專利名稱：侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組桿狀病毒粒子方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白工程領(lǐng)域，具體是一種侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組 桿狀病毒粒子的方法。
背景技術(shù)：
因具有對人及哺乳動物安全、超強(qiáng)的多角體啟動子(pP。,驅(qū)動外源基因在昆 蟲細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方便、病毒操作簡單、克隆外源片段能力大
(30-50kb)、表達(dá)產(chǎn)物具有正確后加工等特點(diǎn)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BES， Baculovirus Expresson System)已經(jīng)成為表達(dá)真核生物基因的優(yōu)秀表達(dá)系統(tǒng) 之一。目前，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的來源遍及病毒、細(xì)菌、真 菌、動物和植物等各種生物，其應(yīng)用范圍涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)與蛋 白質(zhì)之間相互作用方面的基礎(chǔ)研究和疫苗生產(chǎn)、疾病診斷以及病毒殺蟲劑的改 良等。目前主要使用兩種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)， 一種為商業(yè)化的AcNPV-sf9或者 AcNPV-High5系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用重組AcNPV在離體培養(yǎng)細(xì)胞sf9或者High5中 進(jìn)行外源基因表達(dá)。另外一種就是BmNPV-家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用重組 BmNPV在家蠶活體內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)。家蠶飼養(yǎng)在我國具悠久的歷史，其培養(yǎng)方 式簡單，成本較低，其成本為細(xì)胞培養(yǎng)的1/10，而蛋白表達(dá)量則為培養(yǎng)細(xì)胞的 10倍左右，因此桿狀病毒一家蠶表達(dá)系統(tǒng)在經(jīng)濟(jì)高效大量表達(dá)外源蛋白方面具 有極為誘人的前景和優(yōu)勢。
無論何種重組桿狀病毒，最后都必須通過將提取的重組病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲 細(xì)胞產(chǎn)生桿狀病毒粒子，以達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互
作用研究和疫苗生產(chǎn)、疾病診斷以及病毒殺蟲劑的改良等應(yīng)用。目前將DNA載 體(包括BacmidDNA)轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲宿主細(xì)胞的方法有脂質(zhì)體(lipofectin)介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，磷酸鈣一DNA共沉淀法和顯微注射法。其中磷酸鈣一DNA共沉淀 法成本最低，對DNA質(zhì)量要求非常高，而且對操作以及PH值要求嚴(yán)格，PH值 微小的改變就可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率急劇下降，因此總體轉(zhuǎn)染效率不高，重復(fù)性較差， 轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定。脂質(zhì)體(lipfectin)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法簡單，且轉(zhuǎn)化常規(guī)小質(zhì) 粒效率較高(40-80%)，而轉(zhuǎn)染100kb以上的大質(zhì)粒的效率相對較低(5 —10%)。 但是脂質(zhì)體價(jià)格極其昂貴，實(shí)驗(yàn)成本太高，和磷酸鈣轉(zhuǎn)染一樣，依然需要提取 和精制高質(zhì)量DNA，再與脂質(zhì)體進(jìn)行混合，轉(zhuǎn)染過程比較復(fù)雜耗時(shí)。顯微注射法 操作過程煩瑣，需要價(jià)值上百萬的顯微操作系統(tǒng)支持，成本極高，和操作者的 經(jīng)驗(yàn)密切相關(guān)，主要用于單細(xì)胞注射試驗(yàn)，普通實(shí)驗(yàn)室根本不可能使用。無論 是磷酸鈣還是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，都需要制備高純度的DNA和試劑按一定的比例進(jìn) 行混合，讓DNA與脂質(zhì)體或者磷酸鈣形成復(fù)合體，再經(jīng)過復(fù)雜的轉(zhuǎn)染操作過程 才能轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。因此現(xiàn)有的這幾種DNA進(jìn)入昆蟲宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法都有其 局限性，限制了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的廣泛利用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種避免復(fù)雜昂貴的昆蟲 細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程，從而經(jīng)濟(jì)、快速、高效侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組桿狀病毒粒子的 方法。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所述的侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組桿狀病毒粒子 的方法按下述步驟實(shí)現(xiàn)(1)構(gòu)建DAP營養(yǎng)缺陷型菌株Ec^/AASDDH10B; (2)將Bacmid和轉(zhuǎn)座輔助質(zhì)粒以及表達(dá)侵染蛋白助手質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)Eo;//
