專利名稱：：琥珀酸放線桿菌菌種改組、選育方法以及用其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株具有較強鈉離子耐受性和產(chǎn)酸性能的琥珀酸放線桿菌Jcri"o^rc/〃wHwcd/wgew^CGMCC2653(即F3-10)，該菌株的選育方法及該菌株應(yīng)用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
背景技術(shù)：
：丁二酸，又稱琥珀酸(succinicacid)，分子式為(3411604，分子量為118.09，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。丁二酸是工業(yè)上一種重要的四碳化合物，它作為有機合成原材料，中間產(chǎn)物，以及專業(yè)化學(xué)制品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、塑料和材料工業(yè)。目前，丁二酸和它的大多數(shù)衍生物的生產(chǎn)還處在進一步研究和開發(fā)階段。丁二酸的生產(chǎn)可通過化學(xué)合成方法或者發(fā)酵方法來進行，用微生物發(fā)酵碳水化合物生產(chǎn)丁二酸的方法日益受到人們的重視。由于發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作為主要原料，因此微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸，具有成本低和不依賴石化原料的優(yōu)點，而且能利用二氧化碳，更加顯示了環(huán)境友好特征。丁二酸是許多嚴(yán)格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產(chǎn)物。本研究室從牛瘤胃中篩選得到一株產(chǎn)丁二酸菌株，經(jīng)鑒定為琥珀酸放線桿菌J"/w)kzc///^^cc^oge""CGMCC1593。已有研究表明，鈉離子濃度對丁二酸產(chǎn)生菌如J朋eTOWa^n7/wm5wcdmY^ra^cera等的生長和產(chǎn)酸具有一定的影響。同時，Na+在跨膜pH梯度、細(xì)胞滲透壓和胞內(nèi)pH調(diào)控中都起著重要的作用。據(jù)Lee等人報道，在J"wra6/o^/n7/w肌做cc/rtfc，o^cmy發(fā)酵過程中，當(dāng)NaCl濃度超過4.0g/L時，菌體的最高濃度(00660)呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，同時丁二酸的產(chǎn)量也隨之下降。原因可能是鈉離子所造成的高滲環(huán)境對菌株具有一定的毒害作用，抑制了菌體的生長和產(chǎn)酸。在前期研究中，我們也發(fā)iJ^cri朋Zwc/〃ww"cd朋ge""CGMCC1593發(fā)酵過程中，采用NaOH或Na2C03控制發(fā)酵pH時，產(chǎn)酸受到抑制；而采用MgC03緩沖發(fā)酵過程中pH時則效果較好。但是MgC03的價格高，且使用時滅菌不方便，這對發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的工業(yè)化非常不利，所以篩選一株耐鈉離子菌株有重要意義?；蚪M改組技術(shù)是一種新的體內(nèi)分子育種方法。這種技術(shù)是分子定向進化在全基因組水平上的延伸，它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進行優(yōu)化組合?；蚪M改組最大的優(yōu)點就是可以在菌株的基因型和表型的相關(guān)機制不是很清楚的情況下，通過多輪循環(huán)的基因改組就可以迅速將決定某一理想表型的多個甚至十幾個突變基因組合在一起而達(dá)到菌種改進的目的。微生物的環(huán)境耐受性，如耐酸性、抗熱性等表型的基因編碼機制現(xiàn)在尚不完全清楚，直接采用基因工程技術(shù)很難將分散在基因組上的由多個基因控制的性狀進行改造；而傳統(tǒng)誘變的正向突變率很低，改良一個菌種所需的篩選量大，篩選時間長。因此，應(yīng)用基因組改組技術(shù)進行菌種選育，快速獲得具有較強鈉離子耐受性和產(chǎn)酸性能的丁二酸生產(chǎn)菌株，并用其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法具有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較強鈉離子耐受性和產(chǎn)酸性能好的琥珀酸放線桿菌，提供一種該菌株的選育方法及利用該菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案以本實驗室自主篩選的丁二酸產(chǎn)生菌琥珀酸放線桿菌CGMCC1593為出發(fā)菌，對其進行誘變，將篩選得到幾株發(fā)酵性能有改良的突變株作為母本菌株進行基因組改組，選育高產(chǎn)耐鈉菌株，并研究該菌株在流加Na2C03控制發(fā)酵pH條件下厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。