專利名稱：：耐高溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程酶制劑的生產(chǎn)方法，具體涉及一種耐高溫a-淀粉酶的生產(chǎn)方法。技術(shù)背景耐高溫a-淀粉酶作為一種新型酶制劑在發(fā)酵與糧食深加工工業(yè)有廣泛的應(yīng)用和良好的市場前景，目前廣泛用于酒精、啤酒、味精、有機酸、淀粉糖及制藥等行業(yè)，其產(chǎn)量和銷售額逐年增加。我國從80年代起，開始耐高溫a-淀粉酶的生產(chǎn)技術(shù)研究，上海工業(yè)微生物研究所以地衣芽孢桿菌為出發(fā)菌株通過誘變處理，使產(chǎn)酶單位由l-2單位/毫升提高到100單位/毫升左右。直到1989年開始引進(jìn)國外菌種進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)過這十幾年的努力，發(fā)酵活力從不足500u/ml提高到8000u/ml，個別廠家達(dá)到8500-9000u/ml，但這與美國、丹麥等國家的耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵水平25000u/ml相比還有很大差距。目前，國內(nèi)對耐高溫a-淀粉酶的研究多集中于菌株傳統(tǒng)誘變選育或通過基因工程構(gòu)建基因工程菌研究上，對發(fā)酵工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究的不多，相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。林劍、崔京春等(無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2003年七月第22巻期)通過對培養(yǎng)劑配方或發(fā)酵工藝的調(diào)整，使發(fā)酵活力有所提高，但未對培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝同時進(jìn)行優(yōu)化，活力提高也未超過10%;余詩慶等(食品與發(fā)酵工業(yè),2007年第33巻第七期)通過搖瓶實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，在50L全自動發(fā)酵罐進(jìn)行了驗證，發(fā)酵活力提高了14%，達(dá)到14900u/ml，而沒有進(jìn)行更大的中試和工業(yè)化試生產(chǎn)。而中國專利2007100361599報道了一種高活性、高純度耐高溫a-淀粉酶生產(chǎn)工藝，采用二次發(fā)酵，基礎(chǔ)料加補料、脈沖進(jìn)氨，以熟豆粕為氮源的工藝，采用控制發(fā)酵溫度43i:，PH6.8進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)絮凝、壓濾、循環(huán)初濾、精濾得耐高溫a-淀粉酶產(chǎn)品，其工藝較為復(fù)雜，使其規(guī)?；茝V受到影響。目前，在耐高溫a-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，由于缺少系統(tǒng)的理論依據(jù)，生產(chǎn)廠家多根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗來指導(dǎo)生產(chǎn)，生產(chǎn)管理和技術(shù)指導(dǎo)盲目性大，加之耐高溫a-淀粉酶屬于中性發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵成功率不高，造成生產(chǎn)成本偏高，市場競爭力不強。適時開展耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵工藝技術(shù)系統(tǒng)研究意義重大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種以玉米淀粉和玉米粉為碳源，對培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝同時優(yōu)化，工藝條件簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)的高活性、耐高溫a-淀粉酶新工藝。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案通過如下步驟實現(xiàn)1、選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，購于廣州微生物研究所。2、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉6%10%，玉米漿1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氫鉀0.3%0.6%，磷酸氫二鉀0.5%2%，檸檬酸鈉0.1%0.3%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.2—6.5。用茄子瓶接入種母，溫度37±1°C，通風(fēng)量25-40m3/h，pH值6.4，培養(yǎng)時間24-36小時。3.35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%,豆粕1%8%，玉米漿2%5%，磷酸二氫鉀0.1%0.8%，磷酸氫二鉀0.8%2%，檸檬酸鈉0.05%0.4%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，pH6.2—6.4。溫度42土1。C，風(fēng)量400—1000m3/h，pH值6.4—6.8，培養(yǎng)時間80—100小時；在上述條件下補料分批發(fā)酵以淀粉濃度為150280g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比40%70%的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補料物，在DE值降至10~60mg/ml時以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補料，維持發(fā)酵液中DE值約為10~60mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到220320g/L時停止補料。