專利名稱：利用重組大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚β羥基丁酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用重組大腸桿菌聯(lián) 產(chǎn)琥珀酸和聚(3羥基丁酸酯(PHB)的方法。
背景技術(shù)：
琥珀酸,學(xué)名丁二酸，是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的四碳二羧酸，作為前體被廣泛用 于合成藥品及生物可降解性聚合物。由于環(huán)境問(wèn)題，許多研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向于微生物發(fā)酵來(lái) 生產(chǎn)琥珀酸。以可再生資源為原料的琥珀酸發(fā)酵法將逐步取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，通過(guò) 代謝工程提高微生物琥珀酸的產(chǎn)量、降低琥珀酸發(fā)酵成本具有巨大的應(yīng)用潛力。同時(shí)也 存在著挑戰(zhàn)，即構(gòu)建以多種可再生碳源為底物的、易培養(yǎng)的、高轉(zhuǎn)化效率、高產(chǎn)量的琥 珀酸發(fā)酵菌株。目前，研究較多地菌株主要有產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌04朋m^/cw;7/n7/"m ■racc/mjwoc/wcera), 產(chǎn)琥珀酸方文線桿菌(^4c"'"o6(3c飾s racc細(xì)ge"e力禾口大腸桿菌 (Z :/zen'c/n'a co//)等菌禾中。
大腸桿菌作為生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)物的宿主由于其遺傳背景清楚、易操作、生長(zhǎng)速率快、易 培養(yǎng)及可利用多種碳源，而受到越來(lái)越多的重視。正是基于這些原因，大腸桿菌被認(rèn)為 是最有潛力生產(chǎn)琥珀酸的宿主。許多代謝工程策略己經(jīng)用于提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn) 量?；蚬こ膛c發(fā)酵工藝的結(jié)合使得大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵琥珀酸成為可能。與A wcc,'m'dpro^ce似等其它微生物相比，大腸桿菌具有明顯的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)代謝工程的方法 在大腸桿菌中生產(chǎn)琥珀酸已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。利用大腸桿菌好氧發(fā)酵琥珀酸的產(chǎn)量達(dá)到60 g/L以 上。但是琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中，大量的菌體離心后扔掉，得不到利用。
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates， PHAs)是細(xì)菌體內(nèi)一種酯類的累積物，主 要被用來(lái)作為碳源和能源的儲(chǔ)備物。聚P羥基丁酸酯(PHB)是PHA的典型代表，它 是一類新型的天然高分子材料，已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)保、醫(yī)藥領(lǐng)域。PHB有良好的生物降解性, 其分解產(chǎn)物可全部為生物利用，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染，其熔融溫度為175 18(TC,是一種 可完全分解的熱塑性塑料，由于良好的生物降解性、生物相容性、壓電效應(yīng)、光學(xué)活性 等特點(diǎn)，PHB必將在環(huán)保、醫(yī)藥、光學(xué)材料領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。
自然界中積累PHB的菌株主要有真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌04/^//^""^"0/^1 )、巨大芽孢桿 菌(5ctc/〃jw附ega^ehw附)、自養(yǎng)黃桿菌(XaW/w5a"er awfofrap/z/ct^)。其中真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌 已被用于商業(yè)生產(chǎn)PHB。然而PHB自然產(chǎn)生菌存在諸多的不利條件，如PHB顆粒不易 提取，發(fā)酵周期長(zhǎng)等。
大腸桿菌(￡.CO 作為一種模式生物，同時(shí)由于其諸多的優(yōu)點(diǎn)如易培養(yǎng)、碳源 利用范圍廣、生長(zhǎng)速率快、易破碎、背景清楚等因而受到越來(lái)越多的研究。大腸桿菌本 身不存在PHB合成途徑，但通過(guò)基因工程可以將PHB合成途徑構(gòu)建在大腸桿菌內(nèi)。為 了降低成本，科學(xué)家們?cè)诟淖兗?xì)菌遺傳結(jié)構(gòu)上下了許多工夫,制造了新型聚合物，提高了 產(chǎn)量，成本也明顯降低。1987年,吉利亞James Madison大學(xué)的Dennis成功地從真養(yǎng)產(chǎn) 堿桿菌中克隆到合成PHB的基因，并轉(zhuǎn)入五.""中，該菌株可以直接利用各種碳源，
如葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等廉價(jià)底物，進(jìn)一步降低了成本。目前，PHB在大腸桿菌 中的產(chǎn)量已經(jīng)占到菌體干重的85%以上。但是，工業(yè)化生產(chǎn)PHB的成本仍然很高。
利用基因工程改造大腸桿菌，可突破傳統(tǒng)的發(fā)酵模式。實(shí)現(xiàn)對(duì)PHB和琥珀酸的發(fā) 酵聯(lián)產(chǎn)，具有重要的實(shí)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前PHB發(fā)酵和琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)中的缺陷，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種 利用重組大腸桿菌菌株高效聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚P羥基丁酸酯(PHB)的方法。
本發(fā)明選擇大腸桿菌作為基因工程改造的對(duì)象菌株，所用大腸桿菌菌株為MG1655、 JM109、 DH5a、 W3110或Xll-blue中的一株。其中MG1655、 JM109和W3110來(lái)源于 ATCC(美國(guó)典型菌種保藏中心)；DH5a與Xll-blue來(lái)源于DSMZ(德國(guó)微生物保藏中心)。