一株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的琥珀酸放線桿菌J"/"o&"7/mracc&oge""菌株CGMCC2653。獲得琥珀酸放線桿菌CGMCC2653的基因組改組方法，包括以下步驟a)菌種誘變以琥珀酸放線桿菌CGMCC1593作為出發(fā)菌，將其單細(xì)胞懸浮液分別進行X-射線誘變、紫外線誘變、EMS化學(xué)誘變及NTG誘變，篩選得到產(chǎn)酸和耐鈉離子性能有改良的三株菌株，X-8、UV-17、SE-6和氟乙酸鈉抗性的高產(chǎn)菌株SF-9;b)基因組改組將以上獲得的三株耐鈉突變株和氟乙酸鈉抗性菌株SF-9為親本菌株進行基因組改組，即多母本遞進式原生質(zhì)體融合，將篩選得到的發(fā)酵和耐鈉性能有改良的幾株改良融合子作為下一輪融合的出發(fā)菌株，依次進行多輪融合，最后得到一株耐高濃度鈉離子的高產(chǎn)菌株F3-10。原生質(zhì)體融合采用雙親滅活，即紫外線滅活和熱滅活，作為原生質(zhì)體融合標(biāo)記。琥珀酸放線桿菌CGMCC2653應(yīng)用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。琥珀酸放線桿菌CGMCC2653應(yīng)用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵，單獨使用Na2C03控制發(fā)酵過程pH。分批發(fā)酵過程中，Na2CCV濃度為3mol/L，控制pH5.56.5。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為糖4075g/L，酵母膏或/和CSL(最好用中文表示)1020g/L，接種量5%~10%;接種后通100%CO235min;發(fā)酵溫度3040'C;攪拌轉(zhuǎn)速60200r/min。糖為葡萄糖、麥芽糖、木糖、玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖漿、工業(yè)制糖廢糖蜜、農(nóng)作物秸稈木質(zhì)纖維素水解糖漿、菊芋糖漿或甜高梁秸桿糖漿的一種或多種。以下是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述。厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的菌種的選育包括以下步驟第一步出發(fā)菌株的誘變以琥珀酸放線桿菌^c/^o6ac/〃Mracc/朋ge""CGMCC1593為出發(fā)菌，將菌齡5~10h的單細(xì)胞懸浮液分別進行X-射線誘變、紫外線誘變、EMS和NTG化學(xué)誘變處理，采用含0.61.0mol/LNaCl的高濃度鈉離子平板和50100mmol/L氟乙酸鈉平板進行初篩，然后經(jīng)含0.20.6mol/LNaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵復(fù)篩，分別獲得鈉離子耐受性較好、或具有氟乙酸抗性、有較高琥珀酸產(chǎn)量的菌株X-8、UV-17、SE-6和SF-9，將這幾株菌作為基因組改組的出發(fā)菌株第二步基因組改組將步驟一中篩選得到的幾株改良菌株采用原生質(zhì)體雙親滅活標(biāo)記進行多母本原生質(zhì)體融合，將獲得的改良融合子作為下一輪融合的出發(fā)菌株，按照同樣的策略進行融合，經(jīng)過三輪融合，最后篩選得到一株耐高濃度鈉離子的高產(chǎn)菌株F3-10。其中步驟一中采用菌齡510h的菌體進行誘變處理，X-射線誘變照射時間2040min;紫外誘變照射時間2060s;EMS誘變處理濃度為1.0。/。2.0。/。，處理時間為2030min。步驟二中原生質(zhì)體制備時采用菌齡為5~10h的菌體，溶菌酶濃度為0.1-1.0mg/mL,30~40。C酶解1030min，滲透壓穩(wěn)定劑為0.3-0.5mol/L的蔗糖。原生質(zhì)體滅活標(biāo)記條件為紫外滅活510min，5055'C熱滅活15~35min，原生質(zhì)體滅活率均達(dá)100%。原生質(zhì)體融合時采用濃度為20%~40%的PEG6000為助融劑，融合溫度為30~40°C，融合時間25min，此時融合率達(dá)2.78x10—5。選育菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸種子培養(yǎng)葡萄糖510g/L，酵母膏510g/L，K2HPCV3H2020.3g/L，NaH2P04'2H209.6g/L，pH自然。121'C高壓蒸汽滅菌15min后加5%己膜濾除菌的1mol/LNaHC03。接種量5%，置于100%(302環(huán)境中3040。