專利名稱：：一種產(chǎn)果膠酶的工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酶工程菌株。
背景技術(shù)：
：果膠酶外觀呈淺黃色粉末狀，能降解果膠質(zhì)，可以用于果蔬汁飲料及果酒的搾汁及澄清，因此在果汁制造、果酒釀造等方面有著廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于微生物發(fā)酵的產(chǎn)果膠酶的工程菌株。產(chǎn)果膠酶的工程菌株大腸埃希氏菌HDDMG05(Esc/2en'c/^co/z'HDDMG05)屬于埃希氏菌屬(Esc/zen'c/w'a),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCCNo:M208082;大腸埃希氏菌HDDMG05為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，菌株個(gè)體呈短桿狀，長(zhǎng)為0.2~0.7pm，寬為0.2~0.5拜，常以成對(duì)或單個(gè)出現(xiàn)；大腸埃希氏菌HDDMG05菌落呈圓形，白色，隆起，邊緣呈波浪狀，表面光滑有光澤，透明，菌落挑起軟。大腸埃希氏菌HDDMG05D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為陽(yáng)性、乳糖發(fā)酵為陽(yáng)性、棉子糖發(fā)酵為陰性、海藻糖發(fā)酵為陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵為陽(yáng)性、甘露醇發(fā)酵為陽(yáng)性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽(yáng)性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性、甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)為陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性、淀粉水解試驗(yàn)為陰性、明膠液化試驗(yàn)為陰性、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)試驗(yàn)、質(zhì)量濃度2。/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度3。/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度7%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度10%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性?？刹捎肔B液體培養(yǎng)基發(fā)酵本發(fā)明大腸埃希氏菌HDDMG05，其發(fā)酵條件與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的相同；發(fā)酵液中大腸埃希氏菌HDDMG05菌數(shù)濃度為lxio7lxl08cfti/mL時(shí)發(fā)酵液中果膠酶的酶活力達(dá)8200U/mL以上。本發(fā)明產(chǎn)果膠酶的工程菌株HDDMG05(EscherichiacoliHDDMG05)為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)屬于埃希氏菌屬(Escherichia)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCCNo:M208082。圖1是具體實(shí)施方式一大腸埃希氏菌HDDMG05菌株形態(tài)圖(100倍放大圖)，圖2是具體實(shí)施方式一大腸埃希氏菌HDDMG05及其相近菌株的16SrDNA基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式產(chǎn)果膠酶的工程菌株大腸埃希氏菌HDDMG05HDDMG05)屬于埃希氏菌屬(Escherichia)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCCNo:M208082;大腸埃希氏菌HDDMG05為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，菌株個(gè)體呈短桿狀，長(zhǎng)為0.20.7%，寬為0.20.5pm，常以成對(duì)或單個(gè)出現(xiàn)；大腸埃希氏菌HDDMG05菌落呈圓形，白色，隆起，邊緣呈波浪狀，表面光滑有光澤，透明，菌落挑起軟。本實(shí)施方式大腸埃希氏菌HDDMG05菌株形態(tài)如圖1所示。大腸埃希氏菌HDDMG05D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為陽(yáng)性、乳糖發(fā)酵為陽(yáng)性、棉子糖發(fā)酵為陰性、海藻糖發(fā)酵為陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵為陽(yáng)性、甘露醇發(fā)酵為陽(yáng)性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽(yáng)性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性、甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)為陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性、淀粉水解試驗(yàn)為陰性、明膠液化試驗(yàn)為陰性、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)試驗(yàn)、質(zhì)量濃度2Q/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度3W的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度7%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度10%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性。本實(shí)施方式大腸埃希氏菌HDDMG05是采用3，5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)從大麻漚麻液中分離篩選得到的。用弓|物Al(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和A2(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)本實(shí)施方式大腸埃希氏菌HDDMG05進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下大腸埃希氏菌HDDMG05DNA模板10^iL、濃度為2.5mmol/L的堿基名稱(dNTP)4|jL、1(^緩沖液(]^82+Free)5pL、濃度為25mmol/L的MgCl24pL、濃度為10pmol/L的引物5^L、酶活為5U/pL的Taq酶(DNA聚合酶)0.2pL、并以去離子水補(bǔ)足至50pL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5min，9(C變性30s、57"C退火30s、72。