真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(^^^/^股5 ew/ra戶/uw)購(gòu)買于CICC(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。 月巴大產(chǎn)堿桿菌04/^//^"^ /a^y)、 自養(yǎng)黃桿菌(la"^zo6a"er flwto rap/n-c"力、巨大芽孢桿 菌(^a"'〃M wegflfer/ww )和惡臭假單胞菌CPwwfifow朋a;y ; W必)購(gòu)買于ATCC(美國(guó)典型菌 種保藏中心)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用基因工程改造大腸桿菌，在同一菌株內(nèi)構(gòu)建琥珀酸合成
代謝途徑和PHB合成代謝途徑。
琥珀酸是三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物之一。以代謝流分析，本發(fā)明采用大腸桿菌碳源代謝
途徑中的琥珀酸脫氫酶(^//L4"基因及異擰檬酸裂合酶阻遏物(/c/i )缺陷型菌株發(fā)酵生 產(chǎn)琥珀酸。^Z/l4S亞基的敲除，使得琥珀酸不被氧化利用，從而在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)積累 下來(lái)；Zc/i 的敲除使得乙醛酸循環(huán)得以發(fā)揮作用，增加了琥珀酸的生成途徑，同時(shí)保證 了大腸桿菌菌株的正常生長(zhǎng)。
PHB合成代謝中有三個(gè)關(guān)鍵性的酶酮基硫酯酶(乙酰CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶)催化兩個(gè) 乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA ;依賴NADPH的乙酰乙酰還原酶(羥基丁酰CoA脫氫酶) 催化立體選擇性反應(yīng)，從乙酰乙酰CoA產(chǎn)生D-(-) 3-羥基丁酰CoA ; PHB聚合酶催化 D-(-)3-羥基丁酰CoA，通過(guò)酯鍵形成聚酯PHB。將這三個(gè)關(guān)鍵性的酶克隆到大腸桿菌 中過(guò)量表達(dá)，大腸桿菌即實(shí)現(xiàn)以葡萄糖等單糖為底物合成PHB。其途徑為葡糖—磷酸 葡萄糖—丙酮酸—乙酰CoA一乙酰乙酰CoA—羥基丁酰CoA—聚p羥基丁酸。
本發(fā)明在同一大腸桿菌內(nèi)同時(shí)構(gòu)建了 PHB和琥珀酸合成代謝途徑，以葡萄糖等單 糖為底物發(fā)酵同時(shí)生產(chǎn)PHB和琥珀酸。
本發(fā)明所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的方法步驟如下 (1)琥珀酸代謝途徑的構(gòu)建
通過(guò)Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌MG1655、 JM109、 DH5a、 Xll-blue或W3110中敲 除基因(琥珀酸脫氫酶)和/d/ (異檸檬酸裂合酶阻遏物)，構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵 途徑。
利用Red重組系統(tǒng)，根據(jù)Genbank公布的大腸桿菌基因組序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)W/L4B 和^/i 基因進(jìn)行敲除。以pKD3或pKD4為模板，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增帶有 氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的同源重組片斷。培養(yǎng)帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿
菌并制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將50 100[il的感受態(tài)細(xì)胞與8 12 ng的同源重組片斷混 合加入電擊杯中(購(gòu)買于Bio-Rad公司)，通過(guò)電穿孔儀(購(gòu)買于Bio-Rad公司)電擊，電壓 設(shè)置為1800 2500v。將電擊液用900pL的SOC培養(yǎng)基稀釋，然后通過(guò)氯霉素抗性或 卡那霉素抗性平板篩選重組子，然后設(shè)計(jì)引物PCR驗(yàn)證敲除的正確性。然后培養(yǎng)重組 大腸桿菌并制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒，通過(guò)溫度誘導(dǎo)表達(dá)FLP內(nèi)切酶將抗性 基因從基因組上切除掉。
上述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌MG1655或大腸桿菌DH5a。 上述敲除基因和/c/i 所用的引物分別為
pKD-W/^45 primer 1
AGCTGCTTC -3'
primer2
ATGGTCC -3'
pKD陽(yáng)涵J5 testl
5 '-GCTGC AACTGGTGATTGTCG-3' KD-W磁test2
5 '-GAGCATC ATC AAC ATCCGGG-3' pKD-Zc// primer 1
GCTGCTTC -3'
pKD-/c/A primer2
CATGGTCC -3' pKD-威testl
5'- TAAAAGCGACCACCACG-3' pKD-威test2
5'-GCGATTAACAGACACCCT陽(yáng)3'。
上述質(zhì)粒pKD46(oriR101 repA101ts ParaB- gam-bet-exo Amp)是溫度敏感型，能在阿 拉伯糖的誘導(dǎo)下表達(dá)同源重組需要的三個(gè)X噬菌體重組酶Gam， Bet和Exo。
上述質(zhì)粒pKD3含有兩邊為FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因；質(zhì)粒pKD4含有兩邊為 FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因。
上述質(zhì)粒pCP20為溫度敏感型，熱誘導(dǎo)后表達(dá)FLP重組酶，能識(shí)別FRT位點(diǎn)并促 進(jìn)重組的發(fā)生。所述質(zhì)粒pKD46、 pKD4、 pKD3及pCP20的構(gòu)建及應(yīng)用見(jiàn)(l.Datsenko
KA， Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in E^c/zm'c/n'a co// K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:6640 6645; 2. Red重組技術(shù)研究進(jìn)展， 中國(guó)生物工程雜志，2006， 26 (1): 81 86; 3. Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的 應(yīng)用,遺傳，2003， 25 (5): 628 632; 4.利用Red重組系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌ClpP基因的敲 除，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005,21 (1): 35 38)。
(2) PHB合成代謝途徑的構(gòu)建
