專利名稱：角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆的引物。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)也廣泛存在于水生甲殼 類動物、軟體動物和節(jié)肢動物外殼中(如蝦、螃蟹等)。幾丁質(zhì)酶是催化降解
幾丁質(zhì)的一類糖基水解酶，它可將由P-l，4-N-乙酰-D-葡聚糖(NAG)殘基組 成的幾丁質(zhì)降解為低分子量的聚NAG。幾丁質(zhì)酶的作用主要分為兩大方面 其一，幾丁質(zhì)酶能夠抑制真菌生長、防治作物病蟲害，提高植物體自身抗性等， 是研究最多的抗真菌蛋白質(zhì)；其二，幾丁質(zhì)酶是生物酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁 寡糖的重要原料，幾丁寡糖可作為植物調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)植物組織的發(fā)育，活化 植物細(xì)胞，促進(jìn)植物的快速生長，并能誘導(dǎo)植物內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性，阻礙病原 菌生長繁殖，提高植物的抗病能力；因此，幾丁質(zhì)酶被譽(yù)為制備生物農(nóng)藥的靶 標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于幾丁質(zhì)酶的功能和作用，本發(fā)明旨在增加幾丁質(zhì)酶的種類，拓寬幾丁 質(zhì)酶的獲得途徑。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因序列如SEQIDNO: l所示。本發(fā)明角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶基因全長2065bp; 91bp處有起始密碼子ATG， 1942bp處有終止密 碼子TAA，具有1602bp完整的開放讀碼框，編碼533個(gè)氨基酸。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因完整的開放讀碼框的基因序列如SEQ ID NO: 2所示。本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因完整的開放讀碼框中有兩個(gè)內(nèi)含 子，大小分別為52bp和201bp。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示。 本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列的分子量為58kD，等電點(diǎn)pl 為4.47，結(jié)構(gòu)分為三個(gè)區(qū)域，第一個(gè)區(qū)域N-端具有由20個(gè)氨基酸組成的信
號肽，第二個(gè)區(qū)域幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，第三個(gè)區(qū)域高度保守的催化區(qū)；且在幾
丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)之間存在富含脯氨酸的可變交連區(qū)。
本發(fā)明用于克隆角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的引物Pl的基因序列如SEQ ID NO: 4所示；弓I物P2的基因序列如SEQ ID NO: 5所示；弓I物P3的基因序 列如SEQ ID NO: 6所示；引物P4的基因序列如SEQIDNO: 7所示。
將本發(fā)明角毛殼菌(C72fletoAm'ww cm/ www)幾丁質(zhì)酶基因通過GenBank 基因序列進(jìn)行比對分析，本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因與己注冊的球毛殼菌 (C7w"om/"m g/o6cwww)的幾丁質(zhì)酶同源性最高為75%,證明本發(fā)明角毛殼 菌(C/2aetom/wwcw;^ww)幾丁質(zhì)酶基因SEQ ID NO: 1是一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶 基因，為酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因。
將本發(fā)明得到的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因(命名為與真核表達(dá)載體 pPIC9K連接，構(gòu)建成pPIC9K-cW5S重組表達(dá)載體，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達(dá)出幾 丁質(zhì)酶蛋白(幾丁質(zhì)酶蛋白分子量為58 kD)，說明本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因具有表達(dá)功能。本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)出的蛋白(幾丁質(zhì)酶) 具有較強(qiáng)的抗真菌病害能力，帶有角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因工程菌株的 發(fā)酵液對楊樹葉枯病菌和稻瘟病菌有顯著的抑制效果，抑制率達(dá)48%以上，對 立枯絲核菌的抑制率為40%、對尖孢鐮刀菌的抑制率為29%、對楊樹爛皮病 菌的抑制率為17%。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因序列如SEQIDNO: l所示。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因完整的開放讀碼框的 基因序列如SEQIDNO: 2所示。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列如 SEQIDNO: 3所示。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式用于克隆角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的引物Pl 的基因序列如SEQ ID NO: 4所示；弓l物PS的基因序列如SEQIDNO: 5所 示；引物P3的基因序列如SEQIDNO: 6所示；引物P4的基因序列如SEQ IDNO: 7所示。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式表達(dá)角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因并檢測其表達(dá)產(chǎn)
