專利名稱：：破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl的RNA干擾靶點及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl(簡稱C1)序列上用于RNA干擾的干擾靶點，以及針對這些靶點的以各種方式獲得的小干擾RNA分子以及其在制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥是發(fā)病率高、死亡率高、保健費用消耗大的最常見的骨代謝疾病。據(jù)估計，半數(shù)以上的婦女和大約三分之一的男性在其生存期內(nèi)會發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折。骨折給人們的生活帶來極大的痛苦，輕者使人們生活質(zhì)量下降，重者將導(dǎo)致癱瘓(如股骨骨折)并由此引發(fā)很多并發(fā)癥甚至導(dǎo)致死亡。這些疾病的產(chǎn)生與破骨細(xì)胞(Osteoclast)的過度活躍有關(guān)。破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞(Osteoblast)是骨中的兩類重要細(xì)胞，分別負(fù)責(zé)骨吸收與骨形成，兩者之間的平衡保證了成年動物及人類骨量的恒定；然而在破骨細(xì)胞的活性大于成骨細(xì)胞活性的時候，破骨細(xì)胞對骨的吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成作用，導(dǎo)致骨密度下降最終出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，對于這些疾病的治療必須抑制破骨細(xì)胞的活性。破骨細(xì)胞皺褶緣V-ATP酶負(fù)責(zé)破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化過程，使骨去礦化并為蛋白酶降解骨有機(jī)成份提供酸性微環(huán)境。發(fā)明人通過Micrroarray數(shù)據(jù)分析首次發(fā)現(xiàn)C1在破骨細(xì)胞中高表達(dá)而不是C2，因此，C1是C亞基在破骨細(xì)胞中的特異亞型，即C1是破骨細(xì)胞V-ATP酶具有的特異亞基。抑制破骨細(xì)胞Cl的表達(dá)導(dǎo)致破骨細(xì)胞細(xì)胞外酸化和骨吸收功能下降。在多核破骨細(xì)胞中，骨吸收發(fā)生在致密的縫合區(qū)(sealingzone)內(nèi)，縫合區(qū)包圍著漿膜異化的皺褶緣?？p合區(qū)由含actin的黏附結(jié)構(gòu)，即podosome所構(gòu)成，這一結(jié)構(gòu)處于高度動態(tài)平衡中，podosome由小的絲狀肌動蛋白(F-actin)柱為中心，外周圍繞著蛋白如粘著斑蛋白(vinculin)和樁蛋白(paxillin)所構(gòu)成。從皺褶緣分泌的3質(zhì)子和酶被封閉在縫合區(qū)內(nèi)的吸收腔隙。但體外培養(yǎng)在玻璃或塑料表面的成熟破骨細(xì)胞，其podosome在細(xì)胞外周形成一條環(huán)形的帶狀結(jié)構(gòu)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抑制破骨細(xì)胞C1的表達(dá)使破骨細(xì)胞不能形成規(guī)則的絲狀肌動蛋白纖維環(huán)，即抑制破骨細(xì)胞C1的表達(dá)會導(dǎo)致破骨細(xì)胞縫合區(qū)形成缺陷。因此，Cl可以作為藥物靶點特異抑制破骨細(xì)胞的活性。本發(fā)明設(shè)計和體外慢病毒表達(dá)Cl-ShRNA用于抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，以達(dá)到治療骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl(簡稱C1)的RNA干擾靶點，針對該靶點設(shè)計人工序列，并將該序列在表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)獲得小干擾RNA分子(SiRNA)，并構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體。因此本發(fā)明的目的也在于提供針對Cl的小干擾RNA分子，包含該小干擾RNA分子的表達(dá)載體以及由其轉(zhuǎn)化的慢病毒表達(dá)載體，此外，由表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)生的、作為小干擾RNA分子前體的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子(ShRNA)也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的另一目的在于提供Cl的RNA干擾耙點在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一方面，根據(jù)破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl的mRNA序列體外合成抑制Cl基因表達(dá)的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)片段的DNA序列，并克隆到短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(ShRNA)的表達(dá)質(zhì)粒上，表達(dá)并篩選對破骨細(xì)胞吸收抑制作用較強的Cl-SiRNA，確定RNA干擾靶點序列，SEQIDNO.1~3為針對C1的RNA干擾靶點序列，優(yōu)選的RNA干擾靶點具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。