基本方法是將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌04/c""ge"^ ew ro;7/7^)、肥大產(chǎn)堿桿菌 ^4/ca//gewey. /aftAs)、 自養(yǎng)黃桿菌(^Taw^zo6a"er aw/o^"op/z/cz^)、 巨大芽孢lf菌(5ac7'〃Ry wega^7'ww)或惡臭假單胞菌(i^ewcfowo"a;y /w"/a)的PHB合成酶基因p/z6C4fi克隆至質(zhì) 粒pBluescript SIC、 pUC18、 pUC19、 pCL1920或pTrc99-A中，獲得PHB表達(dá)重組質(zhì) 粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655、 JM109、 DH5a、 Xll-blue或W3110，得PHB發(fā)酵途徑的 大腸桿菌；
上述獲得PHB合成酶基因p/^C43所用的引物分別為
phbCAB primer 1: 5 '-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3'
phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3'。
其中所述PHB合成酶基因； /zZ)C4S的來(lái)源菌株優(yōu)選真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌04/c"/^^7" ew&op/z—。
將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的酮基硫酯酶(p/^S)，羥基丁酰CoA脫氫酶(p站J)， PHB聚 合酶(pMC)三個(gè)PHB合成酶基因/7^C4B克隆到質(zhì)粒表達(dá)載體上，得到PHB合成酶重 組表達(dá)質(zhì)粒，將PHB合成酶重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌(MG1655、 JM109、 DH5a或W3110中的一株)中，通過(guò)添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)PHB合成酶基因； M)CA8的表達(dá)。 從而三個(gè)PHB合成中的關(guān)鍵酶酮基硫酯酶，羥基丁酰CoA脫氫酶，PHB聚合酶催化 乙酰CoA生成PHB，即得PHB發(fā)酵途徑的大腸桿菌。
所述PHB合成酶/7/^C4S表達(dá)載體為pBluescript SIC、 pUC18、 pUC19、 pCL1920 或pTrc99A中的一種。
所述質(zhì)粒pBluescript S、pUC19、 pUC18購(gòu)自Fermentas公司，pCL1920購(gòu)自 DSMZ(德國(guó)微生物保藏中心)，pTrc99A購(gòu)自ATCC(美國(guó)典型菌種保藏中心)。
(3) 構(gòu)建琥珀酸和PHB聯(lián)產(chǎn)的重組大腸桿菌
將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的PHB合成酶基因； ^C4S克隆至質(zhì)粒pBluescript SK\ pUC18、 pUC19、 pCL1920或pTrc99-A中，獲得重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到已構(gòu)建有琥珀酸好 氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌中，獲得聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌?；蛘?br> 在已構(gòu)建有PHB發(fā)酵途徑的大腸桿菌中，利用Red重組系統(tǒng)敲除基因(琥 珀酸脫氫酶)和(異檸檬酸裂合酶阻遏物)，構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑，獲得聯(lián)產(chǎn) 琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌。
(4) 發(fā)酵琥珀酸和PHB聯(lián)產(chǎn)的重組大腸桿菌并檢測(cè)琥珀酸和PHB
將所獲得的聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌從固體平板上挑取1 2環(huán)接入裝有 LB培養(yǎng)基的試管中，30 4(TC下，培養(yǎng)12 20h;然后按照1 10%的接種量轉(zhuǎn)入300ml
的三角瓶或5L的發(fā)酵罐中發(fā)酵；發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為30 4(TC,搖床轉(zhuǎn)速設(shè)
為150 300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 72h;發(fā)酵罐溫度設(shè)為30 4(TC，溶氧控制在50% 以上，pH6.5 7.5，發(fā)酵時(shí)間72h 150h。
每間隔2 4h取樣，將取的發(fā)酵液以4， 000 12， 000的轉(zhuǎn)速離心2 20min，上 清用于分析檢測(cè)琥珀酸，用0.2pm的濾膜過(guò)濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)。
檢測(cè)條件為檢測(cè)柱Waters C18，流動(dòng)相1%。的甲酸，檢測(cè)器示差檢測(cè)器。菌體于
55 8(TC下烘干，稱重，然后加入100 200微升的98%硫酸，沸水浴中加熱60 70min， 然后利用15。/。的氨水調(diào)節(jié)pH至2.5，經(jīng)0.22pm微孔濾膜過(guò)濾后，HPLC(高壓液相色譜)
檢測(cè)PHB含量。檢測(cè)條件為分析柱C18; 1%。的甲酸作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器；紫外
波長(zhǎng)為210nm。
上述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的方法中
(2) 或(3)所述質(zhì)粒優(yōu)選質(zhì)粒pBluescript SK—。
(3) 所述聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌或者聯(lián)產(chǎn)PHB和琥珀酸的重組大腸桿 菌是重組大腸桿菌MG1655Z1^//^^ Zlz'c/i ::kan/pBluescript SK'-; /^C^。
步驟(4)所述發(fā)酵條件優(yōu)選是搖瓶溫度設(shè)為37'C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/分，發(fā) 酵時(shí)間48h 60h;發(fā)酵罐溫度設(shè)為37'C，溶氧控制在50%以上，pH 7.0，發(fā)酵時(shí)間 100h 120h。