物
一、 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物P1 P4;
二、 角毛殼菌基因組總DNA的提取
角毛殼菌孢子接入PD (馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中，在27'C、 220r/min的條件下培養(yǎng)48h，然后以4000r/min離心10min收集菌絲，再用液 氮速凍置于-7(TC環(huán)境中保存?zhèn)溆?，并采用改良的CTAB法提取角毛殼菌基因 組總DNA;
三、 幾丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增
分別以I 、 I 、 ///"dHI、 AawH I 、五coR I和j/ a I六種限制性內(nèi) 切酶對角毛殼菌基因組總DNA進(jìn)行酶切，再以酶切后環(huán)化的基因組為模板進(jìn) 行PCR反應(yīng)，
第一輪PCR反應(yīng)體系為50 10x聚合酶緩沖液5 ^L、濃度為10 mmol/L 的dNTP 2 pL、 2.5 fiL濃度為0.2 mmol/L引物Pl、 2.5 piL濃度為0.2 mmol/L 引物P2、濃度為5U/(iLTag酶liiL、環(huán)化DNA模板5 pL、 ddH20 32 )oL;第 一輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min， 94。C變性30s、 55。C退火30s、 72'C 延伸3 min、35個(gè)循環(huán)，72"C延伸10 min;然后從中取液1 ^iL將體積稀釋到5|iL 作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，第二輪PCR反應(yīng)體系為50 nL: 10x聚合酶緩 沖液5 ^L、濃度為10 mmol/L的dNTP 2 ^L、 2.5 joL濃度為0.2 mmol/L引物 P3、 2.5 濃度為0,2 mmol/L引物P4、濃度為5U/pLTag酶1 ^L、 DNA模板 5 mL、 ddH20 32 |iL;第二輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5 min， 94。C變性30s、 55。C退火30s、 72。C延伸3min、 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min;
四、 PCR產(chǎn)物的克隆
經(jīng)過兩輪PCR的產(chǎn)物用柱式DNA膠回收試劑盒回收，再與pMD-18T克 隆載體連接，載體連接體系pMD-18T載體50ng、PCR產(chǎn)物50 100ng、lxLigase Buffer、 T4DNA連接酶1U、加ddH20至20nL， 16。C連接過夜；然后用連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EO /!'JM109感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞接種于含有氨節(jié)青霉 素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，提取陽性白斑菌落質(zhì)粒
進(jìn)行鑒定(挑取白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反應(yīng) 條件95。C預(yù)變性10min， 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共35 個(gè)循環(huán)，72X:延伸10min，可4。C保存；再進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳)；
五、 DNA序列測定與分析
利用ABI377熒光自動序列分析儀進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果用軟件 DNAMAN進(jìn)行序列比較分析，序列的同源性比較在http:〃www.ncbi.nlm.gov 網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行；
六、 構(gòu)建角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的真核表達(dá)載體、篩選和表達(dá) 將角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因(c/2/5S)與真核表達(dá)載體pPIC9K重組構(gòu)建重組
表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-A/5S,然后采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到真核表達(dá)宿主菌畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD平板培養(yǎng)基在3(TC條件下培養(yǎng)2 3天，之 后將MD平板培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化菌落分別點(diǎn)種到MM和MD平板培養(yǎng)基的 相應(yīng)位置上在3(TC條件下培養(yǎng)2 3天，并根據(jù)菌落在MM平板上的生長情況 鑒定轉(zhuǎn)化子的表型(在MM平板培養(yǎng)基上生長正常的轉(zhuǎn)化子是Mut+型轉(zhuǎn)化子； 而在MM平板培養(yǎng)基上生長遲緩的轉(zhuǎn)化子是Muf型轉(zhuǎn)化子)；
