專利名稱：早期光誘導(dǎo)蛋白基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)朋涉及蛋白基因及其制備方法。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為培育強(qiáng)耐鹽堿植物提供了有力的技術(shù)手 段。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了鹽分對(duì)植物的傷害、植物耐鹽的機(jī)理，克隆了一 些耐鹽相關(guān)基因，并通過(guò)對(duì)這些耐鹽基因的轉(zhuǎn)化，獲得一些耐鹽轉(zhuǎn)基因植物， 但是耐鹽能力不高，影響實(shí)際應(yīng)用，可見能否克隆出有效的耐鹽基因仍是耐鹽 基因工程育種的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有耐鹽基因轉(zhuǎn)化獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽
能力不高的問(wèn)題，而提供一種早期光誘導(dǎo)蛋白(五i:/尸)基因及其制備方法。
本發(fā)明早期光誘導(dǎo)蛋白基因的編碼區(qū)序列如SEQIDNO: 1所示。 本發(fā)明早期光誘導(dǎo)蛋白基因的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。 本發(fā)明早期光誘導(dǎo)蛋白基因按以下步驟制備
一、 CTAB法提取檉柳的總RNA;
二、 用Promega公司的mRNA分離試劑盒分離mRNA，取mRNA5ug用于構(gòu) 建檉柳cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為ZAP-cDNA Synthesis Kit和 ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning Kit,所建立的檉柳cDNA文庫(kù)滴度為 7.2xl05pfU，重組率為98%，文庫(kù)克隆插入片段長(zhǎng)度為0.9 l.lkb;
三、 對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序領(lǐng)!)序引物為T3引物，cDNA文庫(kù)克隆的測(cè)序儀 為GE公司的MegaBACETM 1000 DNA序列分析儀，通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的Blastx分 析獲得早期光誘導(dǎo)蛋白基因的5'片段，序列為
CAGAATTTTAAAATTTTCTTTTTTTATTTATCTATTTATTTCATTGCAAAATTTGCTATACAC TAGAATATTCACTAATATTGCATTGTGCACATTCAGCGTMCMATTTTGTAAATCAAAGCAMTCA AMTTACCGACGTAMCCAATGCCTTAGACAAGGGCCCCACCCTTTACATATTCAGTCMGGCCAAG GCMCAAGACCTAACATAGCTAGCCTTCCATTCCACMCTCGGCATCAGAGTTCATGATACCACCTT
TCCCCTCAGCTCTCACACCTTTAAACAAGGGAACCAAAGACGCGACAGMAGGAGGATGCTGGTGCC TAGGMCCATTGGCCTCCTCCTTCGGATATCTGAGCAAACAAATCGGTGCCGTTGGATAGCTCAACT GCCATCGCAGCAACGAAGCCGATCATAGCAAGGCGGCCGTTMTCCTCTCGGGAGCCGGTCCGCTGA AGGCGAACAAGTCCGTMAGCTGGTGCTAACCTTTGGTTTAGMCTGATGGGTTGCGGCTGTGGTGA GGGAGGTGGAGAAGATGTCGTTGCCTCTTCTTGCTTCCTGTCATCCTCAGCCATACTGCGGACCTGA AGCCTMCTTTCCTCTGAATCTGAGGTGCAAAACCTAAAGAAGGAACCACTGGGCTTAGCCTCGATC GGTTAGCCAATCAACAACTGGGTTGGCGAGGAAAGATTGCCTGAGGGCGGAGCTA;
四、 根據(jù)構(gòu)建的抑制性消減雜交文庫(kù)克隆測(cè)序結(jié)果的Blastx分析中獲得早 期光誘導(dǎo)蛋白基因的3'片段，序列為-
ATACATTCACATACCAGACTTTCAGTAAGCTCGGCTGTTAAATTAGAACTATGGCAGTGTCTA GCTCCGCCCTCATGCAATCTTTCCCCGCCAACCCAGTTGGAGGATTGGCTMCCGATCGAGGCTAAG CCCAGTGGTTCCTTCTTTAGGTTTTGCACCTCAGATTCAGAGGAMGTTAGGCTTCAGGTCCGCAGT ATGGCTGAGGATGACAGGAAGCAAGMGAGGCAACGACATCTTCTCCACCACCCTCACCACAGCCAC AACCCATCAGT;
五、 將步驟三和四中所得的兩條EST序列進(jìn)行bl2seq比對(duì)拼接，即得到 完整的早期光誘導(dǎo)蛋白基因。