C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min。本實(shí)施方式大腸埃希氏菌HDDMG05的16SrDNA序列Genbank比對(duì)結(jié)果如表1所示(表1中列舉了相似性最高的菌種)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由本實(shí)施方式大腸埃希氏菌HDDMG05及其相近菌株的16SrDNA基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。本實(shí)施方式利用BLASTN程序(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)—一對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，從數(shù)據(jù)庫(kù)中得到相關(guān)種屬16SrDNA序列信息;再通過(guò)DNAMAN(Version5.1)軟件對(duì)目的序列和Genbank中近緣菌種的序列進(jìn)行缺省參數(shù)的對(duì)位排列(alignment);然后用該軟件中的鄰位加入法(neighbor-joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以上方法都進(jìn)行了1000次的自展(bootstraping)，證實(shí)了本實(shí)施方式所建進(jìn)化樹的真實(shí)性。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式釆用LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵具體實(shí)施方式一大腸埃希氏菌HDDMG05，其發(fā)酵條件與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的相同。本實(shí)施方式發(fā)酵液中大腸埃希氏菌HDDMG05菌數(shù)濃度為lxl07~lxl08cfo/mL時(shí)經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中果膠酶的酶活力為8226U/mL。本實(shí)施方式還可以采用其它大腸桿菌的發(fā)酵方法發(fā)酵具體實(shí)施方式一大腸埃希氏菌HDDMG05。權(quán)利要求1、一種產(chǎn)果膠酶的工程菌株，其特征在于產(chǎn)果膠酶的工程菌株大腸埃希氏菌HDDMG05(EscherichiacoliHDDMG05)屬于埃希氏菌屬(Escherichia)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2008年6月2日，保藏號(hào)為CCTCCNoM208082；大腸埃希氏菌HDDMG05為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，菌株個(gè)體呈短桿狀，長(zhǎng)為0.2～0.7μm，寬為0.2～0.5μm，常以成對(duì)或單個(gè)出現(xiàn)；大腸埃希氏菌HDDMG05菌落呈圓形，白色，隆起，邊緣呈波浪狀，表面光滑有光澤，透明，菌落挑起軟。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)果膠酶的工程菌株，其特征在于大腸埃希氏菌HDDMG05D-木糖發(fā)酵為陰性、山梨醇發(fā)酵為陽(yáng)性、乳糖發(fā)酵為陽(yáng)性、棉子糖發(fā)酵為陰性、海藻糖發(fā)酵為陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵為陽(yáng)性、甘露醇發(fā)酵為陽(yáng)性、L-阿拉伯糖發(fā)酵為陽(yáng)性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性、甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)為陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性、淀粉水解試驗(yàn)為陰性、明膠液化試驗(yàn)為陰性、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)試驗(yàn)、U引哚試驗(yàn)陽(yáng)性、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)試驗(yàn)、質(zhì)量濃度2%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度3。/。的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度7%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性、質(zhì)量濃度10%的NaCl耐鹽性試驗(yàn)為陽(yáng)性。全文摘要一種產(chǎn)果膠酶的工程菌株，它涉及一種產(chǎn)酶工程菌株。本發(fā)明提供了一種用于微生物發(fā)酵的產(chǎn)果膠酶的工程菌株。產(chǎn)果膠酶的工程菌株大腸埃希氏菌HDDMG05屬于埃希氏菌屬，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM208082；大腸埃希氏菌HDDMG05為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，菌株個(gè)體呈短桿狀，長(zhǎng)為0.2～0.7μm，寬為0.2～0.5μm；大腸埃希氏菌HDDMG05菌落呈圓形，白色，隆起，邊緣呈波浪狀，表面光滑有光澤，透明，菌落挑起軟?？刹捎肔B液體培養(yǎng)基發(fā)酵本發(fā)明大腸埃希氏菌HDDMG05，其發(fā)酵條件與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的相同；發(fā)酵液中大腸埃希氏菌HDDMG05菌數(shù)濃度為1×10⁷～1×10⁸cfu/mL時(shí)發(fā)酵液中果膠酶的酶活力達(dá)8200U/mL以上。文檔編號(hào)C12N1/20GK101386825SQ20081013684公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年7月30日優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日發(fā)明者凌宏志,接偉光,江云飛,王貴賓,葛菁萍,蔡柏巖申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)