專利名稱：零背景構(gòu)建重組桿狀病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白工程領(lǐng)域，具體是一種零背景構(gòu)建重組桿狀病 毒的方法。
背景技術(shù)：
昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是20世紀80年代發(fā)展起來的真核表達系統(tǒng)，它具 備所有真核表達系統(tǒng)翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化、信 號肽切除等，表達出的重組蛋白具有天然蛋白的生物學(xué)功能。Smith等(1983) 用苜宿銀紋夜蛾多粒包埋型核型多角體病毒(AcMNPV,Xwtograp/za c^/orm'ca multiple nudeocapsid nucleopolyhedrovims)作載體在草地夜蛾細胞Sf-21中高 效表達人卩-干擾素的研究成果開拓了桿狀病毒作為載體表達外源基因的新領(lǐng) 域。目前，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源基因的來源遍及病毒、細菌、真菌、 動物和植物等各種生物，其應(yīng)用范圍涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 之間相互作用方面的基礎(chǔ)研究和疫苗生產(chǎn)、疾病診斷以及病毒殺蟲劑的改良 等。桿狀病毒由于基因組龐大，外源基因的克隆不能象細菌或酵母載體一樣通 過酶切連接的方式直接插入，而必須通過轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)。因此如何高效快速 地構(gòu)建重組桿狀病毒成為利用桿狀病毒表達外源基因的最關(guān)鍵一歩。
目前構(gòu)建重組桿狀病毒方法有傳統(tǒng)的昆蟲細胞內(nèi)同源重組，細菌內(nèi)重組即 Bac-to-Bac系統(tǒng)，以及直接連接等三種方式。其中昆蟲細胞內(nèi)同源重組和直接 連接由于重組效率低，轉(zhuǎn)座背景高，需要多輪空斑純化，耗時費力，現(xiàn)在己經(jīng) 很少有研究者使用。目前最常用的桿狀病毒表達系統(tǒng)是細菌內(nèi)重組即 Bac-to-Bac系統(tǒng)，其本質(zhì)上是將NPV基因組DNA改造成可在細菌內(nèi)復(fù)制并能 與供體質(zhì)粒在細菌內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座且同時對昆蟲細胞保留感染性的大型穿梭載體。 其轉(zhuǎn)座原理基于Tn7轉(zhuǎn)座子的專一位點轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，它通過將桿狀病毒DNA改 造成可在大腸桿菌菌株中復(fù)制的Bacmid載體，即在桿狀病毒基因組中含有可 在大腸桿菌復(fù)制的F因子復(fù)制子，卡那霉素抗性基因，Tn7轉(zhuǎn)座接觸位點以及 lacZ'盒式結(jié)構(gòu)，由于桿狀病毒基因組為環(huán)狀閉合雙鏈DNA分子，因此這種 Bacmid可以像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中以低拷貝形式復(fù)制。而在轉(zhuǎn)移載體中外
源基因位于多角體啟動子的驅(qū)動下，兩端分別為Tn7轉(zhuǎn)座子的左、右端轉(zhuǎn)座序 列，當將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到含有Bacmid的大腸桿菌中后，在輔助質(zhì)粒提供 的轉(zhuǎn)座酶的介導(dǎo)下進行轉(zhuǎn)座，將重組轉(zhuǎn)移載體上含外源基因的表達盒式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn) 座到Bacmid的lacZ'盒式結(jié)構(gòu)中，破壞a互補，因此重組病毒可以通過簡單 的藍白斑方法篩選，從白色菌落中分離的重組病毒DNA直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞即可 以獲得有感染性的重組病毒粒子。
