聚賴 氨酸的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到傳代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個目的是這樣實現(xiàn)的
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備方法， a、曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的制備稱取4000厘泊的曱基纖維素llg，將 llg曱基纖維素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸餾水250ml，煮沸溶解，每5 分鐘振蕩一次，待三蒸餾水冷卻至37°C時，加兩倍強(qiáng)度(2x)的伊斯科夫改良刀 比科氏培養(yǎng)基250ml,置于4t水箱中，每5分鐘取出振蕩一次，共5次；再 在玻璃瓶中加入表皮生長因子10ng/ml、血管生長因子20ng/ml和慶大霉素50 Hg/ml，得到甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基，置4°C水箱12-18小時后，分裝于100毫 升的滅菌瓶中，4T保存；需大規(guī)模配制時，則用大容器制備；
b、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備在每毫升曱基纖維素復(fù)合培 養(yǎng)基中加入l x 1(T細(xì)胞/ml人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng) 面涂4末劑。
本發(fā)明的第三個目的是這樣實現(xiàn)的
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的儲存方法為
a、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的儲存取10%二曱基亞砜和90%胎牛血清，將10% 二甲基亞砜和90%胎牛血清混合在一起后得到凍存液，再將1 xl07ml人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞加入到lml凍存液中，放入凍存管，先置4。C冰箱4小時，再放 入-80。C超低溫水箱12-18小時后，放入配有液氮罐的已建立的人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞庫中；在大規(guī)模儲存時，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置入冷凍袋，放進(jìn)儲存 盒液氮保存；在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫中配有優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)(good manufacturingpractice;GMP)的細(xì)胞培養(yǎng)室、大型液氮凍存裝置、微生物檢 測設(shè)備和間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性檢測設(shè)備。
b、 曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的儲存將分裝于100毫升滅菌瓶中的曱基纖 維素復(fù)合培養(yǎng)基置于4°C保存。
本發(fā)明的第四個目的是這樣實現(xiàn)的 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的快速配制應(yīng)用方法為 在用戶需求時，在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫中凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 采用快速復(fù)蘇方法取出凍存管或冷凍袋后立即浸入40°C水浴箱振蕩，當(dāng)冰塊 溶解后，立即加入含2%胎牛血清的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基的離心管， 1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，反復(fù)3-4次，計數(shù)細(xì)胞，經(jīng)微生物檢測和細(xì)胞存活 率檢測合格后，立即與甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基混合，灌裝無菌塑料瓶，用冷凍 保藏箱快遞給用戶。
1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的檢測方法a、 流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型檢測傳代2次的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用異疏氰 熒光素標(biāo)記的CD105， CD54, CD29, CK10以及熒光藻紅素標(biāo)記的CD45, CD166, CD34和CD13單克隆抗體用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型；
b、 體外多向分化實驗用2. 0 x l(TM抗壞血酸、lng/ml人重組轉(zhuǎn)化生 長因子-pi誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，免疫組化檢測II型膠 原；用2. 0 x 10—4M抗壞血酸、7xl(TM 磷酸甘油、1. 0xl(T6 M地塞米松誘 導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，用堿性磷酸酶和馮庫薩(von Kossa) 染色鑒定；
c、 體內(nèi)移植實驗在30只棵鼠背部手術(shù)切除1. 5cm xl. 5cm全層皮膚創(chuàng) 面，隨機(jī)分為3組，每組6只 一組涂抹人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑；一 組僅用甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基； 一組僅用生理鹽水；
2、創(chuàng)面涂抹劑應(yīng)用效果的檢測方法在0， 7， 14， 21, 28天，每組分別 處死l只，取創(chuàng)口組織，福爾馬林固定，石臘包埋切片進(jìn)行蘇木素伊紅染色、 免疫組化和免疫熒光測定，進(jìn)行創(chuàng)口組織組織學(xué)檢查
a、創(chuàng)口愈合時間、瘢痕形成和皮膚柔韌度；
b 、受體創(chuàng)口組織中供者細(xì)胞的檢測
① 綠色熒光蛋白的測定為了研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否參與創(chuàng)面修 復(fù)，用增強(qiáng)型綠色焚光蛋白-N2(pEGFP-N2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，2 周后受者小鼠創(chuàng)口新生組織用4%多聚曱醛固定30分鐘，用水凍切片包埋劑包 埋，-2(TC恒冷箱切片機(jī)切片，用熒光顯微鏡檢查人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中綠色 熒光蛋白的表達(dá)；
