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      玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚γ-谷氨酸的方法

      文檔序號:565761閱讀:335來源:國知局
      專利名稱:玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚γ-谷氨酸的方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術,具體說就是以玉米原料枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分
      子聚合物聚Y -谷氨酸(Poly Y -glumatic acid Y -PGA )的方法。
      背景技術
      聚y -谷氨酸(Poly y -glumatic acid y -PGA )是自然界中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的陰離子型多 聚氨基酸,由D型谷氨酸和L型谷氨酸通過a -氨基和Y -羧基形成的高分子聚合物。
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      在每一個重復單元的a碳原子,還有一個游離的羧基,因此Y-PGA的分子鏈上具有大量的 活性較高的游離側鏈羧基,可在分子內(nèi)部或分子之間形成氫鍵。Y-PGA通常由5000個左 右的谷氨酸單體組成,相對分子質量一般在100 1000kD,沒有典型的肽鏈結構,也不是 一種環(huán)狀多肽,基本骨架呈直鏈纖維狀。
      Y-PGA分子中有大量游離的親水性羧基,它具有很多優(yōu)良特性(l)可在分子內(nèi)部或 分子之間形成氫鍵,水溶性好;(2)對金屬離子的吸附性強;(3)優(yōu)良的生物降解性。主鏈 上存在大量肽鍵,也帶來很多優(yōu)良特性(l)在體內(nèi)環(huán)境下受酶的生物作用,會降解生成 無毒的短肽、小分子或氨基酸單體。在醫(yī)藥行業(yè)上開發(fā)出的手術線和手術粘合劑就是利用 這點性質。(2)在自然環(huán)境中,會受到某些微生物的作用而降解,可食無毒。利用這點可 生產(chǎn)可降解的塑料。其他性質良好的生物相容性;無自身抗原性;抗凍特性;絮凝特性;高 分子量,平均分子量為100-1000 kDa,化學合成一般達不到這么高的分子量,且合成成本 要很高。在生理功能方面可防止細胞脫水、保護細胞免受蛋白酶的降解等;Y-PGA在放射 線照射下會增加分子間的結合,提高吸水性能,由此可開發(fā)出一種強吸水性很強的生物樹 脂。這種樹脂有良好的粘彈性,并在一定范圍內(nèi)具有耐酸、堿、鹽,耐高滲透壓,抗凍融 等優(yōu)良特性。Y -PGA強酸高溫徹底酸水解后測得Y -PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值穩(wěn) 定在D:L =60:40。 y -PGA水溶液的流變性能溶液是非牛頓剪切變稀的假塑性流體(Yang, G., et al.,2002),其粘度隨溫度的升高而呈現(xiàn)下降。這些優(yōu)良的理化性質決定這種材料在多 行業(yè)有著廣泛的發(fā)展前景。
      目前通過微生物得到的聚合氨基酸主要包括三種聚y -谷氨酸(Poly y -glumatic acid y-PGA )、聚賴氨酸(E-poly lysine E-PL)與藻青素(cyanophycin )。
      y-PGA具有水溶性好,對人體無害以及良好的生物可降解等優(yōu)點這類由生物合成的可降解型功能材料 受到人們的關注,因此具有良好的開發(fā)價值和廣闊前景。目前日本、美國等一些發(fā)達國家 對它制備和應用的研究十分活躍,并取得了較大的進展。
      從1937年Ivnovics首次發(fā)現(xiàn)了 y-PGA到1942年Bovarnick等人發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌 屬細菌能通過發(fā)酵培養(yǎng)積累y-PGA,直至現(xiàn)今各國重點研究生產(chǎn)y-PGA的各種菌種,這些 菌種有著共性也有著個性,共性就是生產(chǎn)y -PGA的菌主要是芽孢桿菌屬(Aaw7hs)的菌株, 包括各種(納豆)枯草芽孢桿菌(feci"^仰6^ h's) ( Goto A, 1992, Ashiuchi M, 2002. Kubota H, 1993)地衣芽孢桿菌Cft h'c力e加'/br/z is) ( Birrer G A. 1993, Shih I L. 2002)。 個性就是這些菌種發(fā)酵條件各異,培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件都有很大差異,如對谷氨酸的依 賴性可將現(xiàn)有的產(chǎn)y-PGA菌種分為谷氨酸依賴型和谷氨酸非依賴型;pH、通氧的不同對y -PGA產(chǎn)量都有影響。如谷氨酸依賴性,最高產(chǎn)量為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 58. 3g/L,地衣芽孢桿菌Ascj77"s Ji'c力e/7i/b/7/ 7's Zy-50最高產(chǎn)量為24. 128,谷氨酸依 賴型的菌株生產(chǎn)所得的y-PGA產(chǎn)量較非谷氨酸依賴型的產(chǎn)量明顯偏高,這些不僅說明了谷 氨酸具有促進y -PGA有關酶活性而且可能作為前提物參入到了 y -PGA的合成。