然而即使是Bac-to-Bac系統(tǒng)，雖然其不需要在昆蟲細胞內(nèi)進行同源重組， 但在細菌內(nèi)轉(zhuǎn)座效率也不是非常高，通常只10%左右的白斑，而且白斑菌落 需要進一步劃線培養(yǎng)和PCR驗證以去除假陽性，比較耗時復(fù)雜?，F(xiàn)有方法基本 能夠滿足在構(gòu)建單個或者少量重組病毒，一旦需要構(gòu)建數(shù)十個甚至更多的重組 病毒大量表達外源基因時則效率太低。而且由于獲得重組病毒的效率少于90 % ，不合適構(gòu)建高質(zhì)量庫容量大的桿狀病毒cDNA文庫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種零背景構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，可去除轉(zhuǎn)座中 的背景干擾，避免復(fù)雜的PCR驗證和繁瑣的空斑純化，真正做到高效快速構(gòu)建 重組桿狀病毒。
本發(fā)明所述的零背景構(gòu)建重組桿狀病毒的方法按下述步驟實現(xiàn)(1)構(gòu)建
以R6KY作為復(fù)制子的供體質(zhì)粒，并按常規(guī)方法引入外源基因；(2)封閉 DH10Bac宿主菌基因組上的誠Tn7受體位點，獲得DH10BacATn7; (3)常 規(guī)方法轉(zhuǎn)化重組供體質(zhì)粒進入DH10BacATn7獲得重組桿狀病毒；(4)常規(guī) 方法制備重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。
本發(fā)明供體質(zhì)粒以R6Ky作為復(fù)制子，DH10BacATn7中封閉了宿主菌 上的加汀n7受體位點，兩種策略的單獨使用都可以提高轉(zhuǎn)座效率。
本發(fā)明的理論依據(jù)Bacmid宿主菌五.co/z'DH10B基因組內(nèi)存在有Tn7轉(zhuǎn) 座受體位點(a"Tn7)，這些受體位點會與Bacmid中的a"Tn7競爭，造成目標 轉(zhuǎn)座效率下降；另一方面以pUC為基本骨架的轉(zhuǎn)移載體和具有F因子復(fù)制子 的Bacmid在宿主菌中可以共存，使得抗性篩選背景非常高，增加了獲得重組 病毒的程序和時間。R6KY復(fù)制子的復(fù)制依賴于宿主菌戸> 基因的表達產(chǎn)物Rep
蛋白兀，如果在轉(zhuǎn)移載體中利用R6KY作為復(fù)制子，這樣就可以避免轉(zhuǎn)移載體 以質(zhì)粒的形式和Bacmid在宿主菌中共存的問題，減少抗性篩選背景；封閉宿 主菌基因組中的a^Tn7位點，就避免了這些受體位點與Bacmid中的a"Tn7 競爭，解決了目標轉(zhuǎn)座效率下降的問題。 有益效果
本發(fā)明利用以R6KY為復(fù)制子構(gòu)建條件限制型供體質(zhì)粒，同時封閉 DH10Bac宿主菌基因組上的加Tn7重組位點，只需常規(guī)轉(zhuǎn)化即可獲得重組桿 狀病毒，并且由于其超過99%的陽性重組率，無須復(fù)雜的PCR驗證和繁瑣的 空斑純化，做到零背景真正高效快速的構(gòu)建重組桿狀病毒，促進桿狀病毒表達 系統(tǒng)的廣泛利用。


圖l是供體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，pRCDM含有R6Ky復(fù)制子，兩個桿狀病毒 強啟動子(pl0和polh)，兩個多克隆位點(MCS1和MCS2)以及轉(zhuǎn)座同源臂 (Tn7L和Tn7R)。
圖2是封閉宿主菌基因組中Tn7受體位點的質(zhì)粒 R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R結(jié)構(gòu)示意圖，該質(zhì)粒含有FLP/FRT重組序列 (FRT-L和FRT-R)， Tn7重組序列(Tn7-L和Tn7-R)以及兩個抗性篩選標記 (Zeocin禾卩chloramphenicol)。
圖3是pRCDM-gfj)轉(zhuǎn)座BmDH10BacATn7后重組病毒的鑒定。以M13 通用引物PCR擴增重組桿狀病毒，12個單克隆都擴增出大約3100bp的條帶。
