專利名稱：利用誘導(dǎo)子提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的方法。它屬于植物細胞 培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
沒食子酸(Gallic Acid, GA)又叫3、 4、 5—三羥基苯甲酸、五倍子。是 從茶條槭(4cer ^V777a^ Maxim)葉子中分離得到的天然產(chǎn)物，是一種可用于 醫(yī)藥、化工等生產(chǎn)的原料。在醫(yī)藥工業(yè)中，沒食子酸及其衍生物對冠心病、腦 血栓、胃潰瘍、抗菌、抗血吸蟲、抗病毒性肝炎、老年性癡呆、抗腫瘤等顯示 出多方面的功效；在化工、輕工、食品等方面，沒食子酸作為原料均有廣泛的 應(yīng)用。
目前，沒食子酸的制備主要有三種來源①化學(xué)方法通過單寧水解、酶
法轉(zhuǎn)化等手段來合成沒食子酸，但是合成的成本過高，從生產(chǎn)的角度無實際意
義，沒食子酸作為多種產(chǎn)品的原料須從天然物中取得；②茶條槭葉片目前商
業(yè)用沒食子酸由茶條槭葉片提取法生產(chǎn)，此方法缺憾是樹葉受季節(jié)限制，資源
匱乏，每生產(chǎn)lg沒食子酸，需800-1000kg葉子，按產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，原材料 嚴(yán)重匱缺，廣辟生產(chǎn)途徑，解決沒食子酸資源貧乏問題變得十分迫切；③生物 技術(shù)植物組織培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)研究、以及植物栽培的環(huán)境調(diào)控等，這 種方法制備沒食子酸具有原料生物體生長周期短，發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)模較大，提取成 本較低的優(yōu)點，是更具前景的領(lǐng)域。
發(fā)明人曾在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局于申請了 "一種高產(chǎn)沒食子酸的茶條槭 懸浮培養(yǎng)細胞"專利，2008年7月3日公開了該項專利，該發(fā)明專利為本發(fā)明 提高沒食子酸含量及后續(xù)利用提供了實驗材料。
真菌誘導(dǎo)子是來源于真菌的一種確定的化學(xué)信號，在植物與真菌的相互作 用中，能快速、高度專一和選擇性的誘導(dǎo)植物特定基因的表達，進而活化特定次 生代謝途徑，積累特定的目的次生代謝產(chǎn)物。因而被用來進一步提高植物細胞 的生產(chǎn)能力。
茉莉酸甲酯是應(yīng)用最為廣泛的誘導(dǎo)子之一，當(dāng)植物受到外界刺激時，體內(nèi) 的茉莉酸甲酯的含量會迅速的增加，從而激活植物體內(nèi)某些特殊酶的活性，并 產(chǎn)生某些具有特殊生理活性的次生物質(zhì)。根據(jù)這一原理，人們用外施茉莉酸甲 酯的方法來實現(xiàn)植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。
近年來,利用誘導(dǎo)子來促進植物組織次生代謝產(chǎn)物合成的研究愈
來愈多，也有很多成功的例子，如張長平等(2001)、李家儒等(1999) 在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導(dǎo)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫杉醇的 合成被加強,產(chǎn)量得到了顯著提高。王艷東等(2003)利用茉莉酸甲 酯誘導(dǎo)紅豆杉中紫杉垸類合成，發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯在抑制細胞初生代謝 的同時，可促進紫杉醇側(cè)鏈的生物合成。然而利用誘導(dǎo)法來提高茶條 槭沒食子酸生產(chǎn)能力的研究還未見報道。
因此，通過生物技術(shù)途徑建立茶條槭懸浮培養(yǎng)細胞誘導(dǎo)體系，進 一步提高細胞沒食子酸含量，具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的 方法。該方法可以明顯提高茶條槭細胞中沒食子酸含量，從而為沒食 子酸的工業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造條件，保護環(huán)境的同時保護樹種植物資源。