C厭氧培養(yǎng)1012h。厭氧瓶發(fā)酵葡萄糖50g/L，酵母膏1020g/L，玉米漿(CSL)10~20g/L，初始pH5.5~6.5，121。C滅菌15min。MgC0330~40g/L，分消方式170。C干熱滅菌1h。將種子培養(yǎng)至對數(shù)期，按5%接種量接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧瓶(培養(yǎng)瓶容積150mL)中進行發(fā)酵，接種量5%,置于100%0)2環(huán)境中3040'C厭氧培養(yǎng)48h。發(fā)酵罐中分批發(fā)酵各種原料以總糖計4075g/L，酵母膏或/和CSL1020g/L，控制發(fā)酵過程pH的中和劑為3mol/LNa2C03。發(fā)酵過程pH控制在5.56.5。接種量50/010%，發(fā)酵溫度3040。C，接種后通100%CO235min。攪拌轉(zhuǎn)速60-200r/min。其中作為發(fā)酵碳源的糖可以是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖等，也可以是玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖漿、工業(yè)制糖廢糖蜜、農(nóng)作物秸稈木質(zhì)纖維素水解糖漿、菊芋糖漿或甜高梁秸桿糖漿等的一種或多種。分析方法將培養(yǎng)液離心，采用高效液相色譜法分析上清液中的丁二酸等代謝產(chǎn)物及糖類物質(zhì)。采用美國Waters高效液相色譜儀，WatersRI檢測器，Breeze色譜工作站。其中，丁二酸，乙酸，乳酸和甲酸等有機酸的測定使用AminexHPX-87H離子色譜柱(300腿x7.8mm,9[im;Bio-RadChemicalDivision,Richmond,Calif，)，流動相8mM硫酸；柱溫55°C;流速0.5ml/min;進樣量10pL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖類含量的測定采用ZobaxNH2氨基柱(250腿x4.6mm,5[mi;Agilent,USA)，流動相75%乙腈；流速1ml/min進樣量10^L。丁二酸的對糖產(chǎn)率定義為每消耗1克還原糖所能產(chǎn)生的丁二酸克數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)表示。糖利用率定義為消耗糖所占投入糖的百分比(對于糖蜜或其他糖漿，所述的糖以總還原糖計算)。生物材料樣品的保藏琥珀酸放線桿菌J"/"oZwd//^wca7oge"^F3-10菌株已于2008年9月1日保存在中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2653。有益效果本發(fā)明以牛瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌v4"/朋6flc7/M^cc/"oge"^CGMCC1593為出發(fā)菌株，分別進行X-射線誘變、紫外線誘變和EMS化學(xué)誘變，篩選得到耐鈉性能有改良的幾株菌株，將其與經(jīng)NTG誘變的具氟乙酸抗性的高產(chǎn)菌株進行多母本基因組改組選育得到的高產(chǎn)、耐鈉、氟乙酸抗性菌株CGMCC2653(g卩F3-10)。突變株F3-10在以玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖漿、甘蔗糖蜜、玉米秸稈水解糖漿、菊芋糖漿和甜高梁桿糖漿為碳源的培養(yǎng)基中，都能進行正常發(fā)酵。該菌株F3-10以甘蔗糖蜜為原料，采用Na2C03控制發(fā)酵pH,在5L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵，48h產(chǎn)丁二酸53.96g/L，對消耗糖產(chǎn)率89.2%，糖利用率94.0%，丁二酸比雜酸為6.58:1，較出發(fā)菌CGMCC1593有顯著提高。本發(fā)明突出的優(yōu)點是利用全基因組改組方法得到優(yōu)良菌株，發(fā)酵特性改善，以低成本的中和劑Na2C03替代MgC03控制丁二酸發(fā)酵過程中pH，對下游提取丁二酸有利，可降低丁二酸生產(chǎn)成本。具體實施例方式以下是琥珀酸放線桿菌改組菌種、該菌種的選育方法及厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的實施例。但本發(fā)明并不限于所列出的幾個實例。實施例l將出發(fā)菌琥珀酸放線桿菌A^o6acZ//^CGMCC1593經(jīng)種子培養(yǎng)5h后，制成菌懸液，分別進行X-射線誘變、紫外線誘變、EMS化學(xué)誘變和NTG誘變，分別進行平板初篩，厭氧瓶發(fā)酵復(fù)篩，各得到一株高產(chǎn)菌株分別為X-8、UV-17、SE-6和SF-9，將它們作為基因組改組的親本出發(fā)菌。