本發(fā)明是克隆出耐鹽能力極強(qiáng)的木本植物檉柳的一種鹽脅迫應(yīng)答基因-早 期光誘導(dǎo)蛋白基因，通過(guò)Northern雜交技術(shù)驗(yàn)證其對(duì)鹽和鹽堿脅迫的應(yīng)答情 況，證實(shí)其在檉柳中具有對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答功能，將其轉(zhuǎn)入到模式植物煙草中， 有效的增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽能力，轉(zhuǎn)基因煙草可以在含NaC10.6W的培養(yǎng) 基上正常生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)及生理指標(biāo)明顯比對(duì)照好，耐鹽能力提高了 50%以上。


圖1為具體實(shí)施方式
三中所得檉柳完整的早期光誘導(dǎo)蛋白基因片段的 PCR擴(kuò)增電泳圖譜，其中為a目的片段，b為DNAMarkerDL2000。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式早期光誘導(dǎo)蛋白基因的編碼區(qū)序列如SEQ
ID NO: 1所示。 具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式早期光誘導(dǎo)蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式早期光誘導(dǎo)蛋白基因按以下步驟制備
一、 CTAB法提取檉柳的總RNA;
二、 用Promega公司的mRNA分離試劑盒分離mRNA，取mRNA5ug用于構(gòu) 建檉柳cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為ZAP-cDNA Synthesis Kit和 ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit,所建立的檉柳cDNA文庫(kù)滴度為 7.2xl05pfb，重組率為98%，文庫(kù)克隆插入片段長(zhǎng)度為0.9 l.lkb;
三、 對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序觀IJ序引物為T3引物，cDNA文庫(kù)克隆的測(cè)序儀 為GE公司的MegaBACETM 1000 DNA序列分析儀，通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的Blastx分 析獲得早期光誘導(dǎo)蛋白基因的5'片段，序列為
CAGAATTTTAAAATTTTCTTTTTTTATTTATCTATTTATTTCATTGCAAAATTTGCTATACAC TAGAATATTCACTAATATTGCATTGTGCACATTCAGCGTAACAAATTTTGTAAATCAMGCAAATCA AAATTACCGACGTMACCAATGCCTTAGACAAGGGCCCCACCCTTTACATATTCAGTCMGGCCMG GCAACAAGACCTAACATAGCTAGCCTTCCATTCCACAACTCGGCATCAGAGTTCATGATACCACCTT TCCCCTCAGCTCTCACACCTTTAAACAAGGGAACC嵐GACGCGACAGAAAGGAGGATGCTGGTGCC TAGGMCCATTGGCCTCCTCCTTCGGATATCTGAGCAAACAAATCGGTGCCGTTGGATAGCTCAACT GCCATCGCAGCAACGAAGCCGATCATAGCAAGGCGGCCGTTAATCCTCTCGGGAGCCGGTCCGCTGA AGGCGAACAAGTCCGTAAAGCTGGTGCTAACCTTTGGTTTAGAACTGATGGGTTGCGGCTGTGGTGA GGGAGGTGGAGAAGATGTCGTTGCCTCTTCTTGCTTCCTGTCATCCTCAGCCATACTGCGGACCTGA AGCCTAACTTTCCTCTGAATCTGAGGTGCAAAACCTAAAGAAGGAACCACTGGGCTTAGCCTCGATC GGTTAGCCAATCAACAACTGGGTTGGCGAGGAAAGATTGCCTGAGGGCGGAGCTA;
四、 根據(jù)構(gòu)建的抑制性消減雜交文庫(kù)克隆測(cè)序結(jié)果的Blastx分析中獲得早 期光誘導(dǎo)蛋白基因的3'片段，序列為
ATACATTCACATACCAGACTTTCAGTAAGCTCGGCTGTTAAATTAGAACTATGGCAGTGTCTA
AACCCATCAGT;
五、將步驟三和四中所得的兩條EST序列進(jìn)行bl2seq比對(duì)拼接，即得到 完整的早期光誘導(dǎo)蛋白基因。
本實(shí)施方式中用NCBI ORF FOUNDER尋找開放讀碼框，該基因cDNA 序列全長(zhǎng)796bp，基因編碼區(qū)長(zhǎng)579bp，編碼192個(gè)氨基酸。
本實(shí)施方式中根據(jù)早期光誘導(dǎo)蛋白基因的序列設(shè)計(jì)引物，以含有早期光誘 導(dǎo)蛋白基因的文庫(kù)質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 由圖l中所示，在579 bp處得到了單一條帶，證明該基因?yàn)樵缙诠庹T導(dǎo)蛋白 基因。
本實(shí)施方式中步驟一中所用mRNA分離試劑盒為PolyATtract mRNA Isolation System III。