SEQIDNO.4~5為針對干擾靶點序列1的設(shè)計的用于表達(dá)SiRNA的DNA序列，SEQIDNO.67是針對干擾靶點序列2設(shè)計的用于表達(dá)SiRNA的DNA序列，SEQIDNO.89是針對干擾靶點序列3設(shè)計的用于表達(dá)SiRNA的DNA序列，每對序列均為互補序列。具體序列見表1和表2.SiRNA分子為雙鏈RNA分子，一單鏈含有RNA靶點序和在3'末端的UU雙核苷酸尾(如SEQIDNO.IO所示)，另一單鏈為互補鏈，雙核苷酸尾UU同樣位于3'末端。SiRNA進(jìn)入細(xì)胞后直接干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。表1ClRNAi耙點序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2合成用于表達(dá)siRNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的RNA耙點序列SEQIDNO.3為具有19nt長度，在形成SiRNA分子后，3'端加上UU雙核苷酸尾構(gòu)成分別具有21bp的雙鏈RNA而發(fā)揮功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，增加或減少幾個堿基的SiRNA序列在基因沉默中可以具有同樣的功能，例如2123bp的SiRNA序列己被證明在其他基因的沉默中具有同樣功能(Nature2001，(411):24,494-98)。同樣可以理解的是，也可以設(shè)計更長的序列，通過在發(fā)揮功能時被剪切為短的RNA序列而發(fā)揮作用。體外合成的抑制CI基因表達(dá)的基因序列克隆到表達(dá)載體后，表達(dá)ShRNA，ShRNA含有干擾耙點序列、干擾耙點序列的反義序列、短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列(序列如SEQIDNO.11所示)。形成ShRNA序列的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列優(yōu)選采用九個堿基的loop環(huán)序列UUCAAGAGA，也可以用TTCGtetraloop(LeukemiaResearch30(2006)1013—1017)。短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，通過表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)生，發(fā)揮功能時需要細(xì)胞內(nèi)Dicer酶切成siRNA分子干擾基因的表達(dá)，圖1示出了通過合成序列克隆到表達(dá)載體，產(chǎn)生ShRNA，再加工成具有功能的SiRNA的過程。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供CI基因的RNA干擾靶點在制備骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA分子可抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，用于治療骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)手段為第一，在體外合成表達(dá)抑制CI基因表達(dá)的雙鏈SiRNA的DNA序列，并克隆到ShRNA表達(dá)質(zhì)粒上；1、SiRNA設(shè)計采用DharmaconsiDESIGNcenter(http:〃www.dharmacon.com)設(shè)計針對CImRNA的特異靶序列，選取特異性的耙序列3條，且靶序列與人的相應(yīng)靶序列80%—90%相似。2、單鏈SiRNA合成和純化由Invitrogen公司合成純化3、雙鏈SiRNA的制備和表達(dá)ShRNA克隆的構(gòu)建兩條互補的單鏈SiRNA經(jīng)加熱后退火處理形成雙鏈SiRNA，并將雙鏈SiRNA克隆到表達(dá)ShRNA的質(zhì)粒上。第二，用外源共表達(dá)Cl-Flag蛋白和Cl-ShRNA篩選有效的Cl-SiRNA。第三，通過破骨細(xì)胞功能實驗闡明Cl敲低后破骨細(xì)胞骨吸收能力缺陷的機(jī)制。1.破骨細(xì)胞細(xì)胞外酸化和骨吸收功能檢測體外破骨細(xì)胞功能實驗采用被廣泛使用的細(xì)胞外酸化功能和骨片吸收功能的檢測方法正常的破骨細(xì)胞具有細(xì)胞外酸化和骨吸收功能，破骨細(xì)胞質(zhì)子泵將細(xì)胞外酸化后吖啶橙染色呈橘紅色，被破骨細(xì)胞吸收后的骨片經(jīng)甲苯胺蘭染色后可以觀察到大量深藍(lán)色的骨吸收陷窩。在原代培養(yǎng)的破骨細(xì)胞中分別加入各種表達(dá)Cl-shRNA的慢病毒，3—5天后吖啶橙染色觀察細(xì)胞的細(xì)胞外酸化能力，及甲苯胺蘭染色觀察骨片上的陷窩數(shù)目及形態(tài)。2.破骨細(xì)胞絲狀肌動蛋白纖維環(huán)形成檢測本實驗采用廣泛應(yīng)用的絲狀肌動蛋白染色方法，成熟的破骨細(xì)胞經(jīng)固定和rhodaminephalloidin染色，在熒光顯微鏡下能看到發(fā)紅色熒光的絲狀肌動蛋白，培養(yǎng)在玻片上的功能正常的破骨細(xì)胞在細(xì)胞外周能看到絲狀肌動蛋白組成的規(guī)則的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所針對的藥物靶點Cl是由申請人首先發(fā)現(xiàn)它是破骨細(xì)胞骨吸收功能的必須基因。