專利名稱：一種生物堿化合物及其制備方法與作為酶抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有新穎啞嗪環(huán)結(jié)構(gòu)的生物堿類化合物，特別是涉及一類具 有酶抑制活性的生物堿化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1929年從真菌中制備出青霉素以來，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐 富來源，絕大多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來源于真菌和細(xì)菌。真菌的代謝產(chǎn)物還 有其他的藥用價(jià)值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，酶抑制劑等。由于海洋環(huán)境 的特殊性，海洋真菌能提供陸生真菌無法提供的代謝產(chǎn)物，但目前尚未見到由 海洋真菌獲得有藥用價(jià)值的酶抑制劑產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于海洋真菌的生物堿化合物及其制備方法 與作為酶抑制劑的應(yīng)用，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。 一種生物堿化合物，其特征在于它的結(jié)構(gòu)式為
OAc OAc
上述生物堿化合物的制備方法，其特征在于先在培養(yǎng)基中對(duì)海洋真菌進(jìn)行 菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將所得發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液加熱濃縮，用乙酸乙酯萃?。惠腿∫簼饪s后進(jìn)行色譜分離，
將所得洗脫液濃縮，得無色結(jié)晶，即為penicillazine;在溶有Penicillazine的溶 液中，.加入溴或二氧化錳，反應(yīng)后分別得到Penicillazines 1和2;或者在溶有 Penicillazine 2的溶液中，加入醋酸酐，反應(yīng)后得到Penicillazines 3禾口 4。
上述的生物堿化合物在制備酶抑制劑藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明從海洋真菌中獲得了一個(gè)新的生物堿，并且對(duì)該化合物進(jìn)行了化學(xué) 修飾，具有酶抑制活性，能有效地抑制人拓?fù)洚悩?gòu)酶I，可用于開發(fā)酶抑制劑藥 物，并且原料可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，不受資源限制，因此應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的化合物的制備
(1) 真菌尸em'c/〃/ww sp. 386的菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖1.0%(重量百 分比，下同)、酵母膏0.1%、蛋白胨0.2%、瓊脂1.0%、氯化鈉0.3%,其余為水， 使用時(shí)制成試管斜面，真菌菌株在30t下培養(yǎng)5天。
所述的菌種培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1%-5.0% (重量百分比，下同)、酵母膏 0.01%-1%、蛋白胨0.01%-1%、瓊脂0.1%-3.0%、氯化鈉0.05%-5%，其余為水。
(2) 真菌Pem'c〃m^ sp. 386的發(fā)酵培養(yǎng)所用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖1.0% (重 量百分比，下同)、酵母膏0.1%、蛋白胨0.2%、氯化鈉0.3%，其余為水，真菌 菌株于28'C培養(yǎng)30天。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1%-5.0% (重量百分比，下同)、酵母膏 0.01%-1%、蛋白胨0.01%-1%、氯化鈉0.05%-5%，其余為水。
(3) 化合物penicillazine的分離提取
將所得發(fā)酵液過濾，除去菌體；加熱濃縮后，用乙酸乙酯萃取5次，將所 得萃取液濃縮后，進(jìn)行層析分離，洗脫液濃縮得無色結(jié)晶，即為penicillazine。
(4) Penicillazine 1的制備
稱取上述干燥后的Penicillazine (0.1 mol)溶解在冰醋酸中，冰浴條件下，在充分?jǐn)嚢柘聦?0.2 mol)逐滴滴加到反應(yīng)溶液中，反應(yīng)1小時(shí)后，向反應(yīng) 物中加入蒸餾水(200 mL)來終止反應(yīng)，用乙酸乙酯(500 mL)進(jìn)行萃取，將 萃取液濃縮后，進(jìn)行柱層析，用乙酸乙酯洗脫，洗脫液濃縮，重結(jié)晶后得到化 合物Penicillazine 1 。
(5) Penicillazine 2的制備
稱取干燥后的上述Penicillazine (0.1 mol)溶解在干燥的丙酮(50 mL)中， 然后向其中加入新制的固體二氧化錳U00g)作為氧化劑，室溫條件攪拌反應(yīng) 24小時(shí)后，用TLC檢測(cè)，原料消耗完全后，將反應(yīng)液過濾，濾出的固體氧化劑 用丙酮充分洗滌，將過濾液與洗滌液合并，減壓濃縮后，進(jìn)行柱層析，用乙酸 乙酯與石油醚兩者體積比為0.5的洗脫液進(jìn)行洗脫，將洗脫液濃縮后，重結(jié)晶得 至U化合物Penicillazine 2。
(6) Penicillazines 3和4的制備
將干燥的Penicillazine 2 (0.05 mol)溶解在干燥的丙酮(25mL)中，加入 干燥的吡啶(5mL)，室溫下將醋酸酐(0.15 mol)逐漸滴加到反應(yīng)溶液中，反 應(yīng)物在室溫條件下攪拌12小時(shí)后，用TLC檢測(cè)原料消耗完全后，向反應(yīng)物中加 入蒸餾水終止反應(yīng)，用氯仿進(jìn)行萃取，萃取液濃縮后，用制備薄層層析分離， 用乙酸乙酯與石油醚兩者體積比為0.3的展開劑展開，分別得到化合物 Penicillazines 3禾卩4。 所得化合物的波譜數(shù)據(jù)
Penicillazine 1:'H NMR (300MHz, CDC13): S 9.43 (NH), 8.92 (1H, s, C誦4)， 7.16 (1H, s， C-6')， 4.87 (1H， dd, J=2.4， 11.4Hz)， 4.76 (1H， d, J=2.1Hz)， 4.72 (1H, s， -OH), 4.68 (1H, m), 4.50 (1H, m), 4.09 (1H， m), 3.98 (3H， s, -OCH3)， 3.95 (3H, s, -OCH3), 3.78-3.89 (2H， m， C隱6'， C-7')， 3.18 (1H, d， J=19.5Hz, C-4'), 2.52 (1H， d, J=19.5Hz， C國(guó)4'). FAB MS: [M+H]+ 669:671:673:675=1:3:3:1.