      y-PGA的應用領域 y-PGA由前所提及的優(yōu)良的理化性質可廣泛用做環(huán)保領域如生 物絮凝劑、重金屬吸附劑,食品工業(yè)如增稠劑,農(nóng)業(yè)領域如保濕劑,醫(yī)藥工業(yè)如藥物載體、 醫(yī)用生物粘合劑等等, 一般認為它對人類和環(huán)境無毒害,甚至可食用。y-PGA及其衍生物 潛在應用價值極大可發(fā)展出許多特殊用途是一種有極大開發(fā)價值和應用前景的多功能新 型生物制品。
      1. y-PGA在食品工業(yè)上的應用y-PGA在食品中可用于新型的食品添加劑、抗凍劑、 礦質吸收促進劑、除澀劑、穩(wěn)定劑等。
      y-PGA作為新型的食品添加劑y-PGA分子上含有大量親水基團,因而具有良好的吸 水保濕性能可應用于淀粉類食品。日本將它用于淀粉類食品(糕點、面條)中,可防止老化、 增強質地、維持食品外形和延長貨架期;y-PGA可以增加面包、蛋糕的彈性,使面包、蛋 糕的顆粒更加細致,y-PGA還可以增強面條的韌性,防止面條中的固體物質溶解在沸水中。
      Y- PGA作為抗凍劑頻繁冷凍和融化生物細胞、生物活性物質和食品等會加速其退 化和腐敗,而加入y -PGA可以避免這種狀況(Sung M.H. , et al. 2005) 。 y-PGA具有好 的抗凍性能,y-PGA的抗凍性和可食用性使y-PGA可被廣泛的應用于食品加工領域和對 深度冷凍敏感的酶或培養(yǎng)物的冷藏凍藏,而且y-PGA比通常的低分子量防凍劑(如糖類無 機鹽和蛋白質等)味淡,食品中即使加入了大量的y -PGA對口感影響也不大。
      y- PGA作為礦質吸收促進劑 y -PGA還可以作為礦質吸收促進劑,在含高礦物質 的食品中加入了y-PGA或其降解產(chǎn)物可以促進小腸對礦物質的吸收。與酪蛋白磷酸肽相 比,y-PGA具有優(yōu)良的水溶性,效果更佳。而且y-PGA可以掩蓋高濃度礦質元素所帶來 的刺激性、收斂性和粗糙感等適口性問題,尤其適用于補鈣和補鐵的保健品。
      y _ PGA作為除澀劑 y-PGA可作為各種食品的苦味掩蓋劑和除澀劑(董惠均,2005),研究發(fā)現(xiàn),y-PGA可以消除或減少諸如氨基酸、多肽、奎寧、咖啡因、礦物質引起的酸味, 是高鈉調味劑的替代品,可為糖尿病患者和高血壓患者所用,作為健康飲食的一個組分。 y-PGA作為穩(wěn)定劑可用作冰淇淋的穩(wěn)定劑;果汁飲料的增稠劑等((Shih and van, 2001)。
      2. y -PGA在農(nóng)業(yè)領域的應用 y -PGA與其他單體經(jīng)過聚合能夠得到一種高倍吸水性 樹脂((Superabsorbent polymer, SAP),吸水能力急劇增強目前報道的最高可達5300倍
      (張新民等,2004)。這種高吸水性樹脂無毒、無味、無色透明,具有高吸水性和保水性。 將這種高吸水性樹脂應用在荒山、禿嶺、沙漠治理等方面可發(fā)揮積極作用,我國科研人員 采用y-PGA吸水樹脂種子做發(fā)芽實驗取得了良好的效果。另外,在肥料、殺蟲劑、除草劑、 驅蟲劑等使用時,加入適量的y-PGA鹽可以延長這些藥物在作用對象表面上的停留時間, 不易因干燥、下雨而被沖刷掉。
      3. y-PGA在環(huán)保領域的應用
      y-PGA用于生物修復全世界工業(yè)的高速發(fā)展的同時,也帶來了對環(huán)境的嚴重污染, 目前被污染的土壤、水和空氣的凈化修復是我們迫切解決的難題。利用y-PGA與這些污染 物之間的黏附濃縮作用機制可對被污染的環(huán)境進行修復。如利用y-PGA吸水與土壤結合, 能提高土壤吸濕能力、通風性、保肥性能,在大規(guī)模改造荒山、沙漠方面能發(fā)揮積極作用。 y-PGA能吸收農(nóng)藥和化肥,防止流失并緩慢釋放,改善作物栽培條件、提高肥料的利用率。
      y-PGA作為生物絮凝劑治理水污染生產(chǎn)上已經(jīng)開發(fā)了的用于廢水處理、工業(yè)下游處 理的許多絮凝劑如鋁鹽、聚丙烯酸、活性炭材料,這些材料既經(jīng)濟又有效,應用最為廣泛, 但是大多數(shù)不能被生物降解,長期使用也會對環(huán)境造成二次污染。利用y-PGA的電負性和 粘結性對水中的污染物進行處理不僅可以應用于廢水處理、飲用水的純化及深海水的加 工,而且也可以用于食品和發(fā)酵工業(yè)的下游工程操作。此外還可以作為重金屬和放射性核 物質的吸附劑。