本實(shí)施方式中步驟四中構(gòu)建的抑制性消減雜交文庫(kù)的試劑盒為Clonthech
Kit。
本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使用操作手冊(cè)。
本實(shí)施方式中所得完整的早期光誘導(dǎo)蛋白基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體 pROKlI中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到煙草基因組，測(cè)定和分析了轉(zhuǎn)基因 煙草和對(duì)照煙草在0.6%NaCl脅迫前后的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、葉綠素含 量、光合速率和相對(duì)生長(zhǎng)量的變化，結(jié)果表明在0.6。/。的NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因 株系的相對(duì)電導(dǎo)率為15.6% 24.3%，明顯較對(duì)照的28.7%低，轉(zhuǎn)基因株系的 MDA含量為2.21 3.67，明顯低于對(duì)照的4.29，轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量在 17.1 20.6,明顯較對(duì)照16.5高，轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)生長(zhǎng)量在30.9 34.7%， 明顯高于對(duì)照的27.2%，說(shuō)明檉柳早期光誘導(dǎo)蛋白基因具有明顯的耐NaCl脅 迫能力。
序列表
〈110〉東北林業(yè)大學(xué)
〈120>早期光誘導(dǎo)蛋白基因及其制備方法
〈160> 4
〈210〉 1
〈211> 579 〈212〉腿
〈213>檉柳屬(Tamarix L.)
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222> (l)... (579)
〈400〉 1 atg gca
Met Ala
1
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gca 336 Ala
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115 120 125
gga ggc caa tgg ttc eta ggc acc age ate etc ctt tct gtc gcg tct 432 Gly Gly Gin Trp Phe Leu Gly Thr Ser lie Leu Leu Ser Val Ala Ser
130 135 140
ttg gtt ccc ttg ttt aaa ggt gtg aga get gag ggg aaa ggt ggt ate 480 Leu Val Pro Leu Phe Lys Gly Val Arg Ala Glu Gly Lys Gly Gly lie 145 150 155 160
atg aac tct gat gcc gag ttg tgg aat gga agg eta get atg tta ggt 528 Met Asn Ser Asp Ala Glu Leu Trp Asn Gly Arg Leu Ala Met Leu Gly
165 170 175
ctt gtt gcc ttg gcc ttg act gaa tat gta aag ggt ggg gcc ctt gtc 576 Leu Val Ala Leu Ala Leu Thr Glu Tyr Val Lys Gly Gly Ala Leu Val 180 185 190
taa 579
<210> 2 〈211〉 192 〈212〉 PRT
<213>檉柳屬(Tamarix L.)
<400> 2
Met Ala Val Ser Ser Ser Ala 1 5 Val Gly Gly Leu Ala Asn Arg 20
Leu Gly Phe Ala Pro Gin lie 35
Ser Met Ala Glu Asp Asp Arg
50 55 Pro Pro Pro Ser Pro Gin Pro 65 70 Ser Thr Ser Phe Thr Asp Leu 85
Arg lie Asn Gly Arg Leu Ala 100
Val Glu Leu Ser Asn Gly Thr 115
Gly Gly Gin Trp Phe Leu Gly 130 135 Leu Val Pro Leu Phe Lys Gly 145 150 Met Asn Ser Asp Ala Glu Leu
Leu Met Gin Ser Phe Pro Ala Asn Pro
10 15 Ser Arg Leu Ser Pro Val Val Pro Ser
25 30 Gin Arg Lys Val Arg Leu Gin Val Arg 40 45 Lys Gin Glu Glu Ala Thr Thr Ser Ser 60
Gin Pro lie Ser Ser Lys Pro Lys Val 75 80 Phe Ala Phe Ser Gly Pro Ala Pro Glu
90 95 Met lie Gly Phe Val Ala Ala Met Ala
105 110 Asp Uu Phe Ala Gin lie Ser Glu Gly 120 125 Thr Ser lie Leu Leu Ser Val Ala Ser 140