所以本發(fā)明所選定siRNA靶序列的是新的針對Cl的藥物靶點，且與人的相應(yīng)耙位置序列80%相似。本發(fā)明利用的RNAi技術(shù)的出現(xiàn)已有近20年，但是利用RNAi技術(shù)得到的實驗結(jié)果往往發(fā)表在影響力很高的期刊上；這也說明了RNAi在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用上的重要性。隨著人們對RNAi原理的了解和其應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，這一技術(shù)己經(jīng)突破了基礎(chǔ)研究的范圍，向著應(yīng)用邁進(jìn)。疾病治療領(lǐng)域的初期研究已經(jīng)顯示，由病毒介導(dǎo)的ShRNA表達(dá)抑制致病基因的表達(dá)這一技術(shù)由于其自身的優(yōu)勢必將成為藥物設(shè)計的新的增長點。而慢病毒表達(dá)ShRNA本身較腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒有很多優(yōu)勢，慢病毒可感染分裂或非分裂細(xì)胞及終末分化細(xì)胞，而逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂細(xì)胞，腺病毒可感染分裂或非分裂細(xì)胞。因此，相對于傳統(tǒng)的新藥研制來說，慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)有很多優(yōu)點針對性強，針對治病基因；特異性好；無需知道蛋白的三維結(jié)構(gòu)；無需篩選大量的候選化合物；它是利用哺乳動物自身的防御系統(tǒng)治療疾病，至今沒有發(fā)現(xiàn)副作用；作用時間長，它通過整合到細(xì)胞基因組中表達(dá)發(fā)揮作用，且機(jī)體有RNAi放大的本發(fā)明開創(chuàng)性的用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)抑制疾病基因的表達(dá)，可以說具有很強的前瞻性，表達(dá)特異ClshRNA的慢病毒感染骨髓細(xì)胞的技術(shù)可有望運用于研制慢病毒型生物制劑以治療骨質(zhì)疏松。同時，表達(dá)特異C1ShRNA的慢病毒感染腫瘤細(xì)胞也可有望抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明將為制藥業(yè)提供全新的思路。圖1為pSUPER-SiRNA質(zhì)粒的構(gòu)建；示出了針對靶序列3的SiRNA分子和ShRNA分子形成后的結(jié)構(gòu)圖2為PLB-SiRNA載體的構(gòu)建，將pSUPER-siRNA質(zhì)粒上的Hl-SiRNA序列克隆到pLB質(zhì)粒并取代U6啟動子；圖3為含有SiRNA的表達(dá)載體PLB-SiRNA載體結(jié)構(gòu)圖4為逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝；圖5為Westernblotting篩選有效的ClsiRNA序列及檢測Lenti-Cl敲低的效率；圖6為檢測Cl敲低后對破骨細(xì)胞的分化和成熟的影響；圖7為檢測Cl敲低后對破骨細(xì)胞細(xì)胞外酸化和骨吸收的影響；圖8為檢測Cl敲低后對絲狀肌動蛋白環(huán)形成的影響。具體實施例方式以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例中所使用各種培養(yǎng)基和試劑如無特別說明均為市售購買。實施例一原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)參照Yang，S.andLi，Y.P.(2007)J.BoneMiner.Res.,22,45-54原代培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為成熟破骨細(xì)胞。6-8周齡C57BL6小鼠，拉頸處死，常規(guī)消毒后，取其后肢股骨和脛骨放入冰預(yù)冷的含抗生素的RIMP-1640培液中。用剪刀和鑷子將骨表面的血管結(jié)締組織分離干凈，冰預(yù)冷的含抗生素的8RIMP-1640培液沖洗。剪刀剪去股骨和脛骨兩端，用無菌注射器(lml)將骨髓細(xì)胞吹入冰預(yù)冷的含10Q^FBS的a-MEM培液中。注射器針頭反復(fù)吸沖成單細(xì)胞懸液。4°C離心(1100rpmx6min)，用含M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)(R&Dsysyems)的a-MEM+10%FBS培液重懸細(xì)胞。細(xì)胞以l-2xl0V孔接種于24孔板，以lxl0V孔接種于6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)基為a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF。細(xì)胞在37。C、5。/。C02條件下培養(yǎng)4一6天獲的成熟的破骨細(xì)胞。實施例二抗體準(zhǔn)備合成多肽CI12EKTCQQTWEKLHAATTK28禾nAtp6vla(A),CQLLEDMQNAFRSLED""偶聯(lián)到KLH，免疫雄性新西蘭大白兔獲得抗Cl和A的多克隆抗體，抗GAPDH的單克隆抗體購自cellsignaling公司，抗Flag抗體和抗GFP抗體購自sigma。