選擇Mut+型轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)挑選Mut+型轉(zhuǎn)化子單菌落置于裝有 25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中在28 30°C 、 250~300 r/min的條件下培 養(yǎng)至OD6oo-2 6(培養(yǎng)時(shí)間為16 18h)，然后在室溫、1500~3000g的條件下離 心5min，收集菌體用BMMY重懸菌體使OD6Q() =0.9-1.1;將BMMY重懸菌 液用雙層紗布或粗棉布封口放置于28 30°C、 250 300 r/min的環(huán)境中繼續(xù)生 長，每隔24h向培養(yǎng)基中添加濃度為100%的甲醇至菌液中甲醇的終濃度為 0.5~1.0%;連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)120h后(幾丁質(zhì)酶活性最高)4°C、 8000 r/min離心 10min，得到的上清液即為角毛殼菌幾丁質(zhì)酶粗酶液。
本實(shí)施方式步驟四中陽性白斑菌落質(zhì)粒凝膠電泳的條帶與目的DNA條帶 大小相同，說明質(zhì)粒重組正確，是陽性重組子。本實(shí)施方式步驟五中DNA序 列測定結(jié)果如SEQ ID NO: 1所示。
本實(shí)施方式步驟四中采用CaCl2法制備E.②/ZJM109感受態(tài)細(xì)胞，采用熱 激法轉(zhuǎn)化E.co//JM109感受態(tài)細(xì)胞，
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購得，
若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊。
本實(shí)施方式采用改良的Schales法測定角毛殼菌幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶活性 (將OD值換算成氨基葡萄糖產(chǎn)量，以每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生lpg氨基葡 萄糖為一個(gè)酶活力單位，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=158.21X+1.5629，其中X為OD 值，Y為氨基葡萄糖量ng，直線相關(guān)系數(shù)112=0.9943)，本實(shí)施方式角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶活為39U/mL。
經(jīng)測定本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶分子量為58kD,等電點(diǎn)pl為4.47; 幾丁質(zhì)酶氨基酸結(jié)構(gòu)分為三個(gè)區(qū)域，第一個(gè)區(qū)域(第1 第20個(gè)氨基酸)N-端具有由20個(gè)氨基酸組成的信號肽，第二個(gè)區(qū)域(第105 第124個(gè)氨基酸) 幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，第三個(gè)區(qū)域(第258 第272個(gè)氨基酸)高度保守的催化區(qū)(糖 基水解酶18家族活性位點(diǎn))；且在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)之間存在富含脯氨酸 的可變交連區(qū)。本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶屬于幾丁質(zhì)酶18家族，且為酸 性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。
實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶粗酶液對楊樹葉枯病菌和稻瘟病 菌有顯著的抑制效果，抑制率達(dá)48%以上，對立枯絲核菌的抑制率為40%、 對尖孢鐮刀菌的抑制率為29%、對楊樹爛皮病菌的抑制率為17%。
實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值為5.8，最適反 應(yīng)溫度為45'C，熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為7(TC下穩(wěn)定性良好，幾丁質(zhì)酶在誘導(dǎo)表達(dá)后 的第UOh具有最高的酶活性；而且金屬Ba2+、 Mg2+、 K+和NH/ (濃度為 5mmol/L)增強(qiáng)了幾丁質(zhì)酶活性分別為171.2%、 21.2%、 24.4%和80%; Fe3+、 Cu2+、 Z 和C離子(濃度為5mmol/L)對幾丁質(zhì)酶活性具有抑制作用，幾丁 質(zhì)酶活性分別降低為51.1°/。、 52.2%、 52.8%和43.1%。
序列表
〈110〉哈爾濱工業(yè)大學(xué)
<120>角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆的引物
〈勝7
〈210> 1
〈211〉 2065
〈212〉 DNA
〈213〉毛殼菌屬(6y aeto加'"/si)
〈400〉 1
CtgttttgtgtgccaccgttctgctctctgtgccagtctccaaccggcctgtCC3tC33g60
attcgaccttggtcgttgtgactgcctatcctctgagctgcgtcttgctc120
tgggctgggctggccgtggccgcgtccagctatgagtctagtttcctcgtcc犯gcccgc180
caga gc3cg3ggcaaaagctctggacgcgagacgactcsgacccg犯gtgcaccaaggat240
attccgtgca卿tcgggtgctgtgggccattgtaggtctatcgctctcagataaacatc300
gcgcaatgctgacggccacgag3cactggtgtcggcatctgcggcttggg360
accaaccttctgcggcgacgggtgcacctcgtcgtgcgactacaagagcgagtgcgaccc420