本發(fā)明使用了近幾年來(lái)發(fā)展迅速的依賴于X噬菌體的Red重組系統(tǒng)，對(duì)大腸桿菌染 色體DNA進(jìn)行基因敲除、敲入和替換。Red是一種X噬菌體主管同源重組的重組酶， 由exo、 beta和gam基因組成。Gam抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶，使外源線形 DNA不被立即降解，Exo和Bet引導(dǎo)線形片斷與同源區(qū)發(fā)生重組置換，該方法與傳統(tǒng)同 源重組方法相比，簡(jiǎn)單、精確并且效率高出幾十倍。操作過(guò)程中不需要限制向內(nèi)切酶和 DNA連接酶。
本發(fā)明巧妙地將PHB生物合成基因?qū)腌晁峁こ叹曛校晒Λ@得了聯(lián)產(chǎn)琥珀 酸和PHB的大腸桿菌，發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果表明，該工程菌株可高效率地轉(zhuǎn)化葡萄糖生成琥 珀酸和PHB。消耗75g/L的葡萄糖，生成37.5g/L的琥珀酸，同時(shí)菌體積累PHB達(dá)到干 重的28%。聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB不僅解決了目前琥珀酸和PHB發(fā)酵過(guò)程中所存在的缺陷 和不足，而且還節(jié)省了發(fā)酵環(huán)節(jié)上的大量能源成本及分離提取成本。將本發(fā)明方法應(yīng)用 到大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可以實(shí)現(xiàn)琥珀酸和PHB的低成本、高效率的聯(lián)產(chǎn)，具有重要的 工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸和PHB的途徑。
圖2為本發(fā)明聯(lián)產(chǎn)重組大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)結(jié)果。
圖3為本發(fā)明聯(lián)產(chǎn)重組大腸桿菌發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、琥珀酸發(fā)酵途徑的構(gòu)建(敲除sdhAB) 菌種大腸桿菌MG1655
所述LB培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L，氨芐青霉素，100mg/L， 卡那霉素50mg/L。
所述氨芐霉素抗性平板為含有100mg/L的氨芐青霉素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養(yǎng)基。 所述卡那霉素抗性平板為含有50mg/L的氨芐青霉素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養(yǎng)基。 所述SOC培養(yǎng)基為蛋白胨2 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.0585 g/L， KC1 0.0186g/L， MgCl2 0.203 g， MgS04 0.246 g/L，葡萄糖20 mmol/L。
(1)同源重組片斷的克隆
利用Red重組系統(tǒng)對(duì)目的基因進(jìn)行敲除。根據(jù)Genbank公布的W/L45基因序列設(shè) 計(jì)引物
primer 1
TGCTTC-3' PKD-sc/Zl45 primer2
GTCC -3'
以pKD4通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴(kuò)增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片斷。 PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20pmol/L)
10x緩沖液 5pl;
25mmol認(rèn)gC12 ，；
10mmol/L四種dNTP混合液1^1;
上下游引物各1^1;
TaqDNA聚合酶0.5^1;
模板DNAlpl，加水補(bǔ)至50(al; PCR反應(yīng)條件97。C預(yù)變性10min， 94。C變性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸90s， 30個(gè)循環(huán)后72。C延伸10min， 4'C保存。通過(guò)D;w/內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源 重組片斷。
(2) 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
(I) 挑取帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌MG1655，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入0.2% 的阿拉伯糖，培養(yǎng)OD纖至0.5;
(II) 冰浴15min，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；
(III) 加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態(tài)。
(3) 電轉(zhuǎn)化，篩選重組子
(I) 吸取7 10叫/1的同源重組片斷，加入10(^1的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電穿 孔儀，2.5Kv，電擊；
(II) 加入900^1的SOC培養(yǎng)基，37°C， 150轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)lh;
(III) 涂布卡那霉素抗性平板，調(diào)取重組子利用 pKD-W禱testl 5'國(guó)GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3' pKD-W雄test2 5'-GAGCATCATCAACATCCGGG-3'
進(jìn)行PCR檢測(cè)，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)sdhAB已被卡那霉素抗性基因換。
(IV) PLP位點(diǎn)專一重組
將pCP20轉(zhuǎn)入氯霉素抗性克隆，30'C培養(yǎng)8h，后提高至42'C過(guò)夜，熱誘導(dǎo)FLP重 組酶表達(dá)，質(zhì)粒也逐漸丟失。利用接種環(huán)蘸取菌液在無(wú)抗性培養(yǎng)基上劃線，將長(zhǎng)出的單 克隆同時(shí)轉(zhuǎn)入無(wú)抗性平板和卡那霉素抗性平板上培養(yǎng)，在無(wú)抗性平板上生長(zhǎng)而在卡那霉 素抗性平板上不生長(zhǎng)的已被F1P重組酶刪除。利用檢測(cè)引物pKD-W/^45 testl和 pKD-W雄test2進(jìn)一步鑒定。
(V)獲得工程菌株MG1655AW/L4仏
實(shí)施例2、 PHB合成代謝途徑的構(gòu)建 菌種大腸桿菌DH5a
所述培養(yǎng)基LB:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L，氨芐青霉素，100mg/L。 所述PHB合成酶基因來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌G4. ew/w/ te》。 所述氨芐霉素抗性平板含有1.5%的瓊脂和100mg/L的氨芐霉青霉素。 (1) PHB合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建