圖4是重組桿狀病毒BmBacmid-g*感染BmN細胞。其中(A)是使用 488nm熒光觀察感染72小時后的BmN細胞，(B)是同一視野下普通光觀察 感染72小時后的BmN細胞。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當說明的是，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護范圍，下列實施例中未注明具 體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版
社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；孫明主編，高等教育出版社，2006，
基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚倫廣編著)；黎路林編著，華中師范 大學(xué)出版社，1996，桿狀病毒表達載體系統(tǒng)，或按照制造廠商的操作指南所建 議的方法進行。
實施例1:零背景獲得重組BmBacmid的方法 (1)供體質(zhì)粒的構(gòu)建
如圖1所示，該質(zhì)粒以R6K，ri為條件限制型復(fù)制子，在表達/7/r基因的 菌株中才能復(fù)制繁殖。具體構(gòu)建過程如下以pUCDM (T.J.Richmond贈送) 為模板，上游弓I物R6K，F(xiàn): ggcgcgccTAGGGATAACAGGGTAATGAGCTCC GTGG GCCCAATTCTGTCA,下游弓I物R6Ky-R:ggcgcgccTAGGGATAACAGG GTAATT CGAAACGCGCTAGTATAATTTAAC (劃線部分為Asc I酶切位點)， 擴增R6Ky復(fù)制子。Zeocin基因以pVgRxR (購買自Invitrogen)為模板擴增， 上游弓I物ZeoT畫F: ggcgcgccACGTTTAAACTGGCTGCAGCACGTGT TGAC AAT，下游弓I物ZeoT畫R: ggcgcgccACGTTTAAACTGGTCG AGGTCGACCC CCCTCGG (劃線部分為Asc I酶切位點)。R6K和ZeoT的PCR產(chǎn)物分別用 Asc I酶切后連接獲得質(zhì)粒R6K-ZeoT。
以pUCDM為模板，上游引物Cm-F: ttcggaTACCTGTGACGGAAGAT， 下游引物Cm-R: ttcgaaCATTC ATCCGCTTATTATCA (劃線部分為BstB I酶切 位點)PCR擴增抗性基因Cm。 BstB I分別酶切質(zhì)粒R6K-ZeoT和PCR產(chǎn)物 Cm后連接獲得R6K-Cm-ZeoT質(zhì)粒。同源臂Tn7-L和同源臂Tn7-R都以質(zhì)粒 pFBDM (T. J. Richmond贈送)為模板進行擴增。Tn7-L上游引物 AcctaaggcgcgccGAAGATGACGGTTTGT (劃線序列為Bsu36 I酶切位點，斜體 序列為Asc I酶切位點)，下游引物Agcatgcgg自TAGGAGATCCGAACCAG (劃線序列為Sph I酶切位點，斜體序列為BamH I酶切位點)；Tn7-R上游引 物Accttaggcgcgcc CTGCGTAAGCGGGTGT (劃線序列為Bsu36 I酶切位點， 斜體序列為Asc I酶切位點)；下游引物AgcatgccgcggAG丁TG TTCGGTAAATTGT (劃線序列為Sph I酶切位點，斜休序列為SacII酶切位 點)。PCR產(chǎn)物Tn7-L克隆到pMD-18T Simple載體(購買自TaKaRa公司)， Sph I和BamH I雙酶切后與PCR產(chǎn)物ZeoFRT的Sph I和BamH I雙酶切產(chǎn) 物相連接，獲得質(zhì)粒Ts-ZeoFRT-Tn7L。質(zhì)粒pSLfall80fa (T. J. Richmond贈