Penicillazine 2: & NMR (300MHz， acetone-d6): 3 9.35 (NH)， 8.57 (1H， C-4)，7.42 (1H, d， J=8.7Hz，C-5), 7.13 (1H, d， J=8.7Hz, C隱6), 6.96 (1H, dd， J=2.4, 10.5Hz, C-6')， 6.10 (1H， dd, J=2.4, 10.5Hz， C-7'), 5.40 (1H， d， J=6Hz， 8'-OH), 5.09 (1H, s, IO'陽OH)， 4.71 (1H, m, C-8'), 4.39 (1H， dd， J=2.1， 8.4Hz, C-9'), 3.96 (3H, -OCH3), 3.91 (3H, -OCH3), 2.65 (1H, dd, J=2.1， 18.9Hz， C-4')， 2.52 (1H, d， J=18.9Hz， C-4'). 13C畫R (75MHz, acetone-d6): <5 197.9 (C-5'), 160.3 (C-2), 157.7 (C-ll')， 153.9 (C-7)， 151.7 (C-7')， 149.2 (C-3'), 143.6 (C-9)， 135.3 (C-8), 120.1 (C-3), 124.2 (C-4)， 122.9 (C-5), 120.7 (C-3), 113,6 (C-IO)， 110.2 (C-6)， 83.4 (C-9'), 68.2 (C-10'), 65.9 (C國(guó)8')， 60.8 (C陽12)， 56.4 (C-ll)， 25.3 (C-4'). FAB MS: 430網(wǎng)+.
Penicillazine 3: & NMR (300MHz， acetone-d6): <5 9.35(NH)， 8.57(1H， s, C-4), 7.40(1H, d， J=8.7Hz, C-5)， 7.10(1H, d， J=8.7Hz， C-6)， 6.87(1H, dd， J=2.1， 10.5Hz， C-7')， 6.23(1H， dd， J=2.4, 10.5Hz, C-6'), 5.82(1H, ddd， J=2.1， 4.5, 8.7Hz， C-8'), 5.25(1H, s， IO'-OH)， 4.62(1H， dd, J=1.2， 8.7Hz, C-9'), 3.96(3H, s, -OCH3)， 3.90(3H, s, -OCH3), 2.71(1H， C-4')， 2.16(1H， C-4'). LC MS: 472.8[M+H]+, 495.1[M+Na]+.
Penicillazine 4: 力麗R (300MHz, CDC13): 3 9.41(NH), 8.60(1H, C-4)， 7.23(1H, d， J=8.7Hz， C-5), 6.91(1H， d， J=8.7Hz， C-6)， 6.68(1H， d， J=10.5Hz， C-7')， 6.24(1H， d, J=10.5Hz， C-6'), 5.66(1H， d， J=9.3Hz， C-8')， 5.42(1H， d, J=9.3Hz， C-9'), 4.00(3H， s, -OCH3)， 3.96(3H， s, -OCH3)， 2.99(1H, d， J=18.5Hz, C-4'), 2.22(3H， s, -CO-CH3), 2.14(3H， s， -CO-CH3). 13C NMR(75MHz， CDC13): 5 190.05(C-5')， 169.8(-CO-CH3)， 169.3(-CO-CH3), 159.7(C-2), 157.8(C-11')， 154.3， 147.8， 144.2， 144.1， 136.2， 127.7， 124.7， 122.5， 120.9， U3.9(C國(guó)10)， 109.5(C-6)， 75.4(C-10'), 73.3(C-9'), 67.4(C-8')， 61.6(-OCH3), 56.5(-OCH3), 24.14(C陽4')， 20.78(2CO-CH3). LC MS: 537.01 [M+Na]+, 1050.69 [2M+Na]+.