② 細(xì)胞角蛋白、第VIII因子和膠原蛋白表達(dá)的檢測為了研究人臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞是否在受者體內(nèi)分化為上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞并形成膠原，受體 小鼠新生皮切片分別與兔抗人細(xì)胞角蛋白(pan-CK)、第VIII因子(vWF )和兔 抗人I型膠原多克隆抗體共同孵育，而后用熒光藻紅素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋 白G(IgG)孵育，在0, 7， 14， 21， 28天用熒光倒置顯微鏡檢查;
結(jié)果發(fā)現(xiàn)
1、 傳代2次的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD166， CD54， CD105 CD29, CD13， CK10表達(dá)均為陽性；而CD45和CD34則為陰性；
2、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；
3、 曱基纖維素可4艮好地貼附于創(chuàng)面組織，并參與皮膚表皮和真皮的^^復(fù)
(1) 、在使用含人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑后14天，創(chuàng)口愈合，柔韌 性較好；而對照組的創(chuàng)口則要21天才能愈合，且有較廣泛的瘢痕收縮；
(2) 、在使用含人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑后7天，創(chuàng)口組織蘇木素 伊紅染色可見4-6層新生表皮，21天后達(dá)8-IO層；真皮中膠原排列規(guī)則；而 對照組創(chuàng)口要21天才再上皮化；
(3) 、在使用含人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑后14天，發(fā)現(xiàn)在受者創(chuàng)口 組織中有增強(qiáng)型綠色焚光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的供者細(xì)胞存在，而對照組則為陰性；證明供者細(xì)胞已生長在受者創(chuàng)口組織中；
(4)、在使用含人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑后14天，發(fā)現(xiàn)在受者創(chuàng)口 組織中有第VIII因子表達(dá)細(xì)胞；同時，I型膠原蛋白表達(dá)在真皮中明顯增高， 而細(xì)胞角蛋白表達(dá)在表皮中增高，證明供者細(xì)胞可分化為皮膚上皮并分泌膠原 蛋白并參與血管形成。
本發(fā)明的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑相關(guān)臨床前研究如下
1. 急性毒性試驗實驗組用10只Balb/C小鼠，在每只小鼠的尾靜脈注 射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞l x 10'細(xì)胞/kg體重，觀察3天，無一例死亡或出現(xiàn) 中毒表現(xiàn)；
2. 過敏試驗18-22g雌小白鼠6只，分成兩組皮下注射人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞，濃度為1 x 107ml，注射0. 1-0. 25ml; 2周后從尾靜脈注射同樣劑 量，30分鐘內(nèi)觀察小白鼠的反應(yīng)。結(jié)果未見異常反應(yīng)。
3. 熱原;險查新西蘭大白兔3只，測定正常體溫后，在15分鐘內(nèi)由耳靜 脈注入濃度為1 x 107ml的從培養(yǎng)箱剛?cè)〕龅娜四殠чg充質(zhì)干細(xì)胞，每隔1 小時測體溫1次，共測3次。結(jié)果符合熱原檢查的規(guī)定。
本發(fā)明的基本特點是1.用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。2.由于間充質(zhì)干細(xì)胞 本身抗原性較弱并有免疫抑制作用，在組織和器官移植時可抑制移植物抗宿主 病(graft versus host disease; GVHD)，并可用來預(yù)防GVHD，因此植入組織 中被排斥的機(jī)會較小。3.用一種曱基纖維素作為基質(zhì)，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞混入其中，產(chǎn)生含間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、表皮生長因子、血管生長因 子和慶大霉素的膏狀物，可均勻涂布于皮膚創(chuàng)面而形成一種覆蓋物。間充質(zhì)干 細(xì)胞具有向損傷組織遷移和聚集的特性，其中的間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面組織中受 到局部環(huán)境中多種因素的刺激，可誘導(dǎo)形成新生的表皮和真皮，并促進(jìn)創(chuàng)面邊 緣的自身皮向創(chuàng)面內(nèi)生長。因此，本發(fā)明解決了人工復(fù)合皮凍存復(fù)蘇和種子細(xì) 胞來源困難的問題，動物實驗對皮膚損傷創(chuàng)面有明顯促進(jìn)愈合的作用，并具有 方法簡便易行和效果顯著的優(yōu)點。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一、 一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法
a、 經(jīng)過家屬同意，將正常足月分娩胎兒的臍帶在51洗必泰中浸泡IO分鐘， 同時用洗必泰沖洗臍帶中的血管，除去血管中的血液，用手術(shù)剪將臍帶剪成3-4 厘米長的小段，置于含5。/。洗必泰50ml離心管中浸泡5分鐘，再用生理鹽水浸 泡漂洗3次，每次3分鐘；
b、 將每段臍帶沿縱軸切開，剝?nèi)ケ砻嫜蚰ど掀樱┞赌殑用}和臍靜脈， 剝離并抽去臍動脈和臍靜脈，留下的華頓氏膠(wharton， sjelly)組織再進(jìn)行 清洗；
c、 將華頓氏膠組織切成小片，每兩小段臍帶的華頓氏膠組織片置入濃度 為lmg/ml的膠原酶溶液和含胰蛋白酶2. 5mg/ml—乙二胺四乙酸(EDTA ) 0.2mg/ml生理鹽水的聯(lián)合消化液15 ml中，在37°C、轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分鐘的搖床 中振蕩消化2小時；
d、 取出振蕩消化后的華頓氏膠組織片，置于下面連接有不銹鋼杯的100 目不銹鋼網(wǎng)篩上研磨組織塊并用生理鹽水沖網(wǎng)篩；
e、 收集不銹鋼杯中的過濾細(xì)胞，用生理鹽水稀釋過濾細(xì)胞，然后再1500 轉(zhuǎn)/分鐘離心IO分鐘，吸去上清，在50ml離心管中加入伊斯科夫改良刀比科 氏培養(yǎng)基(Iscove， s modified Dulbecco， s medium ;扁M), 混勻過濾細(xì)胞， 再1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，并重復(fù)洗滌過濾細(xì)胞3次，得到單個*的過濾 細(xì)胞；