送，帶有兩個Asc I位點)用Asc I酶切后回收載體片段，質(zhì)粒Ts-ZeoFRT-Tn7L 和PCR產(chǎn)物Tn7-R用Asc I和BamH I雙酶切后回收ZeoFRT-Tn7L和Tn7-R 片段。pSLfall80fa， ZeoFRT-Tn7L和Tn7R三個片段連接獲得質(zhì)粒 1180fa-Tn7L-ZeoFRT國Tn7R 。 Asc I 分另U酶切 R6K-Cm畫ZeoT 和 1180fa-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R后連接獲得質(zhì)粒R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R。 Sac II和AwII雙酶切pFBDM獲得帶有慶大霉素抗性和多克隆位點片段，膠回收 后定向克隆到R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R質(zhì)粒中，獲得陽性克隆命名為 pRCDM。
pIRES-gfp經(jīng)Smal和XhoI酶切，回收綠色熒光蛋白基因gfp片段，克隆 到載體pRCDM得到重組質(zhì)粒pRCDM-g* (2)受體BmDH10BacATn7的構(gòu)建
如圖2所示，步驟l中的中間產(chǎn)物質(zhì)粒R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R帶有 Tn7-L和Tn7-R同源臂以及Zeocin抗性基因，我們可以用這個質(zhì)粒來封閉宿 主菌DH10B基因組上的a"Tn7位點。同時Zeocin抗性基因兩側(cè)帶有FRT序 列的，可以很方便的在重組后在基因組中把其缺失掉，而不會對宿主菌產(chǎn)生其 他任何影響。
按照Bac-to-Bac實驗方法把R6K-Cm-Tn7L-ZeoFRT-Tn7R轉(zhuǎn)座Eco// BmDH10Bac后，涂布轉(zhuǎn)化子于Kan7Tetr/Zeocin7X-gal/IPTG的LS固體平板上， 37t:培養(yǎng)48小時待藍白斑明顯后挑取數(shù)個藍斑于LS液體培養(yǎng)基 (Kan7Tet7Zeocinr)中振蕩培養(yǎng)。用ZeoFRT引物對菌液進行PCR擴增驗證正 確后制作化學(xué)感受態(tài)，把溫度敏感型的質(zhì)粒pcp20 (表達FLP重組酶)轉(zhuǎn)化入 ￡.t'o/Z BmMultiBac-ZeoFRT菌株，涂布在Kan7Tetr/Ampr平板，30°C培養(yǎng)過夜 后，挑取數(shù)個單克隆在LB液體培養(yǎng)基(Kan7Tef)中42。C、 200rpm振蕩培養(yǎng)。 以M13通用引物對菌液進行PCR擴增驗證可以得到300bp左右的片段，得到 含有完整Bacmid且基因組宿主菌基因組""Tn7封閉的受體BmDH10bacA Tn7。
(3)重組桿狀病毒的獲得
按照Bac-to-Bac手冊中的方法，重組供體pRCDM-gfp轉(zhuǎn)座到受體 BmDH10BacATn7感受態(tài)中，取合適數(shù)量的轉(zhuǎn)化液(約lOOpl)涂布于Kan7Gm7Tet7X-gal/IPTG LB固體平板上，37。C培養(yǎng)48h后平板上共長出47 個單克隆，全部是白斑，隨即挑取12個單克隆在液體培養(yǎng)基中37'C、 200rpm 振蕩培養(yǎng)。如圖3所示，用M13通用引物進行PCR驗證，12個單克隆都擴 增出與理論值(3100bp)相符的條帶，說明pRCDM-gfp轉(zhuǎn)座BmDH10BacA Tn7可以獲得100%的轉(zhuǎn)作效率。
(4)重組桿狀病毒DNA的獲得及在細胞中的表達
按照常規(guī)堿裂解方法從大腸桿菌中制備重組BmBacmid-gfp DNA，使用 lipfectin2000將其轉(zhuǎn)染進BmN細胞中。如圖4所示，轉(zhuǎn)染后3 5天，置于倒 置熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光的表達情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后第4 5 天，有大量的細胞發(fā)出綠色熒光。
實施例2:以R6Ky作為復(fù)制子的供體質(zhì)?？梢蕴岣咿D(zhuǎn)座效率
(1) 供體質(zhì)粒pRCDM的構(gòu)建按照實施例1中的1步驟制作。