為了達到上述目的，本發(fā)明利用茶條槭細胞的懸浮培養(yǎng)，通過生 物和化學(xué)誘導(dǎo)，使誘導(dǎo)細胞中沒食子酸含量大幅度提高，建立了細胞 誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)沒食子酸的新方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括如下步驟
(1) 茶條槭細胞的培養(yǎng) 將從茶條槭組培苗的葉片和莖段外植體誘導(dǎo)愈傷組織中分離獲
得的茶條槭細胞，移入WPM液體培養(yǎng)基中，另添加 TDZO. 002-0. 010mg/L和6-BAO. 05-0. 15mg/L，蔗糖為2-3%， pH值為 5.8-6.0，接種量為20g/L (濕重)。每隔15天繼代一次，培養(yǎng)采用 旋轉(zhuǎn)式搖床，在轉(zhuǎn)速為100-200rpm和20-28。C下暗培養(yǎng)。
(2) 沒食子酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)
將步驟(1)所獲得的茶條槭濕細胞置于含有上述培養(yǎng)基的搖瓶 中，接種量為40g/L (濕重)，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)12-15天至對數(shù) 生長末期，向搖瓶中加入真菌誘導(dǎo)子，最終濃度60-100ug/mL;或 向搖瓶中加入茉莉酸甲酯，最終濃度100-200u M/L。
(3)沒食子酸的測定方法 取茶條槭干細胞，磨成粉末，用100目細胞篩過篩，稱取100mg 干細胞，加入2mLl07。濃硫酸，2mL色譜甲醇，超聲2min， 6(TC水浴 lh，過濾至樣品瓶中，用于高效液相色譜(HPLC)分析。采用Waters600 型高效液相色譜儀，檢測波長為270nm。采用Waters C18 MS柱，流 動相為甲醇水=4: 6，流速O. 5ml/min。每次進樣10uL。
本發(fā)明的效果本發(fā)明利用誘導(dǎo)子來促進細胞生產(chǎn)的能力，獲得
的沒食子酸含量大大提高。利用上述技術(shù)方案，以茶條槭為材料進行
實驗，其結(jié)果是每代培養(yǎng)后，加入真菌誘導(dǎo)子的茶條槭細胞中沒食
子酸含量是未加入真菌誘導(dǎo)子時的1. 86倍，每代產(chǎn)量為151. 20 mg/L， 是對照組的2.06倍。加入茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子的茶條槭細胞中沒食子 酸含量是未加入茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子時的2. 16倍，每代產(chǎn)量為139. 70 mg/L，是對照組的2.04倍。因此，這是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的沒 食子酸生產(chǎn)方法。
需要強調(diào)的是本發(fā)明生產(chǎn)過程完全可控，不受生長季節(jié)和自然 環(huán)境的影響，節(jié)省茶條槭原料，生產(chǎn)周期短，提取工藝簡單、成本低。 這些綜合效果算起來，用細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)生產(chǎn)沒食子酸的方法1L反應(yīng) 器年產(chǎn)量可達IO g，是茶條槭10噸葉子的提取量。與用茶條槭懸浮 細胞常規(guī)培養(yǎng)生產(chǎn)沒食子酸相比，時間縮短為原來的1/7，沒食子酸 含量平均提高2倍。
以下將通過實例對本發(fā)明的有關(guān)內(nèi)容作進一步說明。 實施例l
將從茶條槭組培苗的葉片和莖段外植體誘導(dǎo)愈傷組織中分離獲 得的茶條槭細胞，移入WPM液體培養(yǎng)基中，另添加 TDZO. 002-0. 010mg/L和6-BA0. 05-0. 15mg/L，蔗糖為2-3%， pH值為 5.8-6.0，接種量為40g/L (濕重)。每隔15天繼代一次，培養(yǎng)采用 旋轉(zhuǎn)式搖床，在轉(zhuǎn)速為100-200rpm和溫度于20-28'C下暗培養(yǎng)。 取4g濕細胞接種到含有50mL上述培養(yǎng)基的搖瓶中，在細胞對數(shù)生長 末期(細胞生長14天)加入終濃度為20、 40、 60、 80、 100"g/mL 的真菌誘導(dǎo)子，繼續(xù)培養(yǎng)5天收獲細胞，經(jīng)HPLC檢測結(jié)果顯示真菌