f 、將濃度為lxlOVml的過濾細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和10—6 M氫化可 的松的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，置入172ci^的培養(yǎng)瓶中，在37°C、 5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7日后換液，以后每4日換液-次，得到原代的人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞；
g、當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)80%融合時，用2. 5mg/ml胰蛋白酶-O. 2 mg/ml乙二胺四 乙酸(EDTA)進(jìn)行消化，然后將l x 1(r培養(yǎng)細(xì)胞置于預(yù)先在瓶底鋪有L-多聚賴 氨酸的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到傳代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
二、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備方法，
a、 曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的制備稱取4000厘泊的曱基纖維素llg，將 llg曱基纖維素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸餾水250ml，煮沸溶解，每5 分鐘振蕩一次，待三蒸餾水冷卻至37°C時，加兩倍強(qiáng)度(2x)的伊斯科夫改良刀 比科氏培養(yǎng)基250ml,置于4。C水箱中，每5分鐘取出振蕩一次，共5次；再 在玻璃瓶中加入表皮生長因子10ng/ml、血管生長因子20ng/ml和慶大霉素50 li g/ml，得到曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基，置4t冰箱12-18小時后分裝于100毫升 的滅菌瓶中，4。C保存；需大規(guī)^莫配制時，則用大容器制備；
b、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備在每毫升曱基纖維素復(fù)合培 養(yǎng)基中加入l x 106細(xì)胞/1111人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng) 面涂4未劑。
三、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂^l未劑的儲存方法為
a、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的儲存取10%二曱基亞砜和90°/。胎牛血清，將10% 二曱基亞砜和90%胎牛血清混合在一起后得到凍存液，再將1 xl07ml人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞加入到lml凍存液中，放入凍存管，先置4。C冰箱4小時，再放 入-80。C超低溫水箱，12-18小時后》tX配有液氮罐的已建立的人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞庫中；在大規(guī)模儲存時，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置入冷凍袋，放進(jìn)儲存 盒液氮保存；在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫中配有優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)(good manufacturing practice; GMP)的細(xì)月包培養(yǎng)室、大型液氮凍存裝置、二微生物檢 測設(shè)備和間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性檢測設(shè)備。
b、 甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的儲存將分裝于100毫升滅菌瓶中的曱基纖 維素復(fù)合培養(yǎng)基置于4。C保存。四、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的快速配制應(yīng)用方法為
在用戶需求時，在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫中凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 采用快速復(fù)蘇方法取出凍存管或冷凍袋后立即浸入40°C水浴箱振蕩，當(dāng)冰塊 溶解后，立即加入含2%胎牛血清的^尹斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基的離心管， 1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，反復(fù)3-4次，計數(shù)細(xì)胞，經(jīng)微生物檢測和細(xì)胞存活 率檢測合格后，立即與曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基混合，灌裝無菌塑料瓶，用冷凍 保藏箱快遞給用戶。
權(quán)利要求
1、一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法，其特征在于a、經(jīng)過家屬同意，將正常足月分娩胎兒的臍帶在5％洗必泰中浸泡10分鐘，同時用洗必泰沖洗臍帶中的血管，除去血管中的血液，用手術(shù)剪將臍帶剪成3-4厘米長的小段，置于含5％洗必泰50ml離心管中浸泡5分鐘，再用生理鹽水浸泡漂洗3次，每次3分鐘；b、將每段臍帶沿縱軸切開，剝?nèi)ケ砻嫜蚰ど掀?