      4. y-PGA在工業(yè)領域的應用利用y-PGA聚合成高分子材料此類聚合物性質類似于 塑料,可以用來制造皮革、纖維、食品包裝膜等,具有適合的強度、透明度和較好彈性。 y-PGA用苯乙烯改性后,可得到高抗堿性的纖維樹脂。若通過改性再聚合,可得到比一般 天然纖維和化學纖維更優(yōu)的材料。利用y-PGA合成的材料相對于現(xiàn)有的材料優(yōu)點在于可降 解,無毒,對環(huán)境沒有危害是一種綠色的高分子塑料。
      5. y-PGA在醫(yī)藥領域的應用 y-PGA聚合的高分子材料可用于藥品的包裝膜,可降 解手術線等。近年來國外還有人研究得出y-PGA還能夠增強前列腺素El的作用。還建立 了用谷氨酞聚合物作為基因治療的載體。由交聯(lián)膠原蛋白和y-PGA制備的一種新型生物粘 合劑表現(xiàn)出比外科手術粘合劑及纖維膠更高的軟組織粘合和止血作用,并且能夠在體內(nèi)降 解而不會引起任何炎癥反應(Otani, etal, 1998)。
      工業(yè)化發(fā)酵制取y -PGA存在的問題 y -PGA發(fā)酵有幾個因素同其他發(fā)酵不同導致發(fā)
      酵成本高l原料成本在發(fā)酵中一般加入碳源葡萄糖、檸檬酸、甘油、谷氨酸、蛋白胨或者是酵母膏這些原料用量較大,產(chǎn)物的得率相對發(fā)酵的其他產(chǎn)物較低。無疑原料成本占 生產(chǎn)成本的很大比重;2生產(chǎn)成本Y-PGA為高分子聚合物,發(fā)酵液隨著發(fā)酵時間的增長, 粘度不斷加大,溶氧就成為發(fā)酵中難以解決的難題,采取的一些措施如果通入純氧相比通 過空氣成本必定加大,采用特殊的發(fā)酵罐如提高高徑比,發(fā)酵罐的特殊性增加了固定成本, 同時攪拌動力消耗也較大,這些因素同其他發(fā)酵產(chǎn)品相比無疑加大了成本。后期發(fā)酵產(chǎn)物 提取也是一個比較難且需要好成本較高的難題,如發(fā)酵液粘度高,發(fā)酵液中的菌體不易除 去,提取Y-PGA時一般采取有機溶劑提取,有機溶劑與發(fā)酵液的體積比一般在3: 1,乙
      醇的消耗占很大的比例,這部分成本這無疑增加了聚谷氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的難度。因此,篩
      選利用廉價原料的優(yōu)良菌種,供氧條件不苛刻,優(yōu)化發(fā)酵條件,對Y-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)具 有重要的實際意義。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供一種以玉米為基本原料用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合 物聚Y-谷氨酸(Poly Y-glumatic acid Y-PGA)的方法。以玉米為基本原料用枯草芽孢桿菌 液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合物聚Y-谷氨酸(PolyY-glumatic acid Y-PGA)的方法,篩選得到 一株枯草芽孢桿菌HCUL-B-115(5a"7/w"wMfcHCUL-B-115),保藏在郵政編碼100101,
      地址北京市朝陽區(qū)大屯路,中國科學院微生物研究所,中國微生物菌種保藏管理委員會
      普通微生物中心(CGMCC),保藏編號CGMCCNo:2283,分類命名枯草芽孢桿菌 5ac"/iw;sMZ)"'fo ;保藏時間2007年12月06日。
      一株枯草芽孢桿菌HCUL-B-115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液 為基本原料經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)生Y -PGA。
      斜面培養(yǎng)基上的種子接入液體種子培養(yǎng)基中,在20-42°C 、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-24 小時;
      1) 斜面種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏L0-30.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L, 瓊脂15.0-20.0g/L, pH值6.5-7.4;
      2) 液體種子培養(yǎng)基配方:蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L (或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L),麩酸1.0-100.0g/L,
      NaC10.1-8.0g/L, pH6.5 7.4。