gggctggggcatgcagtggtccaacgcatcgacgtgccccctraacgtgtgctgcagtga480
ctttggtttctgcggcacgaccgatgagttctgc卿ggc犯gg鄉(xiāng)tgtcggtcccgca540
gtgcgacccggccgccaacagctcgcacgcgcgcaccgtcggctactatg鄉(xiāng)gctggM600
ctggcagcgcccctgcggcaccatgaagccgtcgcagatcccgctcggtt660
cattttcttcgccttctcgttgctcgaccccaccaccttccggctgtcgcccatggatac720
cg卿caggtaccctgtacggtgacgtctcggctatcaagaaccgccagccgggcgtgca780
agtctggatcgccatcggcggctgggcg3tgaatgaccccggtccgactcggccgacgtt840
ttcaaacctggCC犯gg8Cgaggcggcgcsgg3Cg3gttCttcgaggccctggtcacttt900
catgstggccaacgactacg3CggtgtCg3tatcgactgggaatatcccgtcgccgacga960
t卿ggtggc，gtcg鄉(xiāng)actttgat幼ctacgtcaacctgctcaagcgcctacgcgc1020
gcgcctcaacagcatcggcgtgccgaagggcctgtctatcacgctgcccgcgtcgtactg1080
gtatctgaaagggtttg3Cattgtcaacctcgagccat3tgtggactttttc犯tgtcat1140
gacgtatgatattcgtgagtaacgttagcccatttgctgttcctcttgcttttaatccct1200
ctcactgctcatcctctccatcctttattcctttttttttttttuttttttutttttt1260
ttttgaaaagaatgtctttcctcttttcttgactttctgtttactcatctcattgttctg1320
tccttgttgagacctggactaactccgtaa
aagcctggggccctatgccc3CgCCC3C3C
gctgctttggcgc犯c犯catcaaccccga
tcgtagcttcaccatgaaagacccctcttg
cggtaacggtggC3gCtgC3cgggtacccc
aatcatcaat犯cggcgcgacggtgaiccsc
ctgggacacc犯CC3gtgggtctcatggga
ctacgccaacgagcgctgcctgggcggtgt
caccctaatcaagtcacttgccgacacggg
cccctggatgacgggttgtttcggatccgc
cgacatcgattC3gg^gC3gtt犯tgctt
ggat3ctcta<gggtgagg犯aatatgtcac
cg3t犯ttaggttgtccgtggccag 2065
saica^cggtgtctgggattcgacggtcca1380
C犯CCtC3CCgagatcgaggaggcactgaa1440
gcgcgtc犯cctgggcctgggtttctacgg1500
ca/tggccgccggctgtgagttcagctctgg1560
gggagtcctctcagcccacgagatcgtcca1620
ggacgaagtggccgccgtggagattgtcac1680
C3gCElCC犯gacgctggccatgaaggtcaa1740
catggtctgggccatcgacctcgacgacgg1800
acggcccacctacaattacttgacggacct1860
gtttgacgactggtcgagactgaatgactc1920
tagtcgtcttgtaatatgtcatattggaat1980
11taaacacatgctacccgaatattgcctg2040
〈210〉 2 <211> 1602 〈212> DNA
〈213〉毛殼菌屬(^Z aeto/w'〃;T7)
〈220>
〈221> CDS
〈222〉 (l),.. (1602)
<400〉 2 atg aag Met Lys 1
gcc gcg Als Ala
acg agg Thr Arg
aag gat Lys Asp
acg Thr
tec Ser
c肪
Gin
35
att
lie
tct Ser
age
Ser
20
犯g
Lys
ccg Pro
ctg Leu 5
tat Tyr
etc Leu
tgc Cys
3gC
Ser
gag Glu
tgg Trp
卿 Lys
tgc Cys
tct Ser
Thr
ate lie
gtc ttg Val Leu
￡tgt Ser
cga Arg 40
ggg Gly
ttc
Phe
25
gac
Asp
tgc Cys
etc tgg get ggg Leu Trp Ala Gly 10
etc gtc caa gcc Leu Val Gin Ala
gac tea gac ccg Asp Ser Asp Pro 45
tgt ggg cca tta Cys Gly Pro Leu
ctg gcc gtg 48 Leu Ala Val 15
cgc cag age 96 Arg Gin Ser 30
aag tgc acc 144 iLys Cys Thr
gac aaa gac 192 Asp Lys Asp
50 55 60
act ggt gtc ggc ate tgc ggc ttg gga cca acc ttc tgc ggc gac ggg 240 Thr Gly Val Gly lie Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly 65 70 75 80
tgc acc teg teg tgc gac tac aag age gag tgc gac ccg ggc tgg ggc 288 Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
atg cag tgg tec aac gca teg acg tgc ccc etc aac gtg tgc tgc agt 336 Met Gin Trp Ser Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
100 105 110