各突變菌株與出發(fā)菌在厭氧瓶中發(fā)酵丁二酸的結(jié)果如表l。表1.突變株在厭氧瓶中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2以突變株X-8、UV-17、SE-6和SF-9為親本出發(fā)菌株，進行三輪原生質(zhì)體融合，將各輪改組中的正突變株與出發(fā)菌株CGMCC1593及改組親本菌株X-8、UV-17、SE-6、SF-9分別在不含NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中和含0.2mol/LNaCl的厭氧瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。經(jīng)三輪改組后菌株F3在不含NaCl的厭氧瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時，琥珀酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株CGMCC1593提高36.0。/。左右，而在含0.2mol/LNaCl培養(yǎng)基中發(fā)酵時，F(xiàn)3代中4株突變株琥珀酸產(chǎn)量較出發(fā)菌CGMCC1593提高70.0y。左右。由于本發(fā)明旨在篩選鈉離子耐受性好的菌株，因此在含鈉離子培養(yǎng)基中更能體現(xiàn)其發(fā)酵優(yōu)勢，從而滿足發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸時需要采用流加Na2C03控制發(fā)酵pH的要求。其中發(fā)酵性能最佳的突變株F3-10被選為發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的實驗菌株。此菌株已保存在中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2653。實施例3對突變株F3-10的菌株，并按精編分子生物學(xué)實驗指南的方法提取染色體DNA，以Y1和Y2為正向禾口反向弓l物(Yl:ATTGAACGCTGGCGGCAGGC，Y2:CGGGCGGTGTGTACAAGGCC)，用PCR擴增16SrRNA基因，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行16SrDNA測序(結(jié)果見以下圖表)。通過與出發(fā)菌株CGMCC1593的16SrDNA基因序列(Genbank)進行比對發(fā)現(xiàn)，基因組改組突變株F3-10與出發(fā)菌株CGMCC1593的16SrDNA基因序列幾乎沒有發(fā)生變化，僅在393bp和1200bp處有兩個點突變(方框表示)，分別為G—A，C—T。以下是突變株F3-10的16SrDNA序列長度為1289bp的片段。361GTTGTAAAGTTCTTTCGGTGGTGAGGAAGGCG0ATAAGTTAACAGCTTATTCGATTGACG1261TCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC其組成為25.6%A;21.3%C;32.5%G;20.6%T實施例4用CGMCC2653發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸種子培養(yǎng)葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L,K2HP(V3H2020.3g/L，NaH2P04'2H209.6g/L,pH自然。121。C高壓蒸汽滅菌15min后加5%己膜濾除菌的1mol/LNaHC03。接種量5%，置于100%CO2環(huán)境中37'C厭氧培養(yǎng)12h。發(fā)酵罐中厭氧分批發(fā)酵葡萄糖40g/L，酵母膏10g/L，CSL10g/L。將突變株CGMCC2653在5L攪拌發(fā)酵罐(NewBrunswich110，NewBrunswickScientific,Edison,NJ，USA)中進行分批發(fā)酵。接種量5%，發(fā)酵溫度37。C，用3mol/LNa2C03流加控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣為100%0)2。隔時取樣進行發(fā)酵液分析。發(fā)酵40h,結(jié)果如表2:表2.