實施例三篩選有效的SiRNA序列采用DharmaconsiDESIGNcenter(http:〃www.dharmacon.com)設(shè)計小干擾siRNA，選三條特異的針對Atp6vlclmRNA的耙序列clsl:5'-UUCGUGACUUCCAGUAUAA-3，，c1s2:5，國UUGCGUGGAUUCAUAUAAA-3，，，cls3:5'-GAGUUGACUUGGUUACUUA-3,,陰性對照為特異針對LacZ基因mRNA的靶序列si-LacZ:5'-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3，?；瘜W(xué)合成的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的靶序列經(jīng)退火復(fù)性后連接到pSUPER載體(OligoEngine)上BglII/Hind111位點之間。短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(ShRNA)敲低Cl表達(dá)的效率檢測是通過在人胚腎細(xì)胞系293T(HEK293T,ATCCNo.CRL-11268TM)中共表達(dá)質(zhì)粒pFlag-CMV-4-Cl(Flag-Cl)和質(zhì)粒pSUPER-siRNA完成的。艮口用lipofectaminereagent(Invitrogen公司)將克隆有SiRNA的ShRNA表達(dá)質(zhì)粒與Flag-Cl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T胞，轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞(裂解液50mMTris-HCl，pH6.8,100mMdithiothreitol，2%SDS,0.001%bromphenolblue,10%glycerol),進(jìn)行蛋白印跡實驗(westernblotting)。結(jié)果顯示與siLacZ處理的細(xì)胞相比，三個ClSiRNA之一(cls3)能夠敲低Flag-Cl的表達(dá)98.8%，而其它兩個ClSiRNAs(clsl和cls2)分別敲低Cl的表達(dá)僅27。/。和34%(圖4A,B)。因此選擇SiRNA-cls3克隆到lentivirus載體pLB。實施例四包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒第一天(9-10am):293T細(xì)胞接種，每10cm培養(yǎng)皿接種2-2.5xl06293T細(xì)胞；第二天(9-10am):轉(zhuǎn)染，準(zhǔn)備鈣一磷酸沉淀(lml/10cmplate)Transfervector(PLB，Addgene)-20)igPackagingplasmid(dR8.2,Addgene)-15|igEnvelopeplasmid(vsvg，Addgene)-6pg力口2.5MCaCl250ul，力QddH20到500^1，混勻；加500^12xHBS，吹打混勻；室溫孵育20分鐘，將沉淀逐滴加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，混勻；轉(zhuǎn)染后6—8小時，換新鮮培液，6ml/plate;第四天(9-10am):收集病毒收集培養(yǎng)上清3000rpm/5min/RT離心上清0.45pm過濾，分裝，直接感染細(xì)胞或凍存于一80。C實施例五逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定第1天(9-Uam):在24孔板每個孔接種3xl04293T細(xì)胞，lml培液培養(yǎng)；第2天(4-6pm):計數(shù)一個孔的細(xì)胞(應(yīng)該6—8xl04)，4一6倍系列稀釋的病毒感染細(xì)胞，加4pg/nlpolybrene。第3天(9-12am):力[]lml培液；第5天觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)，并用FACS分析表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞比例，并計算滴度。實施例六逆轉(zhuǎn)錄病毒感染破骨細(xì)胞骨髓單個核細(xì)胞在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene(4嗎/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時。換新鮮培液(X-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF10繼續(xù)培養(yǎng)4—6天。收集破骨細(xì)胞蛋白(裂解液50mMTris-HCl,pH6.8,100mMdithiothreitol,2%SDS，0.001%bromphenolblue,10%glycerol),進(jìn)行蛋白印跡實驗(westernblotting)用于檢測CI敲低的效率。被病毒感染的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，病毒感染后2天在熒光顯微鏡下觀察發(fā)熒光的細(xì)胞，結(jié)果顯示病毒感染后幾乎所有細(xì)胞均發(fā)綠色熒光(圖6A)。Western-blotting蛋白印跡試驗結(jié)果顯示，與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞的CI表達(dá)水平相比，Lenti-Cl(靶序列為Cls3)感染破骨細(xì)胞后CI的表達(dá)顯著降低90%(圖5C,D)。說明表達(dá)特異針對C1的ShRNA的慢病毒感染破骨細(xì)胞后能顯著抑制C1的蛋白表達(dá)水平。