gac ttt ggt ttc tgc ggc acg acc gat gag ttc tgc aag ggc aag gag 384 Asp Phe Gly Phe Cys Gly Thr Thr A印Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu
115 120 125
gtg teg gtc ccg cag tgc gac ccg gcc gcc aac age teg cac gcg cgc 432 Val Ser Val Pro Gin Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg
130 135 140
acc gtc ggc tac tat gag ggc tgg aac tgg cag cgc ccc tgc ggc acc 480 Thr Val Gly Tyr Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gin Arg Pro Cys Gly Thr 145 150 155 160
atg aag ccg teg cag ate ccg etc ggt tat tac agt cac att ttc ttc 528 Met Lys Pro Ser Gin lie Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His lie Phe Phe
165 170 175
gcc ttc teg ttg etc gac ccc acc acc ttc egg ctg teg ccc atg gat 576 Ala Phe Ser Leu Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp
180 185 190
acc gag aca ggt acc ctg tac ggt gac gtc teg get ate aag aac cgc 624 Thr Glu Thr Gly Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala lie Lys Asn Arg
195 200 205
cag ccg ggc gtg caa gtc tgg ate gcc ate ggc ggc tgg gcg atg aat 672 Gin Pro Gly Val Gin Val Trp lie Ala lie Gly Gly T卬Ala Met Asn
210 215 220
gac ccc ggt ccg act egg ccg acg ttt tea aac ctg gcc犯g gac gag 720 Asp Pro Gly Pro Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Uu Ala Lys Asp Glu 225 230 235 240
gcg gcg cag gac gag ttc ttc gag gcc ctg gtc act ttc atg atg gcc 768
Ala Ala Gin Asp Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala
245 250 255
aac gac tac gac ggt gtc gat ate gac tgg geia tat ccc gtc gcc gac 816
Asn Asp Tyr Asp Gly Val Asp lie Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp
260 265 270
gat aga ggt ggc age gtc gag gac ttt gat aac tac gtc aac ctg etc 864
Asp Arg Gly Gly Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu
275 280 285
aag cgc eta cgc gcg cgc etc aac 3gc ate ggc gtg ccg犯g ggc ctg 912
Lys Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asn Ser lie Gly Val Pro Lys Gly Leu
290 295 300
tct ate acg ctg ccc gcg teg tac tgg tat ctg aaa ggg ttt gac att 960
Ser lie Thr Leu Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp lie 305310315 320
gtc aac etc gag cca tat gtg gac ttt ttc aat gtc atg acg tat gat 1008
Val Asn Leu Glu Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp
325 330 335
att cac ggt gtc tgg gat teg acg gtc caa age ctg ggg ccc tat gcc 1056
lie His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gin Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
cac gcc cac acc aac etc acc gag ate gag gag gca ctg aag ctg ctt 1104
His Ala His Thr Asn Leu Thr Glu lie Glu Glu Ala l>eu Lys Leu Leu
355 360 365
tgg cgc aac aac ate aac ccc gag cgc gtc aac ctg ggc ctg ggt ttc 1152
Trp Arg Asn Asn lie Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
tac ggt cgt age ttc acc atg aaa gac ccc tct tgc atg gcc gcc ggc 1200
Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly 385390395 400