4.提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用國外進(jìn)口超濾膜濃縮設(shè)備(超濾膜系美國星達(dá)公司生產(chǎn)，UF809型,截留分子量為10000)，加裝料液循環(huán)冷卻裝置進(jìn)行超濾，保持料液濃縮過程中溫度20°C-45°C，以減少酶活性損失；最后采用精濾板框過濾機，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出高質(zhì)量成品。本發(fā)明有益效果在于l.以產(chǎn)耐高溫a-淀粉酶的地衣芽孢桿菌為研究對象，通過大量實驗研究，優(yōu)化了發(fā)酵工藝技術(shù)，探討了耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基初始DE值對發(fā)酵的影響，以及發(fā)酵過程中溶氧、PH值等各種參數(shù)的變化與控制，掌握了該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶規(guī)律；2.采用間歇補料分批發(fā)酵工藝生產(chǎn)耐高溫d-淀粉酶，經(jīng)過多批次的工業(yè)化生產(chǎn)試驗，發(fā)酵單位最高達(dá)到13480u/ml，平均發(fā)酵產(chǎn)酶水平12360u/ml，較工藝優(yōu)化前的發(fā)酵水平7982u/ml提高54.5%;每標(biāo)噸酶消耗淀粉量19.8kg，較分批發(fā)酵24.8kg減少5kg，形成了一套完整的耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵補料工藝，實現(xiàn)了年產(chǎn)2000噸耐高溫a-淀粉酶工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)；3.開發(fā)出酶活力在40000u/ml的成品新劑型，填補了國內(nèi)耐高溫a-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml劑型而沒有40000u/ml劑型的空白；4、產(chǎn)品提取工藝中增加了二次過濾、精濾及硅藻土預(yù)涂工藝過濾除菌，解決了產(chǎn)品耐溫性差、細(xì)菌總數(shù)居高不下難題，并開發(fā)出高活性產(chǎn)品。具體實施方式為對本發(fā)明進(jìn)行更好的說明，舉實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明工藝1、選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶能力為6000u/ml，購于廣州微生物研究所。2、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基培養(yǎng)條件玉米淀粉8%，玉米漿3%，豆粕5%，磷酸二氫鉀0.4%，磷酸氫二鉀1%，檸檬酸鈉0.14%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.5。用茄子瓶接入種母，溫度37土rC，通風(fēng)量40mVh，pH值6.4，培養(yǎng)時間30小時。3、35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基培養(yǎng)條件玉米淀粉25%，玉米粉10%，豆粕5%，玉米漿2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，磷酸氫二鉀1%，檸檬酸鈉0.2%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，pH6.4;溫度42士rC，風(fēng)量800m3/h，pH值6.5，培養(yǎng)時間102小時。4、采用35噸發(fā)酵罐進(jìn)行補料分批發(fā)酵，依據(jù)上述確定的參數(shù)，選擇以淀粉濃度為240g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比60%的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補料物，在DE值降至50mg/ml時以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補料，維持發(fā)酵液中DE值約為50mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到300g/L時停止補料。5、提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用國外進(jìn)口超濾膜濃縮設(shè)備(超濾膜系美國星達(dá)公司生產(chǎn)，UF809型,截留分子量為10000)，加裝料液循環(huán)冷卻裝置進(jìn)行超濾，保持料液濃縮過程中溫度35°C，以減少酶活性損失；最后采用精濾板框過濾機，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出高質(zhì)量成品。硅藻土選用江西萍鄉(xiāng)助濾劑廠生產(chǎn)的300#硅藻土；精濾板框過濾機，是板框過濾機中的一種，它是利用特殊工藝材料編織而成的濾布(本試驗選用杭州市興源板框過濾機廠提供的維尼綸合成纖維專用濾布)作過濾介質(zhì)，并配以硅藻土預(yù)涂工藝，達(dá)到除菌目的，其原理是利用硅藻土較大的比表面積(10-20m2/g)，較少粒度2-100um，這種顆粒具有較大的吸附和滲透能力，能濾降0.1-1.0um粒子和菌體，在以濾布為支持介質(zhì)的表面上預(yù)涂硅藻土薄層(預(yù)涂層)以保護(hù)支持介質(zhì)的毛細(xì)孔道在較長時間內(nèi)不被懸浮液中的固體粒子所堵塞，從而提高過濾速度，達(dá)到穩(wěn)定過濾除菌效果。對比實驗實施例1.