專利名稱：一種酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)d-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種D-乳酸的制備方法，尤其涉及一種利用微生物產(chǎn)生的NAD (煙酰 胺腺嘌呤雙核苷酸)非依賴性L-乳酸脫氫酶拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法。
技術(shù)背景乳酸在化工、制藥等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途。乳酸分為L-乳酸，D-乳 酸以及外消旋乳酸(DL-乳酸)。由乳酸單體聚合合成生物可降解性高聚物聚乳酸是當(dāng)今 生態(tài)塑料研究的熱點《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 74， 524 - 534. Fermentative production of lactic acid from biomass: an overview on process developments and future perspectives.》。由于L-聚乳酸與D-聚乳酸摻合可以大大 改善聚乳酸的耐熱性問題，使得D-乳酸生產(chǎn)的研究受到廣泛的關(guān)注《Macromo1. Biosci. 2005, 5, 569 - 597. Poly (lactide) stereocomplexes: formation, structure, properties, degradation, and applications.》。D-乳酸的生產(chǎn)主要依靠發(fā)酵法進(jìn)行，乳酸菌在該領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，然而乳酸菌對 培養(yǎng)基成分的要求比較苛刻。基因工程手段同樣應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究，基因工程菌的乳 酸產(chǎn)量及生產(chǎn)效率均低于乳酸菌。高效D-乳酸生產(chǎn)菌株的難于獲得，制約了D-乳酸的 發(fā)酵法生產(chǎn)《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008， 78， 449 - 454. Production of D-lactic acid by Cory/ze^ac^ri〃/z ^Z〃te/ ic譜under oxygen deprivation.》。生物催化法同樣有報道應(yīng)用于D-乳酸的生產(chǎn)。粟武，魏東芝等在《Tetrahedron: Asymmetry 2004， 15， 1275 - 1277. Enantioselective oxidation of racemic 1， 2_propanediol to D-(-)-lactic acid by C7t/co/7oZ) 3cter oxjokas.》 一文中，以氧 化葡萄糖酸桿菌為催化劑，立體選擇性催化外消旋2， 3-丙二醇，得到對映體過量值大 于99X的D-乳酸，底物轉(zhuǎn)化率48% (接近理論轉(zhuǎn)化率)。在底物外消旋2， 3-丙二醇高 于20克/升的條件下需要通過調(diào)節(jié)pH等手段保證產(chǎn)物D-乳酸的高對映體過量值。Kenji Soda等在《J Mol. Catal. B-Enzym. 2001， 11， 149 - 153. One-pot chemo-enzymatic enantiomerization of racemates.》 一文中，報道了酶法-化學(xué)法相耦聯(lián)，以DL-乳酸 為底物，L-乳酸氧化酶作為催化劑，硼氫化鈉為還原劑，催化DL-乳酸生成D-乳酸的工 藝。上述反應(yīng)所用底物DL-乳酸的濃度僅為5毫摩爾/升，并且過程產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化 氫。由于乳酸的工業(yè)化應(yīng)用對乳酸光學(xué)純度的要求，外消旋乳酸的應(yīng)用受到很大限制， 因此造成外消旋乳酸的價格遠(yuǎn)低于L-乳酸，D-乳酸的價格。如果立體選擇性催化外消 旋乳酸中的L-乳酸生成丙酮酸，針對性保留D-乳酸，即可以通過催化過程以外消旋乳 酸為底物生成D-乳酸以及另外一種重要的化工中間體-丙酮酸，這在技術(shù)上是可行的， 生產(chǎn)上是極為經(jīng)濟(jì)的。經(jīng)檢索利用微生物的NAD非依賴性乳酸脫氫酶(iLDH)拆分外消旋乳酸制備D-乳酸 的方法目前還未見報道。 發(fā)明內(nèi)容針對外消旋乳酸應(yīng)用的限制以及現(xiàn)有D-乳酸生產(chǎn)方法的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶的生物催化劑拆分外消旋乳酸制備 D-乳酸的方法。該方法具有底物利用率高(同時生產(chǎn)兩種工業(yè)合成中間體)、產(chǎn)物純度 高、后提取簡便等特點。本發(fā)明的技術(shù)方案是基于申請人的前期研究，見《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007， 77, 91 _98. Membrane-bound L- and D-lactate dehydrogenase activities of a newly isolated psewt/cw/cwss sfuz^er/ strain.》——文，申i青人手艮道了施氏假單胞 菌SDM中含有D型和L型兩種NAD非依賴性乳酸脫氫酶，能分別立體選擇性催化L-乳 酸、D-乳酸生成丙酮酸，其中NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶具有較高的溫度穩(wěn)定性。本 發(fā)明在這一基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)施氏假單胞菌得到的生物催化劑——NAD非依賴性乳酸脫 氫酶，以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，再立體選擇性催化外消旋 乳酸生成D-乳酸和丙酮酸，反應(yīng)式如下外消旋乳酸 D-乳酸 丙酮酸本發(fā)明的酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，步驟如下(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液或粗酶液的制備選取施氏假單胞 菌(Pw/ob/wmss st〃teeri) S麗CCTCC No.M206010 (申請人已于2006年1月15日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC))，常規(guī)培養(yǎng)并發(fā)酵至NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶 活達(dá)到200 250單位/升時，終止發(fā)酵培養(yǎng)；分離并收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2 4次，再將菌體重懸于pH7. 2 7. 5、 67±3毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體濃度 達(dá)到5 60克干細(xì)胞/升，得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液；或者用超聲 波破碎完整細(xì)胞得含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液或粗酶液置于45 65'C水浴中處理5 60分鐘，得 到僅含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100 700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1 15克干細(xì)胞 /升；然后在25 40。C， pH值6.0 8. 0條件下，160 200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩10 20小時， 進(jìn)行生物催化劑對外消旋乳酸的拆分，最終得到含有乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以5，000 10,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速， 離心5 10分鐘，去除沉淀，上清液屮含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5 3倍柱體積/小時的流速上樣1 3倍柱體積; 去離子水以0. 