AASDDH10B，構(gòu)建新的受體菌AASD DH10Bac/PGB2Qinv; (3)引入外源基 因獲得重組AASDDH10Bac/PGB21iinv; (4)重組AASDDH10Bac/PGB2ilinv
直接感染與桿狀病毒對應(yīng)的昆蟲細(xì)胞從而獲得重組桿狀病毒粒子。
本發(fā)明的理論依據(jù)asd是編碼二氨基庚二酸的基因，是細(xì)胞壁合成的重 要成分，在確實(shí)asd基因的情況下，細(xì)菌必須補(bǔ)加DAP (二氨基庚二酸)以維 持細(xì)菌的生存和繁殖。Inv基因來自Yersinia pesudotuberculosis的基因組， 編碼103kDa的細(xì)菌夕卜膜侵染蛋白Invasin， Yersinia pesudotuberculosis可 以感染人和動物，其感染主要方式是通過侵染蛋白Irwasin與ei受體家族的 結(jié)合，幫助細(xì)菌進(jìn)入人或哺乳動物細(xì)胞。釆用缺失大腸桿菌DH10B基因組中的 asd基因，使大腸桿菌細(xì)胞壁合成受阻，大腸桿菌菌液和昆蟲細(xì)胞混合后，通 過PGB2ftinv質(zhì)粒表達(dá)的Iiivasin蛋白，與昆蟲細(xì)胞上的受體結(jié)合，通過受體 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，大腸桿菌進(jìn)入昆蟲細(xì)胞，然后不再對其補(bǔ)加DAP，大腸桿菌 在細(xì)胞內(nèi)裂解，釋放出DNA感染昆蟲細(xì)胞。 采用上述技術(shù)方案的有益效果
該方法可以不需要提取和純化Bacmid DM,只需要將攜帶重組Bacmid的細(xì) 菌和昆蟲細(xì)胞按一定的比例直接混合就可以獲得感染性重組桿狀病毒粒子。在 侵染蛋白(invision protein)的幫助下，直接使用攜帶目的重組桿狀病毒 Bacmid DNA的細(xì)菌感染昆蟲細(xì)胞，從而直接獲得重組病毒粒子。從細(xì)菌到病毒， 一步到位，省去了重組Bacmid的提取、純化精制、Bacmid DNA與轉(zhuǎn)染試劑的 混合等復(fù)雜的轉(zhuǎn)染程序，而生產(chǎn)重組病毒的效率為常規(guī)轉(zhuǎn)染的4倍。因此該方 法十分方便，快速和經(jīng)濟(jì)，為大規(guī)模構(gòu)建重組病毒表達(dá)外源蛋白打下基礎(chǔ)，是 一種極具應(yīng)用前景的新技術(shù)。


圖1是高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建含重組Bacmid及直接生產(chǎn)重組病毒過程示意圖； 圖2是侵染蛋白輔助攜帶重組Bacmid-red的細(xì)菌在sf21細(xì)胞中直接生產(chǎn)
病毒粒子；其中(A)是543nm熒光觀察感染72小時(shí)后的sf21細(xì)胞，(b)是同
一視野下普通光下觀察感染72小時(shí)后的sf21細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。 應(yīng)當(dāng)說明的是，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù) 范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，按照常規(guī)條件如J.薩姆布 魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版〉；孫明主編，高 等教育出版社，2006，基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚倫廣編著)； 黎路林編著，華中師范大學(xué)出版社，1996，桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，或按照制 造廠商的操作指南所建議的方法進(jìn)行。 實(shí)施例1:
構(gòu)建AASDAcDH10Bac/PGB2Qinv以及獲得病毒粒子的方法 1. DAP營養(yǎng)缺陷型菌株AASD DH10B的構(gòu)建
使用髙效的GET重組系統(tǒng)進(jìn)行五."/,'011108染色體中asd基因缺失。以 pcpl5 (兩側(cè)有FRT序列的KnO為模板，擴(kuò)增出帶50bp同源重組臂和FRT序 列的卡那抗性基因表達(dá)盒Krf。引物設(shè)計(jì)為ASD50UP:GAGACC GGCACAT TTATACA GCACACATCTTTGCAGGAAAAAAACGCTTAGAATTCGAGCTCGGTAC CCGGG (下劃線表示asd 基因50bp同源左臂)和ASD50DOWN: ASD50D0WN:CTCCTG TATTACGCACTAACAG GGGCGGCATCGCGCCCCAGATTMTGACTTA AGCTTAAM GCGCTCTGM (下劃線為asd基
因50bp同源右臂)。以質(zhì)粒pcpl5為模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為1.6kb (50bp LHA-FRT-knr-FRT-50bp RHA) , PCR產(chǎn)物首先使用Dpnl充分酶切，去掉可能存在 的模板質(zhì)粒，然后經(jīng)凝膠回收備用。
壯觀霉素抗性質(zhì)粒pML104含有由半乳糖啟動子(尸7ac)控制的重組酶基因 r^/和《鄉(xiāng)，經(jīng)CaCh轉(zhuǎn)化進(jìn)DH10B。將DH10B/pml104于30'C培養(yǎng)到0D, 為0.2，加入IPTG (0.4mM)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，以誘導(dǎo)重組酶rec/和ga/B表達(dá)。 然后將上述兩則含50bp同源重組臂和FRT序列的卡那抗性基因PCR產(chǎn)物(50bp LHA-FRT-kn-FRT-50bp RHA) 電轉(zhuǎn)化進(jìn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的DH10B菌株中，經(jīng)Kn+ 平板(補(bǔ)加DAP) 42'C篩選出陽性菌落，并經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證。用42'C培養(yǎng)目的是 為了去掉溫度敏感型質(zhì)粒pML104。菌落PCR引物為，Asdshortup: GAG ACCGGCACATTTATACA ; Asdshort down: CTCCTGTATTACGCA CTMC。大腸桿菌基 因組中asd基因大小為1. 2kb，而含F(xiàn)RT序列的Knr大小為1. 6 kb。為方便以 后Bacmid(kn')的引入，需要利用FLP重組酶將Krf去掉。將能表達(dá)FLP位點(diǎn)特 異性重組酶和溫度敏感型質(zhì)粒pcp20轉(zhuǎn)化進(jìn)經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證的菌落，篩選出 卡那抗性基因被重組掉的陽性菌落(Krf, Amp+)，然后42'C培養(yǎng)去掉pcp20 。 經(jīng)菌落PCR進(jìn)一步確定陽性菌株，所得菌株命名為AasdDHlOB。