制得的化合物結(jié)構(gòu)式為式中 R為溴離子、R2為
或R為氫離子、R2為
本發(fā)明的化合物對(duì)人拓?fù)洚悩?gòu)酶I (hTopoI)的活性試驗(yàn)
(1) 所用藥品
hT(3po I儲(chǔ)藏緩沖液由濃度為50mM的HCI水溶液(pH7.5)、 50 mM的 KC1水溶液、0.05 mM的EDTA水溶液和5 mM的二硫蘇糖醇(DTT)水溶液所 組成。
hTopoI反應(yīng)緩沖液由濃度為175mM的HC1水溶液(pH7.5)、 250 mM 的KC1水溶液、25 mM的MgCl2水溶液、5 mM的DTT水溶液、10 mM的亞 精胺水溶液、0.5 mM的EDTA水溶液和250 ng/mL的牛血清白蛋白(BSA)水 溶液所組成。
hTopoI反應(yīng)終止液由濃度為3% (重量百分比，下同)十二烷基硫酸鈉 (SDS)、 60 mM的EDTA水溶液、50%甘油水溶液和0.25%溴酚蘭水溶液所組 成。
(2) 本發(fā)明的化合物對(duì)hTopo I的抑制性實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)時(shí)，向4 上述反應(yīng)緩沖液加入0.5 pg負(fù)超螺旋(pBR322)及1U的 hTopoI，加入本發(fā)明的化合物濃度為4 mg/mL的水溶液。同時(shí)做空白對(duì)照、陰 性對(duì)照和陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，加入4 pL上述反應(yīng)緩沖液、0.5 pg負(fù)超螺旋；陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，加入4 nL上述反應(yīng)緩沖液、0.5 ng負(fù)超螺旋、1U的 hTopo I;陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，加入4 ^L上述反應(yīng)緩沖液、0.5 ng負(fù)超螺旋、1U 的hTopo I以及0.5 2 mM的喜樹堿水溶液。37 'C下于水浴中恒溫反應(yīng)30 min， 加入4 hTopo I上述反應(yīng)終止液。使用1%瓊脂糖，在TBE中用約80 V/cm電 壓于室溫下電泳35 min。電泳完畢，用0.5%的溴化乙錠(EB)染色30 min，再用 去離子水漂洗，用Fluor-Smultimager凝膠成像系統(tǒng)分析測(cè)試結(jié)果。
將對(duì)hTopo I有抑制效果的本發(fā)明化合物，配制成其終濃度梯度為100 pg/mL、 50 pg/mL、 25 pg/mL、 12.5 pg/mL、 6.25 pg/mL，再重復(fù)上述步驟，測(cè) 量出最小的抑制濃度值。
(3)本發(fā)明的化合物對(duì)人拓?fù)洚悩?gòu)酶hTopo I的抑制活性
本發(fā)明的化合物均具有抑制人拓?fù)洚悩?gòu)酶hTopo I的活性，其中， Penicillazine l活性最強(qiáng)，最小抑制濃度為8.0 pM，如下表所示。
表l本發(fā)明的化合物對(duì)人拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制活性
化合物最小抑制濃度 (岸)
Penicillazine 18.0
Penicillazine 218.6
Penicillazine 384.7
Penicillazine 4155.6
本發(fā)明的生物堿化合物對(duì)人拓?fù)洚悩?gòu)酶I有抑制活性，可將其制成人拓?fù)洚?構(gòu)酶I的抑制劑藥物，制成片劑、膠囊等均可。
權(quán)利要求
1.一種生物堿化合物，其特征在于結(jié)構(gòu)式為
2. 權(quán)利要求1所述的生物堿化合物的制備方法，其特征在于先在培養(yǎng)基中對(duì)海洋真菌 進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將所得發(fā)酵液過濾，除 去菌體，將濾液加熱濃縮，用乙酸乙酯萃??；萃取液濃縮后進(jìn)行色譜分離，將所得洗 脫液濃縮，得無色結(jié)晶，即為penicillazine;在溶有Penicillazine的溶液中，加入溴或 二氧化錳，反應(yīng)后分別得到Penicillazines 1和2;或者在溶有Penicillazine 2的溶液中， 加入醋酸酐，反應(yīng)后得到Penicillazines 3和4。
3. 權(quán)利要求1所述的生物堿化合物在制備酶抑制劑藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種生物堿化合物及其制備方法與作為酶抑制劑的應(yīng)用，制備時(shí)先在培養(yǎng)基中對(duì)海洋真菌進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將所得發(fā)酵液過濾除去菌體，將濾液加熱濃縮，用乙酸乙酯萃?。贿M(jìn)行色譜分離，將所得洗脫液濃縮后，得到penicillazine；在溶有Penicillazine的溶液中，加入溴或二氧化錳，反應(yīng)后分別得到Penicillazines 1和2；或者在溶有Penicillazine 2的溶液中，加入醋酸酐，反應(yīng)后得到Penicillazines 3和4。本發(fā)明來源于海洋真菌的生物堿衍生物能有效地抑制人拓?fù)洚悩?gòu)酶I，可用于開發(fā)酶抑制劑藥物，并且原料可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/80GK101307049SQ200810138540
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者佘志剛, 林永成, 王長(zhǎng)云, 邵長(zhǎng)倫 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)