5 3倍柱體積/小時的流速淋洗1 3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗 脫液；然后0. 5 2. 5摩爾/升鹽酸以0. 5 3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1 3倍柱 體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；OH OHjj i^'et/(io;no,ras rf 'zeh SDM =gNAD非依賴性L-乳酸脫氫酶 8、 -^ 'C、 +H3C'、COOH H3CT 、COOH:noco/\c3:n(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 075 0. 095兆帕，溫度45 7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產(chǎn)品。利用高效液相(HPLC)測定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的對映體過量值， D-乳酸和丙酮酸的成品的含量測定采用Agilent1100色譜系統(tǒng)，色譜柱為反向C18柱 (150X4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美國Agilent公司)，分析條件 為以l毫摩爾/升硫酸甲醇(體積比為96: 4)為流動相，柱溫25'C，流速為i毫升/ 分鐘，進(jìn)樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。D-乳酸對映體過量值測定采用 AgilentllOO色譜系統(tǒng)，色譜柱為手性柱(50X4. 6毫米，MCIGEL CRS10W， R本三菱化 學(xué))，以2毫摩爾/升硫酸銅水溶液作為流動相，柱溫25'C，流速為0.5毫升/分鐘， 進(jìn)樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。待測樣品用兩倍體積的高氯酸(5%)酸 化，4'C靜置2小時后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，離心上清用0. 45微米的水相濾膜 過濾，然后HPLC分析樣品。上述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法中步驟(1)所述菌體的濃度優(yōu)選為35 60克干細(xì)胞/升。步驟(2)所述完整細(xì)胞懸液或者粗酶液熱處理溫度優(yōu)選為50 6(TC。步驟(2)所述完整細(xì)胞懸液或者粗酶液熱處理時間優(yōu)選為5 30分鐘。步驟(3)所述DL-乳酸鈉的濃度優(yōu)選為300 600毫摩爾/升。步驟(3)所述生物催化劑濃度優(yōu)選為6 12克干細(xì)胞/升。步驟(3)所述溫度優(yōu)選為30 37°C，所述pH值優(yōu)選為6.5 7.5，所述振蕩轉(zhuǎn)速 優(yōu)選為180轉(zhuǎn)Z分鐘。步驟(4)所述離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8， 000 10， 000轉(zhuǎn)/分，離心時間優(yōu)選為7~10分鐘。 步驟(5)所述上樣流速優(yōu)選為1 2倍柱體積/小時，上樣體積優(yōu)選為1.5 2.5倍柱體積，去離子水淋洗流速優(yōu)選為1 2倍柱體積/小時，去離子水淋洗體積優(yōu)選為1.5 2.5倍柱體積，鹽酸濃度優(yōu)選為1 2摩爾/升，鹽酸逆流洗脫流速優(yōu)選為1 2倍柱體積/小時，鹽酸逆流洗脫體積優(yōu)選為1. 5 2. 5倍柱體積。步驟(6)所述真空度優(yōu)選為0.08 0.09兆帕，溫度優(yōu)選為55 65°C。 在上述方法中，酶活的單位(U)定義為37°C，每分鐘催化底物乳酸轉(zhuǎn)化生成1微摩爾丙酮酸的酶量為一個酶活單位(U)。本發(fā)明是一種利用熱變性使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，獲得僅NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶有活力的生物催化劑，使外消旋乳酸中的L-乳酸被選擇性的轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而制備D-乳酸的方法。 本發(fā)明具有以下特點(1) 菌株要求的培養(yǎng)基簡單、生長周期短，成本低。(2) 能拆分價格低的外消旋乳酸，生產(chǎn)D-乳酸，底物成本低。(3) 可作用的底物濃度高。(4) 拆分所得另外一種產(chǎn)物丙酮酸同樣具很高經(jīng)濟(jì)價值。(5) 底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物穩(wěn)定。(6) 生物催化劑可以用過濾法或離心法去除，后續(xù)分離提取費(fèi)用低廉。(7) 兩種產(chǎn)物可以簡單分離，高純度產(chǎn)物容易得到。(8) 產(chǎn)物D-乳酸對映體過量值高(高于99.5%)。
具體實施方式
實施例l:利用尸.s""er2'S簡粗酶液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(/^m/OT/朋3Sst"teeri) S函CCTCC No. M206010菌株(該菌株申請人已于2006年1月15日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心)接種于含有L 5%的瓊脂糖并加有0. 5XDL-乳酸鈉的固體斜面基 本培養(yǎng)基上，30'C培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50 毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，30'C條件下，在搖床上180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩 培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1WDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中， 30'C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到250單位/升時，終 止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5,000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 體重懸于pH7.4、 67毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到45克干細(xì)胞/升， 用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于55"C水浴中處理10分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳 酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為500毫摩爾/升，生物催化劑濃度為9克干細(xì)胞/升；然后 在3(TC， pH 7. 0條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩10小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以8,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以1.5倍柱體積/小時的流速上樣2倍柱體積，去離子 水以1. 5倍柱體積/小時的流速淋洗2倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后1. 5 摩爾/升鹽酸以1. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫2倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 085兆帕，溫度60°C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產(chǎn)品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為90. 