      產(chǎn)生Y-PGA的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米原料和麩酸,發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨 1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-10O.0g/L (或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米 糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L 、),麩酸1.0掘.0g/L ,氯化鈉1.0-8.0g/L , KH2PO400.1-15.0g/L, MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。在20-42°C、 100-250r/min搖床培 養(yǎng)12-96小時。
      Y-PGA的提取,采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法,干燥采用-10 -80。C冷凍 干燥法。本發(fā)明的優(yōu)點是該菌株(5""7/^^6ft7/sHCUL-B-115)能夠利用玉米、玉米淀 粉、玉米糊精、玉米糖化液為原料液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生Y-PGA,原料價格低廉,成本降低,易進行工業(yè)化生產(chǎn)。


      圖1是酸水解HPLC測定y -PGA的組成;圖2是硅膠薄層層析測定y -PGA的組成;圖
      3是SDS-PAGE凝膠電泳定測y -PGA的分子量;圖4是標準y -PGA紅外掃描光譜;圖
      5是HCUL-B115菌株產(chǎn)y -PGA紅外掃描光譜。 ^ c///^; wMfoHCUL-B-115 16srDNA序列測定結果附表1。
      具體實施例方式
      所述菌株為HCUL-B-115,是從中國傳統(tǒng)食品豆豉、豆醬、日本納豆中采集樣品,經(jīng) 分離純化,反復篩選誘變獲得一種枯草芽孢桿菌HCUL-B-115 (力ac77/ws s"6說/s HCUL-B-115),保藏在郵政編碼100101,地址北京市朝陽區(qū)大屯路,中國科學院微 生物研究所,中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏編號 CGMCCNo:2283,分類命名枯草芽孢桿菌5""7/w"wto'fe ,*保藏時間2007年12月 06日。
      本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌種的特征是該菌種細胞形態(tài)為桿狀、革蘭氏染色陽性、
      細胞直徑小于lum、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈短桿狀、不形成伴孢晶體、接觸
      酶陽性、氧化酶陽性、好氧生長、VP試驗陽性、VP< pH6、 VP >pH7均呈陰性,甲基
      紅試驗陰性、能夠利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸、利用葡萄糖不產(chǎn)氣、能
      利用檸檬酸鹽、能還原硝酸鹽、5(TC溫度下能生長、在pH5.7和7MNaCl培養(yǎng)基中能夠
      生長、能水解淀粉和干酪素。
      5acz7/w 16srDNA序列測定結果附表1 。
      該菌種能夠利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米水解液為基本原料經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵 產(chǎn)生Y -PGA。
      本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的 一種以玉米為基本原料用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚 合物聚Y-谷氨酸(PolyY-glumatic acid Y-PGA)的方法。以玉米為基本原料用枯草芽孢桿 菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合物Y-聚谷氨酸(PolyY-glumatic acid Y-PGA)的方法,篩選得 到一株枯草芽孢桿菌HCUL-B-115 (Bfld〃w;yHCUL-B-115),保藏在郵政編碼 100101,地址北京市朝陽區(qū)大屯路,中國科學院微生物研究所,中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏編號CGMCCNo:2283,分類命名枯草 芽孢桿菌5flc/Z/船做to'fc ;保藏時間2007年12月06日。
      一株枯草芽孢桿菌HCUL-B-115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液 為基本原料經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)生Y -PGA。
      斜面培養(yǎng)基上的種子接入液體種子培養(yǎng)基中,在20-42°C 、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-24 小時;