誘導(dǎo)子濃度在60-100" g/mL時均顯著促進沒食子酸合成，在60u g/mL時細胞 內(nèi)沒食子酸含量最高。因此選擇真菌誘導(dǎo)子濃度為60 u g/mL為真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo) 時濃度，誘導(dǎo)48小時后收集細胞，制樣檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組細胞內(nèi)沒食子酸含量 為12.00mg/gDW，是對照組的1.86倍，沒食子酸產(chǎn)量為151.20 mg/L，是對照 組的2.06倍。
^培養(yǎng)條件同實例1。在細胞對數(shù)生長末期加入茉莉酸甲酯至終濃度分別為 20、 50、 100、 150、 200uM/L，繼續(xù)培養(yǎng)至5天，收獲細胞并在60。C下干燥24h， 制樣，經(jīng)HPLC檢測結(jié)果顯示茉莉酸甲酯濃度為100 200uM/L時均顯著促進沒 食子酸合成，在100pM/L時細胞內(nèi)沒食子酸含量最高，因此選擇濃度為100p M/L為茉莉酸甲酯誘導(dǎo)時濃度，誘導(dǎo)48小時后時后收集細胞，制樣檢測，發(fā)現(xiàn) 誘導(dǎo)組細胞內(nèi)沒食子酸含量為為13.97 mg/gDW，是對照組的2. 16倍，沒食子酸 產(chǎn)量為139. 70 mg/L，是對照組的2. 04倍。
權(quán)利要求
1、一種提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的方法，其特征在于(1)將茶條槭細胞接種于WPM液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)懸浮培養(yǎng)方法進行暗培養(yǎng)；(2)將茶條槭內(nèi)生真菌擬莖點霉屬菌絲發(fā)酵培養(yǎng)7天，收集菌絲，采用酸解法制備真菌誘導(dǎo)子。(3)將所獲得的茶條槭新鮮細胞轉(zhuǎn)入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，暗培養(yǎng)，在細胞生長過程中向搖瓶內(nèi)加入真菌誘導(dǎo)子或茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子，從所獲得的培養(yǎng)細胞中提取沒食子酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于細胞生長過程包括細胞生長延 遲期、對數(shù)生長期和平穩(wěn)期，在對數(shù)生長末期加入誘導(dǎo)子。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于加入的誘導(dǎo)子為真菌誘導(dǎo)子或茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于加入的真菌誘導(dǎo)子終濃度為60-100ug/mL糖含量。加入的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子終濃度為100-200uM/L。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入誘導(dǎo)子培養(yǎng)2-7天后收 獲細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用誘導(dǎo)子提高茶條槭細胞中沒食子酸含量的方法。該方法是利用茶條槭(Acer ginnala Maxim)細胞的懸浮培養(yǎng)，通過在細胞生長適宜階段，加入誘導(dǎo)子(真菌誘導(dǎo)子或茉莉酸甲酯)，在誘導(dǎo)一定時間后收獲細胞，可顯著提高細胞中沒食子酸含量。真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)2-7天后可使細胞中沒食子酸含量最高達12.00mg/gDW，產(chǎn)量為151.20mg/L，是對照組的2.06倍；茉莉酸甲酯可使細胞中沒食子酸含量最高達13.97mg/gDW，產(chǎn)量為139.70mg/L，是對照組的2.04倍。本發(fā)明通過確定添加誘導(dǎo)子的種類、添加濃度、適宜添加誘導(dǎo)子的茶條槭懸浮細胞生長階段和誘導(dǎo)持續(xù)時間，建立誘導(dǎo)子誘導(dǎo)茶條槭細胞高效合成和積累沒食子酸技術(shù)，是一種有廣闊應(yīng)用前景的沒食子酸生產(chǎn)方法。
文檔編號C12P7/40GK101358179SQ20081013718
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者景天忠, 曾凡鎖, 由香玲, 范桂枝, 詹亞光, 齊鳳慧 申請人:東北林業(yè)大學(xué);詹亞光