2. 受體菌AASDAc DH10 Bac/PGB2Qinv的構(gòu)建
將AcBacmid ( Knr，購自Invitrgen Bac-to-Bac系統(tǒng))和轉(zhuǎn)座輔助質(zhì)粒 pHelper(提供轉(zhuǎn)座酶，Tef)以及表達(dá)侵染蛋白助手質(zhì)粒PGB2ftinv (Patrice Courvalin提供)電轉(zhuǎn)化進(jìn)A coh' AASDDH10B，在Kn/Tet/Sp/IPTG/ X-gal/DAP 平板上挑取藍(lán)色陽性菌落，獲得新的轉(zhuǎn)座受體系統(tǒng)AASDAcDHlOBac。
3. 重組AASD AcDH10Bac/PGB2ftinv的獲得
pDsRed經(jīng)BatnHI和Notl酶切，回收紅色熒光蛋白基因red片段，按照 常規(guī)方式克隆到載體pFastBacI，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacI-red，按照 Bac-to-Bac操作流程獲得陽性白斑菌落，注意在培養(yǎng)基中補(bǔ)加DAP。
4.重組AASDAcDH10Bac/PGB212inv直接感染Sf21細(xì)胞獲得重組桿狀病 毒粒子。
如圖(1)所示，挑取含重組Bacmid和助手質(zhì)粒PGB2Qinv白色單菌落， 接種到5ml含kn (終濃度50ug/ml)和DAP (0.5mM)的LB培養(yǎng)基中，于37'C 200rpm搖床培養(yǎng)到OD值約0. 4左右，無菌條件下取400ul菌液至滅菌的1. 5ml Eppendorf ， 2500rpm離心5min ,棄上清。無菌條件下加入lml無血清無雙抗 的grace培養(yǎng)基(含0. 5mM DAP)重懸沉淀。Sf21細(xì)胞置六孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞 匯片90%左右，去上清，加入500ul上述菌液和500ul grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合 液感染昆蟲細(xì)胞(moi=100)。吸附兩小時(shí)后，吸走上清，用lml無血清，無雙 抗grace培養(yǎng)基洗兩次，加入lml含雙抗，慶大霉素和10%血清的grace培養(yǎng) 基，4天后即可收獲重組病毒粒子上清。
重組病毒在細(xì)胞中的表達(dá)
選擇重組Bacmid-red的陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，按照上述方法轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞 后3 — 5天，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中紅色熒光的表達(dá)情況。如圖2-A 所示，轉(zhuǎn)染后第4-5天，有大量的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，而對照圖2-B則沒有細(xì) 胞產(chǎn)生熒光。
權(quán)利要求
1.一種侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組桿狀病毒粒子方法，其特征在于該方法按下列步驟進(jìn)行(1)構(gòu)建DAP營養(yǎng)缺陷型菌株E.coli ΔASDDH10B；(2)將Bacmid和轉(zhuǎn)座輔助質(zhì)粒以及表達(dá)侵染蛋白助手質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli ΔASD DH10B，構(gòu)建新的受體菌ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv；(3)引入外源基因獲得重組ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv；(4)重組ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv直接感染與桿狀病毒對應(yīng)的昆蟲細(xì)胞從而獲得重組桿狀病毒粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了侵染蛋白介導(dǎo)生產(chǎn)重組桿狀病毒粒子方法，其按下列步驟進(jìn)行(1)構(gòu)建DAP營養(yǎng)缺陷型菌株E.coli ΔASD DH10B；(2)將Bacmid和轉(zhuǎn)座輔助質(zhì)粒以及表達(dá)侵染蛋白助手質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli ΔASD DH10B，構(gòu)建新的受體菌ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv；(3)引入外源基因獲得重組ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv；(4)重組ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv直接感染與桿狀病毒對應(yīng)的昆蟲細(xì)胞獲得重組桿狀病毒粒子。本發(fā)明避免了傳統(tǒng)方法中DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的局限性，做到真正經(jīng)濟(jì)、快速、高效，有利于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的廣泛利用。
文檔編號C12N15/866GK101372686SQ20081014064
公開日2009年2月25日 申請日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者劉宗才, 姚倫廣, 孫京臣, 張二輝, 張祥滿, 闞云超 申請人:南陽師范學(xué)院