(I) 將真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，利用通用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因 組。
(II) 根據(jù)Genbank公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因組序列，設(shè)計(jì)引物
phbCAB primer 1: 5 '-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3' phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC陽(yáng)3' (II)克隆PHB合成酶基因
以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增戶/^C4B基因。PCR反應(yīng)體系如下(引 物濃度為20(imol/L)
10x緩沖液 5叫
25mmol/LMgC12 4|il;
10mmol/L四種dNTP混合液
上下游引物各lpl;
TaqDNA聚合酶0.5pl;
模板DNAlpl，加水補(bǔ)至50pl;
PCR反應(yīng)條件97。C預(yù)變性10min， 94。C變性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸5.5min， 30個(gè)循環(huán)后72"延伸10min， 4'C保存。
(in)PHB合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建
將pBluescript SK—和PCR產(chǎn)物通過(guò)Sma/和雙酶切反應(yīng)，利用PCR產(chǎn)物回
收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，反應(yīng)為16"， 16h。從而獲得PHB合成酶表 達(dá)載體pBluescript SK、/ /^C45。
(2) 大腸桿菌感受態(tài)的制備；
(I )調(diào)取LB平板中的大腸桿菌co// DH5a,培養(yǎng)過(guò)夜；
(II) 將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌五.co// DH5a按照1%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50 ml LB的 300ml的三角瓶中培養(yǎng)，OD,至0.4左右。停止培養(yǎng)，置冰上20min， 4°C， 4000 g， 離心10min。棄上清，加入冰冷的CaCl2溶液懸浮，冰上靜置30min。離心濃縮。獲得 感受態(tài)細(xì)胞。放于-7(TC保存。
(3) PHB表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
(I)將8昭/1的PHB表達(dá)載體pBluescript SK)秘C4S轉(zhuǎn)入100^1的感受態(tài)細(xì)胞中， 混勻；
(n)置冰上30min;
(III) 42 °C熱激，冰上靜置2min，加入900^1的LB培養(yǎng)基，37°C， 100轉(zhuǎn)/min，培 養(yǎng)lh。
(IV) 涂布氨芐霉素抗性平板，培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)取驗(yàn)證，篩選轉(zhuǎn)化子。
所述PHB表達(dá)載體pBluescript SK—f/^C^即； /^C4S位于Lac啟動(dòng)子的下游。 所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌購(gòu)買于CICC(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。 實(shí)施例3、聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵琥珀酸與PHB的重組大腸桿菌的構(gòu)建 1.琥珀酸合成代謝途徑的構(gòu)建(/c/i 基因的敲除)
菌種大腸桿菌MG1655AW/l4B (I)同源重組片斷的克隆
根據(jù)GenBank公布的大腸桿菌基因組序列設(shè)計(jì)引物 pKD-/c/i primer 1:
GCTTC陽(yáng)3' pKD-/c/i primer2:
GGTCC -3'，以pKD4質(zhì)粒為模板通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴(kuò)增獲得帶有卡那霉素 抗性的重組片斷。PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為2(Hunol/L)
10x緩沖液 5pl;
25mmol/LMgC12 ，；
10mmol/L四種dNTP混合液l|til;
上下游引物各lpl;
TaqDNA聚合酶0.5
模板DNAlial，加水補(bǔ)至50ial;
PCR反應(yīng)條件9 7 。C預(yù)變性10min， 9 4 。C變性60s， 58 。C退火30s, 72 。C延伸70s， 30個(gè)循環(huán)后72 'C延伸10min,回收純化濃縮同源重組片斷。
(II) 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
(A) 挑取帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌MG1655A //l4S轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，同時(shí) 加入0.2%的阿拉伯糖，培養(yǎng)OD6GQ至0.5;
(B) 冰浴15min，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；
(C) 加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態(tài)。
(III) 電轉(zhuǎn)化，篩選重組子
(A) 吸取7 10pg/1的同源重組片斷，加入lOOpl的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電 穿孔儀，2.5Kv，電擊；
(B) 加入900^1的LB培養(yǎng)基，37°C， 150轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)lh;
(C) 涂布卡那霉素抗性平板，調(diào)取重組子利用pKD-zW/ testl: 5'-TAAAAGCGACCACCACG-3'與pKD"c/J test2: 5'-GCGATTAACAGACACCCT-3'進(jìn)行
PCR檢測(cè)；
(D )獲得帶有卡那霉素抗性基因的重組大腸桿菌MG1655Aw/ZL4SAZc儀kan。
2. 琥珀酸與PHB聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵工程菌株的構(gòu)建 菌種MG1655 A //l4S A/c/i : :kan