Val Arg Ala Glu Gly Lys Gly Gly lie 155 160 Trp Asn Gly Arg Leu Ala Met Leu Gly
165 170 Leu Val Ala Leu Ala Leu Thr Glu Tyr Val Lys 180 185
175
Gly Gly Ala Leu Val 190
〈210〉 3
〈211> 721
<212> DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉早期光誘導(dǎo)蛋白基因的5'片段。
〈400〉 3
aaattttctttttttattta
C3Ct3gaatattcactaatattgcattgtg
aagca^tc3cgtaaaccaa
attC3gtcfiaggcc犯ggca3c犯gacct3
catcagagttcatgataccEicctttcccct
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3C3teigct3gccttccattccacaactcgg240
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tgatgggttgcggctgtggtg鄉(xiāng)g鄉(xiāng)tg540
tgtcatcctcagccatactgcggacctgaa600
aggaaccactgggcttagcc660
ggcgagg犯agattgcctgagggcggagct720
〈210〉 4 <211〉 275 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉早期光誘導(dǎo)蛋白基因的3'片段。 <400〉 4
atacattcac ataccagact ttcagtaagc tcggctgtta aattag犯ct atggcagtgt 60
ctagctccgc cctcatgcaa tctttccccg ccaacccagt tggaggattg gctaaccgat 120
cgaggctaag cccagtggtt ccttctttag gttttgcacc tcagattcag aggaaagtta 180
ggcttcaggt ccgcagtatg gctgaggatg acaggaagca agaagaggca acgacatctt 240
ctccaccacc ctcaccacag ccacaaccca tcagt 27權(quán)利要求
1、早期光誘導(dǎo)蛋白基因，其特征在于早期光誘導(dǎo)蛋白基因的編碼區(qū)序列如下所示ATGGCAGTGTCTAGCTCCGCCCTCATGCAATCTTTCCCCGCCAACCCAGTTGGAGGATTGGCTAACCGATCGAGGCTAAGCCCAGTGGTTCCTTCTTTAGGTTTTGCACCTCAGATTCAGAGGAAAGTTAGGCTTCAGGTCCGCAGTATGGCTGAGGATGACAGGAAGCAAGAAGAGGCAACGACATCTTCTCCACCACCCTCACCACAGCCACAACCCATCAGTTCTAAACCAAAGGTTAGCACCAGCTTTACGGACTTGTTCGCCTTCAGCGGACCGGCTCCCGAGAGGATTAACGGCCGCCTTGCTATGATCGGCTTCGTTGCTGCGATGGCAGTTGAGCTATCCAACGGCACCGATTTGTTTGCTCAGATATCCGAAGGAGGAGGCCAATGGTTCCTAGGCACCAGCATCCTCCTTTCTGTCGCGTCTTTGGTTCCCTTGTTTAAAGGTGTGAGAGCTGAGGGGAAAGGTGGTATCATGAACTCTGATGCCGAGTTGTGGAATGGAAGGCTAGCTATGTTAGGTCTTGTTGCCTTGGCCTTGACTGAATATGTAAAGGGTGGGGCCCTTGTCTAA。
2、 早期光誘導(dǎo)蛋白基因，其特征在于早期光誘導(dǎo)蛋白基因的氨基酸序列 如下所示MetAlaValSerSerSerAlaLeuMetGinSerPheProAlaAsnProValGlyGlyLeuAlaAsnArgSerArgLeuSerProValValProSerLeuGlyPheAlaProGinlieGinArgLysValArgLeuGinValArgSerMetAlaGluAspAspArgLysGinGluGluAlaThrThrSerSerProProProSerProGinProGinProlieSerSerLysProLysValSerThrSerPheThrAspLeuPheAlaPheSerGlyProAlaProGluArglieAsnGlyArgLeuAlaMetlieGlyPheValAlaAlaMetAlaValGluLeuSerAsnGlyThrAspLeuPheAlaGinlieSerGluGlyGlyGlyGinTrpPheLeuGlyThrSerlieLeuLeuSerValAlaSerLeuValProLeuPheLysGlyValArgAlaGluGlyLysGlyGlylieMetAsnSerAspAlaGluLeuTrpAsnGlyArgLeuAlaMetLeuGlyLeuValAlaLeuAlaLeuThrGluTyrValLysGlyGlyAlaLeuVal