3% (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99. 8 %，丙酮酸濃度為89.8% (質(zhì)量體積比)。實施例2:利用尸."y^eri SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(A'ew/鵬o朋s "wteer。 SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l(wèi). 5%的瓊脂糖并加有O. 5XDL-乳酸 鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種環(huán)接l 2環(huán)于50毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，30'C條件下，在搖床上 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有l(wèi)XDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到220單位/升時，終 止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5,000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌 體重懸于pH7.2、 64毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到5克干細(xì)胞/升， 用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于45'C水浴中處理60分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳 酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物屮DL-乳酸鈉的濃度為100毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1克干細(xì)胞/升；然后 在25°C， pH 6. 0條件下，160轉(zhuǎn)/分鐘振蕩15小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以10,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心5 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以3倍柱體積/小時的流速上樣1倍柱體積，去離子水 以3倍柱體積/小時的流速淋洗l倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5摩 爾/升鹽酸以3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 075兆帕，溫度7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產(chǎn)品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89. 5% (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99. 6 %，丙酮酸濃度為89.4% (質(zhì)量體積比)。實施例3:利用/3. 5"teen' SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(尸seyflb歷朋as 5twteeri) SDM CCTCC Ko. M206010菌株接種于含有l(wèi). 5%的瓊脂糖并加有0. 5%DL-乳酸 鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種 環(huán)接1 2環(huán)于50毫升含有0.5% DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，3(TC條件下，在搖床 上180轉(zhuǎn)Z分鐘振蕩培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有l(wèi)^DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到200單位/升時，終 止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5，000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌4次；再將菌 體重懸于pH7.5、 70亳摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到60克千細(xì)胞/升， 用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于65'C水浴中處理5分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳酸 脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為15克干細(xì)胞/升；然 后在40'C， pH 8.0條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩20小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸 的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以5,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5倍柱體積/小時的流速上樣3倍柱體積，去離子 水以0. 5倍柱體積/小時的流速淋洗3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后2. 5 摩爾/升鹽酸以0. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 095兆帕，溫度45'C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產(chǎn)品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為88. 7% (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99. 7 %，丙酮酸濃度為89.7% (質(zhì)量體積比)。實施例4:利用尸.sto&eri SDM完整細(xì)胞懸液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (尸se"oWo朋s st"&eW) SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l(wèi). 5%的瓊脂糖并加有0.5XDL-乳酸鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無 菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升含有0.5^DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1% DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基 中，3(TC條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到250單位/升時， 終止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5，000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 體重懸于pH7.4、 67毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到45克干細(xì)胞/升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液置于65'C水浴中處理5分鐘，得到僅含NAD非依賴性 L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為15克干細(xì)胞/升；然 后在4(TC， pH 8. 