tgt gag ttc age tct ggc ggt aac ggt ggc age tgc acg ggt acc ccg 1248
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
gga gtc etc tea gcc cac gag ate gtc caa ate ate aat aac ggc gcg 1296
Gly Val Leu Ser Ala His Glu lie Val Gin lie lie Asn Asn Gly Ala
420 425 430acg gtg acc acg gac gaa gtg gcc gcc gtg gag att gtc acc tgg gac 1344
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu lie Val Thr Trp Asp
435 440 445
acc aac cag tgg gtc tea tgg gac age acc aag acg ctg gcc atg aag 1392
Thr Asn Gin Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Uu Ala Met Lys
450 455 460
gtc aac tac gcc aac gag cgc tgc ctg ggc ggt gtc atg gtc tgg gcc 1440
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala 465 470 475 480
ate gac etc gac gac ggc acc eta ate aag tea ctt gcc gac acg gga 1488
lie Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu lie Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
egg ccc acc tac aat tac ttg acg gac etc ccc tgg atg acg ggt tgt 1536
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
ttc gga tec gcg ttt gac gac tgg teg aga ctg aat gac tec gac ate 1584
Phe Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie
515 520 525
gat tea gga age agt taa 1602 Asp Ser Gly Ser Ser
530
〈210〉 3 <211> 533 <212> PRT
<213〉毛殼菌屬(Chaetomium) <400> 3
Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val
15 10 15
Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser
20 25 30
Thr Arg Gin Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
Lys Asp lie Pro Cys Lys lie Gly Cys Cys Gly Pro Uu Asp Lys Asp 50
Gly Val Gly lie
Thr 65
Cys Thr Ser Ser
Met Gin Trp Ser 100 Phe
55
Gly Leu Gly Pro
Cys 70
Asp Tyr Lys Ser
Cys 85
Asn Ala Ser Thr
Thr 75 Cys
Glu 90
Pro Leu Asn Val
60
Phe Cys Gly Asp Asp Pro Gly
Asp Phe Gly 115
Val Pro Gin
Cys Gly Thr
Val
Ser 130
Vsl Gly Tyr Tyr
Gly Cys
Cys 105
Asp Glu Phe Cys
Trp 95 Cys
Gly
80
Gly
Ser
Thr 120
Pro Ala Ala Asn
Cys 110
Gly Lys Glu
Thr 145
Met Lys Pro Ser
Asp 135
Gly Trp Asn Trp
Lys 125
Ser His Ala Arg
Glu 150
lie Pro Leu Gly
Ser 140
Arg Pro Cys Gly
Gin 165
Leu Asp Pro Thr
Gin 155
Tyr Ser His lie
Ala Phe Ser Leu 180
Gly Thr Leu Tyr
Tyr 170
Phe Arg Leu Ser
Thr Glu Thr 195
Gly Val Gin Val
Thr 185
Asp Val Ser Ala
Gin
Pro 210
Pro Gly Pro Thr
Gly 200
lie Ala lie Gly
Pro 190 Lys
Phe 175 Met
Asn
Thr 160 Phe
Asp
Arg
Asp 225
Ala Ala Gin Asp
Trp 215
Pro Thr Phe Ser
Asn Asp Tyr Arg
Asp 260 Gly
Glu 245 Gly
Ser
Arg 230
Phe Phe Glu Ala
Gly 220 Leu
lie 205
Trp Ala Met Asn
Val Asp lie
Asp Arg Gly 275
Lys Arg Leu Arg Ala 290
lie Thr Leu Pro
Val Arg
Ser 305
Val Asn Leu Glu
Asp
Glu
Leu 295 Ser
Asp 280 Asn
Asp 265 Phe
Pro 325
Tyr Asp
Trp
Ala 310
Tyr Val Asp Phe
Leu 250 Trp
Asp
lie
Tyr
Phe 330
Asn 235
Val Thr Phe Met
Ala Lys Asp Phe
Glu Tyr Pro
Asn
Ser lie Gly
Tyr
Tyr
Val 300 Lys
Val 285 Pro
Val 270 Asn
Met 255 Ala
Leu Gly
Gly Phe Asp
Glu 240 Ala
Asp
Leu
Lys Gly Leu
Leu 315