      1) 斜面種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L, 瓊月旨15.0-20.0g/L, pH值6.5-7.4;
      2) 液體種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L(或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L),麩酸1.0-100.0g/L, NaC10.1-8.0g/L, pH6.5 7.4。產(chǎn)生Y-PGA的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米原料和麩酸,發(fā) 酵培養(yǎng)基蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L (或玉米糊精 2.0-100.0g/L、玉米糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L、),麩酸1.0-100.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L, KH2PO400.1-15.0g/L, MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。在20誦42。C、 100-250r/min搖床培 養(yǎng)12-96小時。
      Y-PGA的提取,采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法,干燥采用-10 -8(TC冷凍 干燥法。
      一、 菌種的分離篩選
      1樣品處理稱取分離材料2.0g于滅菌帶玻璃珠的50 mL小三角瓶中,加無菌水 10mL,用棉塞封口,震蕩后置于80-85。C恒溫水浴箱中保溫10-30min。取上述處理過的樣 品lmL接種到裝有80mL基礎培養(yǎng)基250mL三角瓶中于30-37°C ,搖床富集培養(yǎng)10-24h。
      2菌種分離純化
      (1) 分離取上述富集培養(yǎng)液lmL,采用10倍梯度稀釋方法涂布于裝有選擇性培養(yǎng)基 的平板上,30-39'C恒溫培養(yǎng)24-36h觀察菌落情況并記錄,選擇直徑大的單菌落,經(jīng)多次 劃線分離直至得到純菌落,作為初篩菌株。
      (2) 復篩從初篩的菌株中選擇菌落較大,有粘液且有明顯拉絲的菌株作為復篩的 初發(fā)菌株,將其接種到新鮮液體種子培養(yǎng)基中,30-39'C搖床培養(yǎng)24-36h后,按2%-10%
      (V/V)的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30-39。C下 100-250r/min振蕩培養(yǎng)24-72小時。培養(yǎng)結束測動力黏度,挑選發(fā)酵液黏度比較大的菌株 作為復篩菌株,反復進行3-5次,選育出優(yōu)良菌株。
      3菌種的誘變及選育將保存的菌種轉接在斜面培養(yǎng)基上30-39。C培養(yǎng)24-48h。取一環(huán) 菌苔接種于裝有25mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在100-250r/min振蕩培養(yǎng),30-39 'C培養(yǎng)12-16h,使其處于對數(shù)生長期。然后取10mL培養(yǎng)液離心收集菌體,再用生理鹽水 洗滌菌體2-3次,用10mL生理鹽水調整菌濃度,制成細胞濃度為1(f個/mL的菌懸液。取 4mL菌液于75mm的培養(yǎng)皿中(帶磁棒),置于紫外誘變箱的磁力攪拌器上,開啟磁力攪拌器, 打開皿蓋,在黑暗中15-30 W紫外燈下10-30cm誘變處理5-15min,取處理液接種于選擇 培養(yǎng)基中。30-39'C選擇培養(yǎng)24-48小時,挑取單菌落接斜面?zhèn)溆谩?br> 然后,將斜面培養(yǎng)的菌種接種于液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)結束測動力黏度,挑選發(fā)酵液黏 度比較大、Y-PGA含量高的菌株作為復篩菌株,反復進行3-5次,選育出優(yōu)良菌株,即得 到HCUL-B-115菌株。然后將HCUL-B-115菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次,對 HCUL-B-115菌株進行遺傳穩(wěn)定性測定,每次傳代后在發(fā)酵培養(yǎng)基上測其黏度和Y -PGA含 量。
      二、 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生Y-PGA
      1種子培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)基上的單菌落挑至液體種子培養(yǎng)基中,在20-42'C、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-24小時。