實施例七TRAP染色固定破骨細(xì)胞后用Sigma的TRAP活性染色試劑盒染色，前體破骨細(xì)胞盒成熟的破骨細(xì)胞(多于三個核)呈現(xiàn)深紅色，并在光鏡下計數(shù)。每組十個視野被計數(shù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)i標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=10)。TRAP染色的結(jié)果顯示與lenti-LacZ處理后的細(xì)胞相似，Lenti-Cl處理后的細(xì)胞也能分化成熟為多核破骨細(xì)胞，且二者顯示相似的多核破骨細(xì)胞數(shù)目和形成百分比(圖6B，C，D)。說明CI敲低后并不影響骨髓單個核細(xì)胞分化成熟為多個核的破骨細(xì)胞。實施例八吖啶橙染色骨髓單個核細(xì)胞被接種在24孔板，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene(4嗎/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF繼續(xù)培養(yǎng)4天。破骨細(xì)胞在含5pg/m1吖啶橙的a-MEM中37°C孵育15分鐘，用a-MEM洗10minutes,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞(激發(fā)光490nm和吸收光525nm)。吖啶橙染色結(jié)果顯示與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞相比，Lenti-Cl感染的多核破骨細(xì)胞細(xì)胞橘紅色染色明顯減少，細(xì)胞外酸化明顯受抑制(圖7)。說明CI敲低后破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化功能明顯下降。li實施例九破骨細(xì)胞骨吸收功能分析破骨細(xì)胞骨吸收活性的分析通過分析吸收陷窩的形成來完成。骨髓單個核細(xì)胞被接種在放置于96孔板孔里的象牙骨片上，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene(4嗎/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10MFBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF繼續(xù)培養(yǎng)6天。6天后骨片在1MNH4OH的溶液里超聲出去細(xì)胞。無細(xì)胞的骨片經(jīng)1%toluidineblue(1%sodiumborate)染色1分鐘。吸收陷窩呈深藍(lán)色，并在光鏡下觀察，計數(shù)隨機(jī)視野下吸收面積占總視野面積的百分比，每組計數(shù)三個視野，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(11=3)。骨吸收實驗結(jié)果顯示與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞形成骨吸收陷窩(陷窩為深藍(lán)色)面積占隨機(jī)觀察視野面積的百分?jǐn)?shù)相比，Lenti-Cl感染的多核破骨細(xì)胞在象牙骨片上形成的吸收陷窩面積占隨機(jī)觀察視野面積的百分?jǐn)?shù)明顯減少(*P<0.05,n=3)，且Lenti-Cl感染的多核破骨細(xì)胞在象牙骨片上形成的吸收陷窩更淺(圖7)。說明C1敲低后破骨細(xì)胞骨吸收功能明顯下降。實施例十細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)染色骨髓單個核細(xì)胞被接種在24孔板，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene(4嗎/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF繼續(xù)培養(yǎng)4天。細(xì)胞在3.7%多聚甲醛中固定10分鐘；0.2%TritonX-100透膜處理10分鐘；用1%山羊血清和3%BSA室溫下封閉1小時；用2U/mlrhodaminephalloidin(MolecularProbes)室溫下孵育30分鐘；1pg/mlDAPI(Sigma)染核呈藍(lán)色；細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)染色結(jié)果顯示與表達(dá)特異LacZSiRNA的成熟破骨細(xì)胞形成絲狀肌動蛋白環(huán)相似，表達(dá)特異CISiRNA的成熟破骨細(xì)胞也能形成規(guī)則的絲狀肌動蛋白環(huán)。表明CI敲低不影響成熟破骨細(xì)胞骨絲狀肌動蛋白環(huán)的形成。12SEQUENCELISTING<U0〉浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司<120〉破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl的RNA干擾靶點及其應(yīng)用〈130〉ZJ188-08P103436<160>11<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉19<212〉腿〈213〉A(chǔ)rtificial<400〉1uucgugacuuccaguauaa19〈210〉2<211〉19〈212〉RNA<213>Artificial<400>2uugcguggauucauauaaa19<210>3<211〉19<212〉RNA<213>Artificial<220〉<221>misc一RNA<222>(1)..