0條件下，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩20小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸 的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以5,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5倍柱體積/小時的流速上樣3倍柱體積，去離子 水以0. 5倍柱體積/小時的流速淋洗3倍柱體積，收集得到含!3-乳酸的洗脫液;然后2. 5 摩爾/升鹽酸以0. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度0.095兆帕，溫度45'C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產(chǎn)品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為88.7X (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99.7%，丙 酮酸濃度為89.7% (質(zhì)量體積比)。實施例5:利用尸.s&teeri SDM完整細(xì)胞懸液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (/^eyob舶"as "i/f犯rj') SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l(wèi). 5%的瓊脂糖并加有0.5MDL-乳酸鈉的固體斜而基本培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無 菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1XDL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中， 30。C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到200單位/升時，終 止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5，000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 休重懸于pH7.5、 70毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到60克干細(xì)胞Z升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液置于55'C水浴中處理10分鐘，得到僅含NAD非依賴 性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將歩驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為500毫摩爾/升，生物催化劑濃度為9克干細(xì)胞/升；然后 在30'C， pH 7. 0條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩10小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以8,000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AtnberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以1.5倍柱體積/小時的流速上樣2倍柱體積，去離子 水以1. 5倍柱體積/小時的流速淋洗2倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后1. 5 摩爾/升鹽酸以1. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫2倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度O. 085兆帕，溫度6(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產(chǎn)品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89.9W (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99.7。/^，丙 酮酸濃度為89.6% (質(zhì)量體積比)。實施例6:利用尸.W"teeri SDM完整細(xì)胞懸液拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (/^e"obfflo/7as sto^eri) SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l(wèi). 5%的瓊脂糖并加有0.5XDL-乳酸鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)20小時。將上述培養(yǎng)的菌株，無 菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50毫升含有0.5^DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有l(wèi)^DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達(dá)到220單位/升時，終 止發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液5，000轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌 體重懸于pH7.2、 64毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達(dá)到5克干細(xì)胞/升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液置于45'C水浴中處理60分鐘，得到僅含NAD非依賴 性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4tM諸存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1克干細(xì)胞/升；然后 在25。C， pH6.0條件下，160轉(zhuǎn)/分鐘振蕩15小時，實現(xiàn)生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4) 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以10， 000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，離心5 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以3倍柱體積/小時的流速上樣l倍柱體積，去離子水 以3倍柱體積/小時的流速淋洗l倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5摩 爾/升鹽酸以3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度O. 075兆帕，溫度7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產(chǎn)品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89.6% (質(zhì)量體積比)，對映體過量值為99.7%，丙 酮酸濃度為89.2% (質(zhì)量體積比)。上述實施例中，固體斜面基本培養(yǎng)基配方(克/升)如下KH2P04 1， K2HP04'3H20 0.8， NH4C1 1， MgS04'7H20 0.5， CaCl2*2H20 0 . 05，金屬離 子混合液1.2毫升/升。調(diào)節(jié)pH 7.0， 115 'C條件下滅菌20分鐘，瓊脂粉15。 液體基本培養(yǎng)基配方(克/升)如下KH2P04 1， K2HP04'3H20 0.8， NH4C1 1， MgS04'7H20 0.5， CaCl2*2H20 0.05，金屬離 子混合液1.2毫升/升。調(diào)節(jié)pH 7.0， 115 'C條件下滅菌20分鐘。 金屬離子混合液的配方如下(克/升)Na2EDTA， 50; ZnS04 7H20， 20; MnCl2 4H20， 5; (NH4)6Mo7024 4H20， 1， ； FeS04 7H20，5; CuS04*5H20， 1.5; CoCl2*H20， 1.6; CaCl2 2H20， 5.5。