(2) 重組桿狀病毒的獲得及轉(zhuǎn)座效率比較
按照Bac-to-Bac手冊中的方法，我們將0. lng供體質(zhì)粒pRCDM和pFastBac 分別轉(zhuǎn)座到BmDH10Bac感受態(tài)中，取轉(zhuǎn)化液的1/5 (100^1)涂布于 Kan7Gm7Tet7X-gal/IPTG LB固體平板上，37。C培養(yǎng)48h待藍白斑明顯后，分 別統(tǒng)計每個平板上的白色菌斑和藍色菌斑的數(shù)量，計算轉(zhuǎn)座效率。統(tǒng)計結(jié)果顯 示(1)pFastBac轉(zhuǎn)座BmDH10Bac:共得到菌落約有300個，其中白斑17個。 (2)pRCDM轉(zhuǎn)座BmDH10Bac:共得到菌落約有230個，其中白斑152個。使 用以R6KY作為復(fù)制子的供體質(zhì)?？梢允罐D(zhuǎn)座效率(白斑率)從5.7%提高 到66%。
實施例3:封閉宿主菌基因組W汀n7的受體可以提高轉(zhuǎn)座效率
(1) 受體BmDH10BacATn7的構(gòu)建按照實施例1中的2步驟制作。
(2) 重組桿狀病毒的獲得及轉(zhuǎn)座效率比較
按照Bac-to-Bac手冊中的方法，我們將O.lng供體質(zhì)粒pFastBac分別轉(zhuǎn) 座到受體BmDH10Bac和BmDH10BacATn7感受態(tài)中，取轉(zhuǎn)化液的1/5( lOO)al) 涂布于Kan7Gm7Tet7X-gal/IPTG LB固體平板上，37。C培養(yǎng)48h待藍白斑明顯 后，分別統(tǒng)計每個平板上的白色菌斑和藍色菌斑的數(shù)量，計算轉(zhuǎn)座效率。統(tǒng)計 結(jié)果顯示(1)pFastBac轉(zhuǎn)座BmDH10Bac:共得到菌落約有300個，其中白斑
17個。G)pFastBac轉(zhuǎn)座BmDH10BacATn7:共得到菌落約有260個，其中白 斑63個。使用封閉宿主菌基因組""Tn7的受體可以使轉(zhuǎn)座效率(白斑率)從 5.7%提高到24%。
權(quán)利要求
1.一種零背景構(gòu)建重組桿狀病毒的方法，其特征在于該構(gòu)建方法按下列步驟進行(1)構(gòu)建以R6Kγ作為復(fù)制子的供體質(zhì)粒，并按常規(guī)方法引入外源基因；(2)封閉DH10Bac宿主菌基因組上的attTn7受體位點，獲得DH10Bac△Tn7；(3)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化重組供體質(zhì)粒進入DH10Bac△Tn7獲得重組桿狀病毒；(4)常規(guī)方法制備重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。
全文摘要
本發(fā)明是一種零背景構(gòu)建重組桿狀病毒的方法。具體步驟為(1)構(gòu)建以R6Kγ作為復(fù)制子的供體質(zhì)粒，并按常規(guī)方法引入外源基因；(2)封閉DH10Bac宿主菌基因組上的attTn7受體位點，獲得DH10BacΔTn7；(3)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化重組供體質(zhì)粒進入DH10BacΔTn7獲得重組桿狀病毒；(4)常規(guī)方法制備重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。本發(fā)明利用以R6Kγ為復(fù)制子構(gòu)建條件限制型供體質(zhì)粒，同時封閉DH10Bac宿主菌基因組上的attTn7重組位點，只需常規(guī)轉(zhuǎn)化即可獲得重組桿狀病毒，并且由于其超過99％的陽性重組率，無須復(fù)雜的PCR驗證和繁瑣的空斑純化，做到零背景真正高效快速的構(gòu)建重組桿狀病毒，促進桿狀病毒表達系統(tǒng)的廣泛利用。
文檔編號C12N15/866GK101372685SQ20081014064
公開日2009年2月25日 申請日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者劉宗才, 姚倫廣, 孫京臣, 張二輝, 張紅玲 申請人:南陽師范學(xué)院