(1) 感受態(tài)細(xì)胞的制備
(I) 將大腸桿菌MG1655 A ^45 A/c/i : :kan在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；
(II) 將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌MG1655 AW/^S A/c/i : :kan按照1%的接種量轉(zhuǎn)入裝 有50 ml LB的300ml的三角瓶中培養(yǎng)，OD6()Q至0.4左右。停止培養(yǎng)，置冰上20min， 4°C， 4000 g，離心10min。棄上清，加入冰冷的CaCl2溶液懸浮，冰上靜置30min。離 心濃縮。獲得感受態(tài)細(xì)胞。放于-7(TC保存。
(2) PHB表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
(I )將8嗎/1的PHB表達(dá)載體pBluescript SIC-; /^C45轉(zhuǎn)入100^1的感受態(tài)細(xì)胞中， 混勻；
(II)置冰上30min;
(IH)42。C熱激，冰上靜置2min,加入900^1的LB培養(yǎng)基，37°C， 100轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng) lh。
(IV) 涂布氨芐霉素和卡那霉素雙抗性平板，培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)取驗(yàn)證，篩選轉(zhuǎn)化子。
(V) 獲得琥珀酸和PHB的聯(lián)產(chǎn)重組菌株MG1655A //l45 Az'c/i ::kan/pBluescript
所述氨卡霉素抗性平板含有質(zhì)量百分比為1.5%的瓊脂，100mg/L的氨芐霉青霉素 及50mg/L的卡那霉素。
3. 琥珀酸和PHB聯(lián)產(chǎn)重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵
菌種MG1655A //l45 Az'c/i : :kan/pBluescript SIC-; /^ClB。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L,NaHCO3lg/L,氨芐霉 素100mg/I,卡那霉素50mg/L。
所述LB培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L。
(1) 培養(yǎng)方法
(I )種子液得制備用接種環(huán)調(diào)取平板上的菌種接入裝有50ml LB培養(yǎng)基的300ml 的三角瓶中，卡那霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為50mg/l, 100mg/l。于37'C， 250轉(zhuǎn) /min，培養(yǎng)12h。
(II)搖瓶發(fā)酵將種子液按照1%的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 300ml的三角瓶中。接種時(shí)加入卡那霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為50mg/l, 100mg/l， 培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/min。培養(yǎng)至12h，加入IPTG(異丙基-(3-D-硫 代半乳糖苷)至終濃度為0.4mM。發(fā)酵48h，每間隔4h取樣。
(2) 琥珀酸和PHB的檢測(cè)
(I) 琥珀酸的檢測(cè)取發(fā)酵完畢的菌液12， 000 g，離心2min。取上清，用0.2pm的 濾膜過(guò)濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)。檢測(cè)條件為檢測(cè)柱waters C18，流
動(dòng)相1%。的甲酸，檢測(cè)器示差檢測(cè)器。
(II) PHB的檢測(cè)
收集細(xì)胞將發(fā)酵完畢的發(fā)酵液樣品在5,000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，收集沉 淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5,000轉(zhuǎn)/min離心20min收集細(xì)胞，烘干后稱其 干重。
樣品檢測(cè)將上述制得的干菌體，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加熱60min， 然后利用15%的氨水調(diào)節(jié)pH至2.5，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)PHB 含量。檢測(cè)條件為分析柱C18;l%。的甲酸作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器；紫外波長(zhǎng)為210nm。 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，重組大腸桿菌MG1655A^f/^5 Az'c/i ::kan/pBluescript SK.-p/^C4B在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，可以高效地轉(zhuǎn)化為琥珀酸和PHB。
實(shí)施例4、聯(lián)產(chǎn)重組工程菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng) 菌種重組大腸桿菌MG1655AW/l4B A/c/i ::kan/pBluescript SIC-p/^C^ 所述發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaCl 10g/L, NaHC03 lg/L,氨芐霉素 100mg/l，卡那霉素50mg/L。
(1) 發(fā)酵培養(yǎng)
用接種環(huán)調(diào)取平板上的菌種接入裝有50ml的培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，于250 轉(zhuǎn)/min的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C，然后按照1%的接種量接入裝有200ml 的培養(yǎng)基的1000ml的三角瓶中，培養(yǎng)過(guò)夜。然后按照5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng) 基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C ，溶氧控制在50%以上，利用2mol/L的NaOH 和lmol/L的HN03控制pH在6.5-7.5。接種時(shí)加入卡那霉素和氨芐青霉素至終濃度分 別為50mg/l, 100mg/l。培養(yǎng)至12h，加入IPTG至終濃度為0.4mM。發(fā)酵120h,每間隔 4h取樣。
(2) 琥珀酸和PHB的檢測(cè)