3、早期光誘導(dǎo)蛋白基因的制備方法，其特征在于早期光誘導(dǎo)蛋白基因按以下步驟制備一、CTAB法提取檉柳的總RNA; 二、 用Promega公司的mRNA分離試劑盒分離mRNA，取mRNA5ug用于構(gòu) 建檉柳cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為ZAP-cDNA Synthesis Kit和 ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit,所建立的檉柳cDNA文庫(kù)滴度為 7.2xl05pfu，重組率為98%，文庫(kù)克隆插入片段長(zhǎng)度為0.9 l.lkb;三、 對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序領(lǐng)IJ序引物為T3引物，cDNA文庫(kù)克隆的測(cè)序儀 為GE公司的MegaBACETM 1000 DNA序列分析儀，通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的Blastx分 析獲得早期光誘導(dǎo)蛋白基因的5'片段，序列為CAGAATTTTAAAATTTTCTTTTTTTATTTATCTATTTATTTCATTGCAAAATTTGCTATACACTAGAATATTCACTAATATTGCATTGTGCACATTCAGCGTAACAAATTTTGTAAATCAAAGCAAATCAAAATTACCGACGTAAACCAATGCCTTAGACAAGGGCCCCACCCTTTACATATTCAGTCAAGGCCAAGGCAACAAGACCTAACATAGCTAGCCTTCCATTCCACAACTCGGCATCAGAGTTCATGATACCACCTTTCCCCTCAGCTCTCACACCTTTAAACAAGGGAACCAAAGACGCGACAGAAAGGAGGATGCTGGTGCCTAGGAACCATTGGCCTCCTCCTTCGGATATCTGAGCAAACAAATCGGTGCCGTTGGATAGCTCAACTGCCATCGCAGCAACGAAGCCGATCATAGCAAGGCGGCCGTTAATCCTCTCGGGAGCCGGTCCGCTGAAGGCGAACAAGTCCGTAAAGCTGGTGCTAACCTTTGGTTTAGAACTGATGGGTTGCGGCTGTGGTGAGGGAGGTGGAGAAGATGTCGTTGCCTCTTCTTGCTTCCTGTCATCCTCAGCCATACTGCGGACCTGAAGCCTAACTTTCCTCTGAATCTGAGGTGCAAAACCTAAAGAAGGAACCACTGGGCTTAGCCTCGATCGGTTAGCCAATCAACAACTGGGTTGGCGAGGAAAGATTGCCTGAGGGCGGAGCTA;四、 根據(jù)構(gòu)建的抑制性消減雜交文庫(kù)克隆測(cè)序結(jié)果的Blastx分析中獲得早 期光誘導(dǎo)蛋白基因的3'片段，序列為ATACATTCACATACCAGACTTTCAGTAAGCTCGGCTGTTAAATTAGAACTATGGCAGTGTCTAGCTCCGCCCTCATGCAATCTTTCCCCGCCAACCCAGTTGGAGGATTGGCTAACCGATCGAGGCTAAGCCCAGTGGTTCCTTCTTTAGGTTTTGCACCTCAGATTCAGAGGAAAGTTAGGCTTCAGGTCCGCAGTATGGCTGAGGATGACAGGAAGCAAGAAGAGGCAACGACATCTTCTCC ACCACCCTCACCACAGCCACAACCCATCAGT;五、將步驟三和四中所得的兩條EST序列進(jìn)行bl2seq比對(duì)拼接，即得到 完整的早期光誘導(dǎo)蛋白基因。
全文摘要
早期光誘導(dǎo)蛋白基因及其制備方法，它涉及一種蛋白基因及其制備方法。它解決了現(xiàn)有耐鹽基因轉(zhuǎn)化獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽能力不高的問(wèn)題。本發(fā)明早期光誘導(dǎo)蛋白基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明早期光誘導(dǎo)蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明采用cDNA文庫(kù)技術(shù)和抑制性消減雜交技術(shù)，對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行EST分析，篩選獲得該基因的5，和3’部分序列，然后將兩個(gè)序列拼接后得到早期光誘導(dǎo)蛋白基因。本發(fā)明所得基因轉(zhuǎn)入到模式植物煙草中以后，轉(zhuǎn)基因煙草可以在含NaCl 0.6％的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)及生理指標(biāo)明顯比對(duì)照好，耐鹽能力提高了50％以上。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101363024SQ20081013723
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者劉桂豐, 靜 姜, 楊傳平, 王玉成, 高彩球 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)