分批發(fā)酵與補料分批發(fā)酵試驗結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表表示不同工藝條件下，二者的變化趨勢基本相同,但補料分批發(fā)酵除發(fā)酵周期增加20h外，其余的酶活力、放罐體積、標(biāo)噸酶耗淀粉量等結(jié)果都明顯好于分批發(fā)酵。每標(biāo)噸酶耗淀粉量減少5kg，能耗也大幅下降，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著。補料分批發(fā)酵最終產(chǎn)酶12360u/ml，而分批發(fā)酵的最終酶活只有7982u/ml。這主要是由于分批發(fā)酵后期，原料已基本消耗，沒有足夠的原料用于產(chǎn)物合成，而補料分批發(fā)酵中原料能更加合理地被菌體利用，從而合成更多的耐高溫a-淀粉酶。1.國內(nèi)外同類產(chǎn)品對比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>優(yōu)化了耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵工藝技術(shù)，并開發(fā)出酶活力在40000u/ml的成品劑型，實現(xiàn)了年產(chǎn)2000噸耐高溫a-淀粉酶的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。與國內(nèi)外同類生產(chǎn)廠家相比較，優(yōu)化后的工藝技術(shù)更科學(xué)合理，開發(fā)的新劑型產(chǎn)品性能穩(wěn)定，填補了國內(nèi)耐高溫a-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml劑型而沒有<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>主除菌率=(精濾前細(xì)菌總數(shù)一精濾后細(xì)菌總數(shù))/精濾前細(xì)菌總數(shù)X100X上述試驗可以看出，通過精濾工藝成品中酶活力基本沒有損失，雜菌數(shù)大幅度降低，細(xì)菌總數(shù)控制在5000個/ml以下(標(biāo)準(zhǔn)為5X104個/ml)，除菌率穩(wěn)定在95%以上。產(chǎn)品經(jīng)成品精濾除菌后，常溫存放90天，雜菌數(shù)幾乎沒有增長或增長甚少，達(dá)到了試驗設(shè)計的目的，效果明顯，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。權(quán)利要求1、耐高溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝，采用地衣芽孢桿菌為菌株，通過一級種子罐發(fā)酵、大罐發(fā)酵、過濾、成品處理制得，其特征在于，通過如下步驟實現(xiàn)(1)選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)；(2)、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉6％～10％，玉米漿1％～3％，豆粕2％～5％，磷酸二氫鉀0.3％～0.6％，磷酸氫二鉀0.5％～2％，檸檬酸鈉0.1％～0.3％，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入種母，溫度37±1℃，通風(fēng)量25-40m3/h，pH值6.4，培養(yǎng)時間24-36小時；(3)、35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉15％～30％，玉米粉5％～10％，豆粕1％～8％，玉米漿2％～5％，磷酸二氫鉀0.1％～0.8％，磷酸氫二鉀0.8％～2％，檸檬酸鈉0.05％～0.4％，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，pH6.2-6.4；溫度42±1℃，風(fēng)量400-1000m3/h，pH值6.4-6.8，培養(yǎng)時間80-100小時；在上述條件下補料分批發(fā)酵以淀粉濃度為150～280g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比40％～70％的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補料物，在DE值降至10～60mg/ml時以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補料，維持發(fā)酵液中DE值約為10～60mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到220～320g/L時停止補料；(4)、提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用超濾膜濃縮，保持料液濃縮過程中溫度20℃--45℃；最后采用精濾板框過濾機，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出成品。全文摘要本發(fā)明屬生物工程酶制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法。該生產(chǎn)方法采用地衣芽孢桿菌為菌株，以玉米為碳源、氮源，通過一級種子罐發(fā)酵、大罐補料分批發(fā)酵、精濾、殺菌處理生產(chǎn)出耐高溫、高活性α-淀粉酶。發(fā)酵單位最高達(dá)到13480u/ml，平均發(fā)酵產(chǎn)酶水平12360u/ml，較工藝優(yōu)化前的發(fā)酵水平7982u/ml提高54.5％；每標(biāo)噸酶消耗淀粉量19.8kg，較分批發(fā)酵24.8kg減少5kg，形成了一套完整的耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵補料工藝，實現(xiàn)了耐高溫α-淀粉酶工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號C12N9/28GK101402948SQ20081014134公開日2009年4月8日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者崔躍遠(yuǎn),張新武,杜保安申請人:河南瑞馳生物科技有限公司