(I) 琥珀酸的檢測(cè)將所取發(fā)酵液樣品在12， 000轉(zhuǎn)/min，離心2min。取上清，用 0.2pm的濾膜過(guò)濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)。檢測(cè)條件為檢測(cè)柱waters
C18，流動(dòng)相1%。的甲酸，檢測(cè)器示差檢測(cè)器。
(II) PHB的檢測(cè)
收集細(xì)胞將所取的發(fā)酵液樣品在12， 000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下離心2min，收集沉淀細(xì) 胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5,000轉(zhuǎn)/min離心20min收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。
樣品檢測(cè)將上述制得的干菌體，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加熱60min， 然后利用15%的氨水調(diào)節(jié)pH至2.5，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)PHB
含量。檢測(cè)條件為分析柱C18;l%。的甲酸作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器；紫外波長(zhǎng)為210nm。
通過(guò)檢測(cè)結(jié)果圖3可以看出，本發(fā)明方法構(gòu)建的重組大腸桿菌MG1655A //^S △/c/i : :kan/ pBluescript SK--/ M>C45在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，可以高效率地轉(zhuǎn) 化葡萄糖生成琥珀酸和PHB。在消耗75g/L的葡萄糖時(shí)生成37.5g/L的琥珀酸，菌體積 累PHB達(dá)到28。/。?？梢愿咝У剞D(zhuǎn)化為琥珀酸和PHB。同時(shí)乙酸鹽及丙酮酸等副產(chǎn)物大 大減少。結(jié)果表明，PHB和琥珀酸的聯(lián)產(chǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明所構(gòu)建的該工程菌株 在實(shí)際大工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用前景。
序列表
〈110〉山東大學(xué)
〈120〉利用重組大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚^羥基丁酸酯的方法
〈141〉2008-7-26
<160〉10
〈210〉1
<211〉59
〈212〉廳
〈213>pKD-sdhAB (上游引物) 〈400〉1
gggccacacg cgaaactgaa actcgatcac ctgggtaaag tgtaggctgg agctgcttc 59
〈210〉2
〈211〉59
<212〉DNA
〈213〉pKD-sdhAB(下游引物) 〈400>2
gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag gcctacggta tgggaattag ccatggtcc 59
<210〉3
<211〉20
<212〉薩
<213>pKD-sdhAB testl(上游引物) <400〉3
gctgcaactg gtgattgtcg 20
〈210〉4
<211〉20
<212>DNA
〈213〉pKD-sdhAB test2(下游引物) 〈400〉4
gagcatcatc aacatccggg 20 〈210〉5
〈211〉59
<212〉DNA
〈213〉pKD-iclR(上游引物) 〈400>5
atgaaaatga tttccacgat ac卿aaaaa gagactgtcg tgtaggctgg agctgcttc 59
〈210〉6
〈211>59
〈212〉DNA
〈213〉pKD-iclR(下游引物) <400〉6
tatgatgggc agaatattgc ctctgcccgc c卿aaa卿tgggaattag ccatggtcc 59
〈210〉7
<211〉17
〈212環(huán)A
<213〉pKD-iclR test(上游引物) 〈400〉7
taaaagcgac caccacg 17
〈210〉8
<211〉18
<212>DNA
<213〉pKD-iclR test(下游引物) 〈400>8
gcgattaaca gacaccct 18
<210>9
<211〉37
<212>DNA
〈213〉phbCAB primer (上游引物) <400〉9
atccccgggg cgaccggcaa aggcgcggca gcttcca 37
〈210>10 〈211〉36 <212〉脆
〈213〉phbCAB primer(下游引物) <400〉10
atggaattcc agcccatatg caggccgccg ttgagc 3權(quán)利要求
1.一種利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚β羥基丁酸酯的方法，步驟包括 (1)在大腸桿菌中構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑； (2)在所構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑；獲得聯(lián)產(chǎn)琥珀酸 和PHB的重組大腸桿菌；或者 (1)在大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑； (2)在所構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑的大腸桿菌中構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑；獲得聯(lián)產(chǎn)琥珀酸 和PHB的重組大腸桿菌； (3)發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌并檢測(cè)琥珀酸和PHB；其特征是步驟(1)所述在大腸桿菌中構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑是通過(guò)Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌MGl655、JMl09、DH5a、X11-blue或W3110中敲除基因sdhAB和iclR，構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑；步驟(2)所述在所構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑是將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes.latus)、自養(yǎng)黃桿菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至質(zhì)粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，并轉(zhuǎn)化到已構(gòu)建有琥珀酸好氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌中，獲得聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌；或者步驟(1)所述在大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑是將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes latus)、自養(yǎng)黃桿菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)或惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至質(zhì)粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，獲得PHB表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655、JM109、DH5a、X11-blue或W3110，得PHB發(fā)酵途徑的大腸桿菌；步驟(2)所述在所構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑的大腸桿菌中構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑是將sdhAB和iclR基因敲除，獲得聯(lián)產(chǎn)PHB和琥珀酸的重組大腸桿菌；步驟(3)所述聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌的發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為30～40℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150～300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h～72h；發(fā)酵罐溫度設(shè)為30～40℃，溶氧控制在50％以上，pH6.5～7.5，發(fā)酵時(shí)間72h～150h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚P羥基丁酸酯的方法，其特征 是步驟(l)所述的大腸桿菌是大腸桿菌MG1655或大腸桿菌DH5a。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚卩羥基丁酸酯的方法，其特征 是步驟(l)所述在大腸桿菌中構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑中敲除基因W/L45和/c/i 所用 的引物分別為PKD-W/l45 primer 1<formula>formula see original document page 2</formula>pKD-W/^S primer2 ATGGTCC陽(yáng)3'pKD-涵J5 testl5 '-GCTGC A ACTGGTG ATTGTCG陽(yáng)3' pKD-涵力5 test25 '-GAGC ATC ATC A AC ATCCGGG-3' pKD-/c/i primer 1GCTGCTTC -3'pKD-/c/i primer2CATGGTCC -3' pKD-譜testl5'- TAAAAGCGACCACCACG-3' pKD-威test25'-GCGATTAACAGACACCCT-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚卩羥基丁酸酯的方法，其特征 是步驟(l)所述在大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑中獲得PHB合成酶基因；7MC45所 用的引物分別為phbCAB primer 1: 5'-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3'phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚P羥基丁酸酯的方法，其特征 是所述PHB合成酶基因； /^CAB的來(lái)源菌株是真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌G4/ca"gw" e^rap/n^)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚卩羥基丁酸酯的方法，其特征 是步驟(2)所述在所構(gòu)建琥珀酸好氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌中構(gòu)建PHB發(fā)酵途徑，用于 表達(dá)PHB合成酶基因p/26C4S的質(zhì)粒選pBluescript SK、
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚卩羥基丁酸酯的方法，其特征 是步驟(2)所述聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的重組大腸桿菌或者聯(lián)產(chǎn)PHB和琥珀酸的重組大 腸桿菌是重組大腸桿菌MG1655Z1W/l4B Zl/c/i :: kan/pBluescript SK-卞/z6C45。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚卩羥基丁酸酯的方法，其特征是步驟(3)所述發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為37'C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 60h;發(fā)酵罐溫度設(shè)為37。C，溶氧控制在50%以上，pH7.0，發(fā)酵時(shí)間100h 120h。
全文摘要
本發(fā)明首次公開了一種利用大腸桿菌聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和PHB的方法，是敲除了大腸肝菌中的sdhAB和iclR基因，構(gòu)建了琥珀酸好氧發(fā)酵途徑，獲得了琥珀酸發(fā)酵工程菌株MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan；在此基礎(chǔ)上，將PHB合成途徑導(dǎo)入大腸桿菌MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan中，從而在同一大腸桿菌中成功構(gòu)建了琥珀酸和PHB發(fā)酵途徑。發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果表明，該工程菌株可高效率地轉(zhuǎn)化葡萄糖生成琥珀酸和PHB。消耗75g/L的葡萄糖，生成37.5g/L的琥珀酸，同時(shí)菌體積累PHB達(dá)到菌體干重的28％。該工程菌株具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101363032SQ20081013888
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者振 康, 祁慶生 申請(qǐng)人:山東大學(xué)