(19)<223>CIRNAi耙點序列<400〉3gaguugacuugguuacuua19〈210〉4<21D64<212〉隨〈213〉A(chǔ)rtificial〈400>4gatccccttcgtgacttccagtataattcaagagattatactggaagtcacgaatttttg60gaaa64<210>5〈211〉64<212>腿<213〉A(chǔ)rtificial<400>5agcttttccaaaaattcgtgacttccagtataatctcttgaattatactggaagtcacga60aggg64〈210〉6〈211〉64<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈400>6gatccccttgcgtggattcatataaattcaagagatttatatgaatccacgcaatttttg60g站a64〈210〉7<211>64<212>DNA<213>Artificial<400>7agcttttccaaaaattgcgtggattcatataaatctcttgaatttatatgaatccacgca60柳g<210〉8<211>64<212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial64〈400〉8gatccccgagttgacttggttacttattcaagagataagtaaccaagtcaa('tcttl:ttg60gaaa64〈210〉9〈211>64〈212>DNA<213〉A(chǔ)rtificial〈400〉9agcttttccaaaaagagttgacttggttacttatctcttgaataagtaaccaagtcaact60cggg<210〉<211〉<212>〈213〉<220〉〈221〉〈222〉<223〉1021RNAArtificialmisc—RNA(21)SiRNA單鏈〈400〉10gaguugacuugguuacuuau<210〉<211〉<212><213〉<220><221〉<222〉<223〉1149RNAArtificialmisc—隨(1)…(49)ShRNA6421〈400〉11gaguugacuugguuacuuauucaagagauaaguaaccaagucaacucuu49權(quán)利要求1、一種破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6v1c1的RNA干擾靶點，其特征在于其具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2、一種小干擾RNA分子，其為雙鏈分子，其中一單鏈含有權(quán)利要求l所示RNA靶點序列和在3，末端的UU雙核苷酸尾，另一單鏈為互補鏈。3、一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求2的小干擾RNA分子。4、權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于其具有圖3所示結(jié)構(gòu)。5、一種重組慢病毒載體，含有權(quán)利要求2的小干擾RNA分子。6、權(quán)利要求5所述的重組慢病毒載體，其特征在于所述慢病毒載體用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。7、權(quán)利要求l所述的破骨細(xì)胞V-ATP酶質(zhì)子泵亞基ATP6vlcl的RNA干擾靶點在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于以權(quán)利要求5所述的慢病毒載體作為破骨細(xì)胞吸收抑制劑。9、一種短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子，其至少含有權(quán)利要求1所述的RNA干擾靶點序列、短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及RNA干擾靶點序列的反義序列。10、權(quán)利要求9所述的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子，其特征在于進(jìn)一步在3'末端具有UU雙核苷酸尾。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及C1序列上用于RNA干擾的靶點，以及針對這些靶點的以各種方式獲得的SiRNA用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的新藥物。本發(fā)明通過慢病毒感染破骨細(xì)胞并表達(dá)ShRNA及體外基因敲低后破骨細(xì)胞功能檢測的方法篩選了C1基因上的RNA干擾的靶點。針對該靶點的ShRNA能夠明顯抑制C1蛋白質(zhì)的表達(dá)，并能穩(wěn)定抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化和骨吸收的能力，但不影響成熟破骨細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)的形成。依據(jù)這個靶序列可以制備生物藥品以治療骨質(zhì)疏松。文檔編號C12N15/11GK101638652SQ200810145868公開日2010年2月3日申請日期2008年8月7日優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日發(fā)明者豐盛梅,李亦平申請人:浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司