，暴露臍動脈和臍靜脈，剝離并抽去臍動脈和臍靜脈，留下的華頓氏膠組織再進(jìn)行清洗；c、將華頓氏膠組織切成小片，每兩小段臍帶的華頓氏膠組織片置入濃度為1mg/ml的膠原酶溶液和含胰蛋白酶2.5mg/ml—乙二胺四乙酸0.2mg/ml生理鹽水的聯(lián)合消化液15ml中，在370C、轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中振蕩消化2小時；d、取出振蕩消化后的華頓氏膠組織片，置于下面連接有不銹鋼杯的100目不銹鋼網(wǎng)篩上研磨組織塊并用生理鹽水沖網(wǎng)篩；e、收集不銹鋼杯中的過濾細(xì)胞，用生理鹽水稀釋過濾細(xì)胞，然后再1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸去上清，在50ml離心管中加入伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基，混勻過濾細(xì)胞，再1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，并重復(fù)洗滌過濾細(xì)胞3次，得到單個分散的過濾細(xì)胞；f、將濃度為1 x 104/ml的過濾細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清和10-6M氫化可的松的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基中，置入172cm2的培養(yǎng)瓶中，在370C、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7日后換液，以后每4日換液-次，得到原代間充質(zhì)干細(xì)胞；g、當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)80％融合時，用2.5mg/ml胰蛋白酶-0.2mg/ml乙二胺四乙酸進(jìn)行消化，然后將1 x 104培養(yǎng)細(xì)胞置于預(yù)先在瓶底鋪有L-多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到傳代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
2、 一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備方法，其特征在于a、 曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的制備稱取4000厘泊的甲基纖維素llg,將 llg曱基纖維素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸餾水250ml,煮沸溶解，每5 分鐘振蕩一次，待三蒸餾水冷卻至37°C時，加兩倍強(qiáng)度的伊斯科夫改良刀比科 氏培養(yǎng)基250ml，置于4。C冰箱中，每5分鐘取出振蕩一次，共5次；再在玻 璃瓶中加入表皮生長因子10ng/ml、血管生長因子20ng/ml和慶大霉素50 ju g/ml，得到曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基，置4。C冰箱12-18小時后分裝于100毫升的 滅菌瓶中，4。C保存；需大規(guī)j莫配制時，則用大容器制備；b、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備在每毫升曱基纖維素復(fù)合培 養(yǎng)基中加入l x 106細(xì)胞/1111人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng) 面涂抹劑。
3、 如權(quán)利要求2所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的儲存方法， 其特征在于a、 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的儲存取10%二曱基亞砜和90°/ 胎牛血 清，將10%二甲基亞砜和90%胎牛血清混合在一起后得到凍存液，再 將1 xl07ml人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞加入到lml凍存液中，》文入凍存管， 先置4°C水箱4小時，再》tX - 80°C超^f氐溫水箱，12-18小時后放入 配有液氮罐的已建立的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫中；在大規(guī)模4諸存時， 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置入冷凍袋，放進(jìn)儲存盒液氮保存；在人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞庫中配有優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)室、大型液氮凍存 裝置、微生物檢測設(shè)備和間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性檢測設(shè)備；b、 曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的儲存將分裝于100毫升滅菌瓶中 的曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基置于4°C保存。
4、 如權(quán)利要求2所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂^^未劑的快速配制 應(yīng)用方法，其特征在于在用戶需求時，在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)^^庫中 凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用快速復(fù)蘇方法取出凍存管或冷凍 袋后立即浸入40。C水浴箱振蕩，當(dāng)水塊溶解后，立即加入含2%胎牛 血清的伊斯科夫改良刀比科氏培養(yǎng)基的離心管，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘，反復(fù)3-4次，計數(shù)細(xì)胞，經(jīng)微生物檢測和細(xì)胞存活率檢測合 格后，立即與曱基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基混合，灌裝無菌塑料瓶，用冷凍 保藏箱快遞給用戶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法及其創(chuàng)面涂抹劑的制備、儲存、快速配制應(yīng)用方法(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)；(2)甲基纖維素復(fù)合培養(yǎng)基的制備；(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑的制備。(4)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的檢測。本發(fā)明用甲基纖維素作為基質(zhì)，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞混入其中，產(chǎn)生一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑，可均勻涂布于皮膚創(chuàng)面而形成一種覆蓋物。本發(fā)明進(jìn)行了動物毒性試驗、熱原試驗、過敏試驗等臨床前研究，建立了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存復(fù)蘇方法和干細(xì)胞庫，為較大規(guī)模生產(chǎn)制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)面涂抹劑及其應(yīng)用做好了準(zhǔn)備。
文檔編號C12N5/08GK101451124SQ20081013641
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者戴育成, 胡葵葵, 董鳳平 申請人:戴育成