上述實施例中，高效液相(HPLC)測定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的對 映體過量值的實施條件是D-乳酸和丙酮酸的成品的含量測定采用Agilent1100色譜系統(tǒng)，色譜柱為反向C18 柱(150X4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美國Agilent公司)，分析條 件為以l毫摩爾/升硫酸甲醇(體積比為96: 4)為流動相，柱溫25'C,流速為l毫 升/分鐘，進(jìn)樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。D-乳酸對映體過量值測定采用AgilentllOO色譜系統(tǒng)，色譜柱為手性柱(50X4.6 毫米，MCIGELCRS10W，日本三菱化學(xué))，以2毫摩爾/升硫酸銅水溶液作為流動相，柱 溫25'C，流速為0.5毫升/分鐘，進(jìn)樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。待測樣 品用兩倍體積的高氯酸(5%)酸化，4'C靜置2小時后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘， 離心上清用0. 45微米的水相濾膜過濾，然后HPLC分析樣品。
權(quán)利要求
1.一種酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，步驟如下(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液或粗酶液的制備選取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010，常規(guī)培養(yǎng)并發(fā)酵至NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活達(dá)到200～250單位/升時，終止發(fā)酵培養(yǎng)；分離并收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2～4次，再將菌體重懸于pH7.2～7.5、67±3毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體濃度達(dá)到5～60克干細(xì)胞/升，得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液；或者用超聲波破碎完整細(xì)胞得含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液；(2)以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液或粗酶液置于45～65℃水浴中處理5～60分鐘，得到僅含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4℃儲存，備用；(3)對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100～700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1～15克干細(xì)胞/升；然后在25～40℃，pH值6.0～8.0條件下，160～200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩10～20小時，進(jìn)行生物催化劑對外消旋乳酸的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉(zhuǎn)化液；(4)轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將步驟(3)反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液以5,000～10,000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心5～10分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5)D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA 45裝柱，處理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5～3倍柱體積/小時的流速上樣1～3倍柱體積；去離子水以0.5～3倍柱體積/小時的流速淋洗1～3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5～2.5摩爾/升鹽酸以0.5～3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1～3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6)D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫液分別在真空度0.075～0.095兆帕，溫度45～70℃的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產(chǎn)品。
2. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(l) 所述菌體的濃度為35 60克干細(xì)胞/升。
3. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(2) 所述完整細(xì)胞懸液或者粗酶液熱處理溫度為50 60°C。
4. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(2) 所述完整細(xì)胞懸液或者粗酶液熱處理時間為5 30分鐘。
5. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述DL-乳酸鈉的濃度為300 600毫摩爾/升。
6. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述生物催化劑濃度為6 12克干細(xì)胞/升。
7. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述溫度為30 37°C，所述pH為6.5 7.5，所述振蕩轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘。
8. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(4) 所述離心轉(zhuǎn)速為8, 000 10， 000轉(zhuǎn)/分，離心時間為7 10分鐘。
9. 如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(5)所述上樣流速為1 2倍柱體積/小時，上樣體積為1. 5 2. 5倍柱體積，去離子水淋洗 流速為1 2倍柱體積/小時，去離子水淋洗體積為1. 5 2. 5倍柱體積，鹽酸濃度為l 2摩爾/升，鹽酸逆流洗脫流速為1 2倍柱體積/小時，鹽酸逆流洗脫體積為1. 5 2. 5 倍柱體積。
10.如權(quán)利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，步驟 (6)所述真空度為0.08 0.09兆帕，溫度為55 65。C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶法拆分外消旋乳酸生產(chǎn)D-乳酸的方法，包括(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細(xì)胞懸液或粗酶液的制備，(2)以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，(3)對外消旋乳酸拆分，(4)轉(zhuǎn)化液預(yù)處理，(5)D-乳酸和丙酮酸的分離，(6)D-乳酸和丙酮酸的精制等步驟。本發(fā)明具有培養(yǎng)基簡單、生長周期短，成本低，后續(xù)分離提取費(fèi)用低廉，可耐底物濃度高，產(chǎn)物D-乳酸對映體過量值高等特點，為價格低的外消旋乳酸的開發(fā)應(yīng)用和D-乳酸的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12P7/40GK101333554SQ20081013877
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者平 許, 邱建華, 馬翠卿, 超 高 申請人:山東大學(xué)