      斜面種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L,瓊 脂15.0-20.0g/L, pH值6.5-7.4。液體種子培養(yǎng)基配方一蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏 1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L,麩酸1.0-100.0g/L, NaC10.1-8.0g/L, pH6.5 7.4。
      液體種子培養(yǎng)基配方二蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米糊精 2.0-100.0g/L,麩酸1.0-100.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L, pH6.5 7.4。
      液體種子培養(yǎng)基配方三蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米糖化液(還原 糖含量)2.0-100.0g/L,麩酸1.0-100.0g/L,氯化鈉L0-8.0g/L, pH6.5 7.4。
      2液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生Y-PGA 將培養(yǎng)成熟的液體種子按1-15%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中,在20-42°C、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-96小時。
      發(fā)酵培養(yǎng)基配方一蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L, 麩酸L0-100.0g/L,氯化鈉1.0隱8.0g/L, KH2PO400.1-15.0g/L, MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。
      發(fā)酵培養(yǎng)基配方二蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米糊精2.0-100.0g/L, 麩酸1.0-100.0g/L,氯化鈉1.0-8.0g/L, KH2PO400.1-15.0g/L, MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。
      發(fā)酵培養(yǎng)基配方三蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米糖化液(還原糖含 量)2.0-100.0g/L ,麩酸1.0-100.0g/L ,氯化鈉1.0-8.0g/L , KH2PO400.1-15.0g/L , MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。
      玉米糖化液是這樣制取的稱取100-300g玉米粉,加入300-900mL水,用NaOH調 整至pH7.6,加熱至IO(TC,再加5-50ua -淀粉酶/g原料,攪拌10-40min。冷卻至50-65°C, 用HC1調pH5.0-5.5,加入糖化酶50-350u/g原料,保溫5-24h,過濾,即得玉米糖化液,備用。
      三、 Y-PGA的提取
      發(fā)酵結束后,取100-1 OOOmL發(fā)酵液,加入蒸餾水200-2000mL, 8000-20000rpm高速 離心10-30min,棄去沉淀。再取離心液100-lOOOmL,量取甲醇、乙醇混合液(甲醇乙 醇=1: 3) 250-2500mL,倒入離心液中,靜置10-30min,出現(xiàn)沉淀,輕輕倒去上清液,沉 淀進行-10~ -8(TC冷凍干燥,即得Y -PGA粉末。
      四、 Y-PGA的鑒定
      1. Y-PGA組成的鑒定 取樣品0.5g放入水解管中,加入10 mL 6 mol/L HC1,抽真 空,110。C水解24h,冷卻后移至lOOmL容量瓶中,定容,經(jīng)0.45 iim微孔濾膜過濾后取 濾液用高壓液相色譜測定谷氨酸和薄板層析分析氨基酸組成。其結果是圖l所示的酸水解 HPLC測定y-PGA的組成。
      薄板層析鑒定氨基酸組成用硅膠G制備薄層層析用硅膠板,11(TC活化5min后,在硅 膠板上點樣,選用正丁醇:乙酸:水=3: 1: l展開劑溶液,上行法展開后,以0.25%茚三銅顯色,于干燥箱中加熱6(TC烘干15min。其結果是圖2所示的圖硅膠薄層層析測定Y-PGA 的組成。
      通過酸水解HPLC測定Y-PGA的組成,可見,此聚合物的水解產(chǎn)物只含有一種氨基酸, 與標準谷氨酸的出峰時間相同,推斷此水解物為谷氨酸。同時對照硅膠薄層層析圖2,水 解物只顯示一個斑點,也說明此水解物只有一種氨基酸組成,并且其遷移率與標準L-谷氨 酸相同,因此,更進一步證明該聚合物是由谷氨酸一種氨基酸組成,可以認為是谷氨酸的 同聚物。