Asn Val Met Thr
Tyr 335
lie 320 Asp
頁
lie His Gly Val Trp Asp Ser Thr Val Gin Ser Leu Gly Pro Tyr Ala
340 345 350
His Ala His Thr Asn Leu Thr Glu lie Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu
355 360 365
Trp Arg Asn Asn lie Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe
370 375 380
Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly 385 390 395 400
Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
Gly Val Leu Ser Ala His Glu lie Val Gin lie lie Asn Asn Gly Ala
420 425 430
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu lie Val Thr Trp Asp
435 440 445
Thr Asn Gin Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala 465 470 475 480
lie Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu lie Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser 530
<210> 4 <211〉 22 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉角毛殼菌(a aez^z7j'"歷c"pre"歷)幾丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增引物Pl。
〈400〉 4
gtgtctttgt ctctgtcgtg gc 22
〈210〉 5 〈211> 22 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<223〉角毛殼菌(6y aez^/w'咖cwpre"/z )幾丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增引物P2。 〈400〉 5
gacgaggaaa ctagactcat ag 22
〈210〉 6 〈211〉 20 〈212〉薩 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>角毛殼菌(C/ aeto/w'咖ci/; re鵬)幾丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增引物P3。 <400〉 6
acgtctcggc tatcaagaac 20
〈210〉 7 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213>人工序列
〈220〉
<223>角毛殼菌(C/ aeto肌'"i7 c"pre咖)幾丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增引物P4。 〈400> 7
ctggtcactt tcatgatgg 19
權(quán)利要求
1、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因序列如下所示CTGTTTTGTGTGCCACCGTTCTGCTCTCTGTGCCAGTCTCCAACCGGCCTGTCCATCAAGATTCGACCTTGGTCGTTGTGACTGCCTATCATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCGTGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCACGAGGCAAAAGCTCTGGACGCGAGACGACTCAGACCCGAAGTGCACCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTGTAGGTCTATCGCTCTCAGATAAACATCGCGCAATGCTGACGGCCACGACAGAGACAAAGACACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCACCTCGTCGTGCGACTACAAGAGCGAGTGCGACCCGGGCTGGGGCATGCAGTGGTCCAACGCATCGACGTGCCCCCTCAACGTGTGCTGCAGTGACTTTGGTTTCTGCGGCACGACCGATGAGTTCTGCAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGACTCGGCCGACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCGCCGACGATAGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGCGCCTACGCGCGCGCCTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTATCTGAAAGGGTTTGACATTGTCAACCTCGAGCCATATGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCGTGAGTAACGTTAGCCCATTTGCTGTTCCTCTTGCTTTTAATCCCTCTCACTGCTCATCCTCTCCATCCTTTATTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAAGAATGTCTTTCCTCTTTTCTTGACTTTCTGTTTACTCATCTCATTGTTCTGTCCTTGTTGAGACCTGGACTAACTCCGTAAAACAGACGGTGTCTGGGATTCGACGGTCCAAAGCCTGGGGCCCTATGCCCACGCCCACACCAACCTCACCGAGATCGAGGAGGCACTGAAGCTGCTTTGGCGCAACAACATCAACCCCGAGCGCGTCAACCTGGGCCTGGGTTTCTACGGTCGTAGCTTCACCATGAAAGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCCCCTGGATGACGGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAATGCTTTAGTCGTCTTGTAATATGTCATATTGGAATGGATACTCTAGGGTGAGGAAAATATGTCACTTTAAACACATGCTACCCGAATATTGCCTGCGATAATTAGGTTGTCCGTGGCCAG。