      2. Y-PGA分子量的測定
      凝膠電泳法測定分子量采用分離膠5-15% ,堆積膠1-10%,電泳條件為操作電壓 50-100V ,穩(wěn)壓l-3h,標準蛋白質用考馬斯亮藍R250染色,y -PGA用阿利新蘭8GX復 染。根據(jù)樣品和標準蛋白的SDS-PAGE,測定其相對遷移率(Rm),然后用標準蛋白的Rm 值和對應的分子量的對數(shù)值作標準曲線,由此估算樣品的分子量。其結果是圖3所示的 SDS-PAGE凝膠電泳定測Y -PGA的分子量
      采用SDS-PAGE變性電泳檢測到HCUL-B-115菌株產(chǎn)生的Y-PGA的分子量在600 700kD之間,分子量均一。圖中1號泳道為高分子量標準蛋白質,2號為Y-PGA樣品。
      3. 標準y -PGA與HCUL-B-115菌株產(chǎn)Y -PGA紅外掃描光譜分析
      取樣品0.2 mg,在6(TC下真空干燥,與少量KBr研磨壓片制樣,然后用紅外光譜儀 測定樣品的紅外圖譜,掃描范圍4000 400cm-l。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由 紅外光譜鑒定,其結果是圖4所示的圖4標準Y -PGA紅外掃描光譜。圖5是HCUL-B-115 菌株產(chǎn)Y-PGA紅外掃描光譜,通過紅外掃描圖譜解析,結合標準譜圖對照可知該聚合物 為Y -PGA聚酰胺類化合物無疑。
      實例h
      1種子培養(yǎng)配制斜面種子培養(yǎng)基蛋白胨5.0g/L,牛肉膏3.0g/L,氯化鈉3.0g/L, 瓊脂20.0g/L, pH值7.4, 12rC滅菌20min,冷卻至室溫,接種,35。C恒溫培養(yǎng)24小時。
      將斜面培養(yǎng)基上的種子接種至液體種子培養(yǎng)基中,液體種子培養(yǎng)基配方蛋白胨 5.0g/L,牛肉膏3.0g/L,玉米淀粉20.0g/L,麩酸20.0g/L, NaCl 3.0g/L, pH7.4。 121。C滅 菌20min,冷卻至室溫,接種,在35'C、 200r/min搖床培養(yǎng)24小時。
      2液體發(fā)酵將培養(yǎng)成熟的液體種子按8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)基配 方蛋白胨5.0g/L,牛肉膏3.0g/L,玉米淀粉50.0g/L,麩酸50.0g/L,氯化鈉3.0g/L, KH2PO4。1.0g/L, MgSO40.5g/L, pH7.4。 121。C滅菌20min,冷卻至室溫,接種,在35°C、 200r/min 搖床培養(yǎng)72小時。
      3 Y-PGA的提取發(fā)酵結束后,取100mL發(fā)酵液,加入蒸餾水200mL, 10000rpm 高速離心10min,棄去沉淀。按上清液體積的2.5倍量取甲醇、乙醇混合液(甲醇乙醇 =1: 3),倒入離心液中,靜置30min,出現(xiàn)沉淀,輕輕倒去上清液,沉淀進行-40。C冷凍干 燥,得到Y-PGA產(chǎn)品。實例2:
      1種子培養(yǎng)同實例l。
      2液體發(fā)酵將培養(yǎng)成熟的液體種子按8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)基配 方蛋白胨5.0g/L,牛肉膏3.0g/L,玉米糊精50.0g/L,麩酸50.0g/L,氯化鈉3.0g/L, KH2PO401.0g/L, MgSO40.5g/L, pH7.4。 121。C滅菌20min,冷卻至室溫,接種,在35°C、 200r/min 搖床培養(yǎng)72小時。
      3 Y-PGA的提取 同實例一。
      實例3:
      1種子培養(yǎng)同實例l。
      2液體發(fā)酵將培養(yǎng)成熟的液體種子按8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)基配 方蛋白胨5.0g/L,牛肉膏3.0g/L,玉米糖化液(還原糖含量)50.0g/L,麩酸50.0g/L,氯 化鈉2.0g/L, KH2PO4。1.0g/L, MgSO40.5g/L, pH7.4。 12rC滅菌20min,冷卻至室溫,接種, 在35 °C 、 200r/min搖床培養(yǎng)72小時。
      玉米糖化液的制取稱取100g玉米粉,加入300mL水,用NaOH調整至pH7.6,加 熱至10(TC,再加10ua-淀粉酷/g原料,攪拌15min。冷卻至62。C,用HC1調pH5.0,加 入糖化酶120u/g原料,保溫10h,過濾,即得玉米糖化液,調節(jié)pH7.4,備用。
      3 Y-PGA的提取 同實例一。<formula>formula see original document page 12</formula>
      權利要求