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶基因91bp處有起始密碼子ATG， 1942bp處有終止密碼子TAA，具 有1602bp開放讀碼框，編碼533個(gè)氨基酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶基因完整的開放讀碼框的基因序列如下所示ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCG TGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCGGTCCCGCAGTGCGACCCGGCCGCCAACAGCTCGCACGCGCGCACCGTCGGCTACTATGAGGGCTGGAACTGGCAGCGCCCCTGCGGCACCATGAAGCCGTCGCAGATCCCGCTCGGTTATTACAGTCACATTTTCTTCGCCTTCTCGTTGCTCGACCCCACCACCTTCCGGCTGTCGCCCATGGATACCGAGACAGGTACCCTGTACGGTGACGTCTCGGCTATCAAGAACCGCCAGCCGGGCGTGCAAGTCTGGATCGCCATCGGCGGCTGGGCGATGAATGACCCCGGTCCGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCGCCGACGATAGAGGTGGCAGGTGGACTTTTTCAATGTCATGACGTATGATATTCACGGTGTCTGGGATTCGGACCCCTCTTGCATGGCCGCCGGCTGTGAGTTCAGCTCTGGCGGTAACGGTGGCAGCTGCACGGGTACCCCGGGAGTCCTCTCAGCCCACGAGATCGTCCAAATCATCAATAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCACCTGGGACACCAACCAGTGGGTCTCATGGGACAGCACCAAGACGCTGGCCATGAAGGTCAACTACGCCAACGAGCGCTGCCTGGGCGGTGTCATGGTCTGGGCCATCGACCTCGACGACGGCACCCTAATCAAGTCACTTGCCGACACGGGACGGCCCACCTACAATTACTTGACGGACCTCTGAATGACTCCGACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于角毛殼菌 幾丁質(zhì)酶基因開放讀碼框中有兩個(gè)內(nèi)含子，大小分別為52bp和201bp。
5、 角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列，其特征在于角毛殼菌幾丁 質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列如下所示VTFMMANDYDGVDIDWEYPVADDRGGSVEDFDNYVNLLKRLRARLNSIGYAHAHTNLTEIEEALKLLWRNN證ERVNLGLGFYGRSFTMKDPSCMAAGCVSWDSTKTLAMKVNYANERCLGGVMVWAIDLDDGTLIKSLADTGRPTYN YLTDLPWMTGCFGSAFDDWSRLNDSDIDSGSS 。
6、用于克隆角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的引物，其特征在于引物的基因序列為P1: 5 ，-GTGTCTTTGTCTCTGTCGTGGC-3 ，； P2: 5'-GACGAGGAAACTAGACTCATAG-3，； P3: 5'曙ACGTCTCGGCTATCAAGAAC國3，； P4: 5 ，國CTGGTCACTTTCATGATGG畫3'。
全文摘要
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆的引物，它涉及一種幾丁質(zhì)酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆的引物。本發(fā)明旨在增加幾丁質(zhì)酶的種類，拓寬幾丁質(zhì)酶的獲得途徑。本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因序列如SEQ ID NO1所示。角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因完整的開放讀碼框的基因序列如SEQ ID NO2所示。角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO3所示。用于克隆角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因的引物P1～P4的基因序列如SEQID NO4～7所示。本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因是一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因，為酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因。
文檔編號C12N15/11GK101348797SQ20081013711
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者謙 楊, 王艷君 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)