      1、一種玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚γ-谷氨酸的方法,其特征在于以玉米為基本原料用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Polyγ-glumatic acid γ-PGA)的方法,篩選得到一株枯草芽孢桿菌HCUL-B115(Bacillus subtilis HCUL-B115),保藏在中國微生物菌種保藏中心(CGMCC),保藏編號CGMCC No2283。
      2、 根據(jù)權利要求1所述的玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚y-谷氨酸的方 法,其特征在于 一株枯草芽孢桿菌HCUL-B115能利用玉米、玉米淀粉、玉米 糊精、玉米糖化水解液為基本原料經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)生y -PGA。
      3、 根據(jù)權利要求2所述的玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚y -谷氨酸的方 法,其特征在于斜面培養(yǎng)基上的種子接入液體種子培養(yǎng)基中,在20-42°C、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-24小時;1) 斜面種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,氯化鈉 1.0-8.0g/L,瓊月旨15.0-20.0g/L, pH值6.5-7.4;2) 液體種子培養(yǎng)基配方蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀 粉2.0-100.0g/L(或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L), 麩酸1.0-100.0g/L, NaC10.1-8.0g/L, pH6.5 7.4。
      4、 根據(jù)權利要求3所述的玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚y -谷氨酸的方法,其特征在于產(chǎn)生y-PGA的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米原料和麩酸,發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨1.0-25.0g/L,牛肉膏1.0-30.0g/L,玉米淀粉2.0-100.0g/L (或玉 米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液還原糖含量2.0-100.0g/L、),麩酸1.0-100.0g/L, 氯化鈉1.0-8.0g/L, KH2PO400.1-15.0g/L, MgSO40.1-10.0g/L, pH6.5 7.4。在 20-42°C、 100-250r/min搖床培養(yǎng)12-96小時。
      5、 根據(jù)權利要求4所述的玉米原料枯草芽孢桿菌發(fā)酵制取聚y -谷氨酸的方 法,其特征在于y-PGA的提取,采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法,干燥采用-io- -8(rc冷凍干燥法。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及的是以玉米原料枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法。其特點是以玉米為基本原料用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法,篩選得到一株枯草芽孢桿菌HCUL-B115(Bacillus subtilis HCUL-B115),保藏在中國微生物菌種保藏中心(CGMCC),保藏編號CGMCC No2283。一株枯草芽孢桿菌HCUL-B115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液為基本原料經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)生γ-PGA。本發(fā)明的優(yōu)點是該菌株(Bacillus subtilis HCUL-B115)能夠利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化液為原料液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生γ-PGA,原料價格低廉,成本降低,易進行工業(yè)化生產(chǎn)。
      文檔編號C12N1/20GK101503716SQ20081013731
      公開日2009年8月12日 申請日期2008年10月13日 優(yōu)先權日2008年10月13日
      發(fā)明者穎 劉, 偉 徐, 梁金鐘 申請人:哈爾濱商業(yè)大學
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