突變株CGMCC2653在5L罐中以40g/L葡萄糖為碳源發(fā)酵丁二酸發(fā)酵時間(h)OD660殘?zhí)?g/L)丁二酸fe/L)乙酸fe/L)甲酸fe/L)00.2038.60,320.120.1040,3538.00.450.220.1181.3736.61.280,590.20124,0530.74.511.120.82165.5627.86.771.391.05205.7922.711.91.961.35245.2215.319.02.361.85283.1111.122.92.88L92321.859.224.73.101.78361.327.226.93.281.60401.225.628.03.051.42441.094.829.33,341.69481.243.929.83.421.489"T"GGaGGGcAgGTSAcGMcgTTGHTcGGGcAAAcGATAc、AcAA￡cTaGTcGAAATTGcGGTAcAcGccbcAGGKAGTGw了GcGGGAGcTATTTGGTGAcGAGGTGGcGAAcccccGGGGGcAGTAAGTAAAccAAAGTGAGGcAAGAGAGGccTAAGAcccTAcAGTTccAccATccAAGAAGccAAcAGGGTAGAGAGTAcGAccGTGTrccATcccAAccGAGcAAccccGAATTGGGAcTAcTGAAcGcAGAGGGGGGAAGGAGGccAAAAGTGGccGTccGAGGAAAccAiiiccAGcGccAAAAcAGGTGAGGTArGccAGAcAA:GGTAAcGASGXcGScMcMcGAAGKGw「JMGGAGcATGAGGLGcGcAcGGcGG284o677899注Oh為接種后實測發(fā)酵液糖濃度，投入糖濃度以O(shè)h實測值計算(下同)。由表2可以看出，發(fā)酵過程中突變株CGMCC2653在以40g/L葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，產(chǎn)琥珀酸29.8g/L，殘?zhí)?.9g/L。經(jīng)計算丁二酸產(chǎn)率85.9%，糖利用率89.9%，丁二酸與雜酸比例為6.08:1。實施例5按照實施例4的方法，將突變株CGMCC2653在5L攪拌發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，以40g/L麥芽糖糖漿為碳源，流加3mol/LNa2C03控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。每隔4h取樣進行發(fā)酵液分析。發(fā)酵48h，結(jié)果如表3:表3.突變株CGMCC2653在5L罐中以40g/L麥芽糖糖漿為碳源發(fā)酵丁二酸<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表3可以看出，發(fā)酵過程中突變株CGMCC2653在以40g/L麥芽糖糖漿為碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，產(chǎn)琥珀酸34.9g/L，殘?zhí)?.2g/L。經(jīng)計算丁二酸產(chǎn)率97.2%，糖利用率94.2%，丁二酸與雜酸比例為4.26:1。實施例6按照實施例4的方法，將突變株CGMCC2653在5L攪拌發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，以甘蔗糖蜜為碳源(總糖55g/L)，流力口3mol/LNa2C03控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。隔時取樣進行發(fā)酵液分析，發(fā)酵48h，結(jié)果如表4:表4.突變株CGMCC2653在5L罐中以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表4可以看出，突變株CGMCC2653在以總糖55g/L的甘蔗糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中生長延遲期縮短，4h達(dá)到最高菌濃；發(fā)酵48h，產(chǎn)琥珀酸40.6g/L，殘?zhí)?0.4g/L。經(jīng)計算丁二酸產(chǎn)率91.6%，糖利用率81.0%，丁二酸與雜酸比例為5.67:1。實施例7由于酵母膏價格昂貴，在培養(yǎng)基中添加酵母膏嚴(yán)重提高了琥珀酸生產(chǎn)成本，且不利于下游提取，因此不利于琥珀酸工業(yè)化生產(chǎn)。按照實施例4的方法，將突變株CGMCC2653在5L攪拌發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，以甘蔗糖蜜為碳源，培養(yǎng)基中不添加酵母膏發(fā)酵，力口CSL20g/L，流加3mol/LNa2C03控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。隔時取樣進行發(fā)酵液分析，發(fā)酵48h，結(jié)果如表5:表5.突變株CGMCC2653以甘蔗糖蜜為碳源不加酵母膏發(fā)酵丁二酸(5L罐)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表5可以看出用總糖55g/L的甘蔗糖蜜發(fā)酵48h，產(chǎn)琥珀酸36.5g/L，較添加10g/L酵母膏時(40.6g/L，表5)略有降低，殘?zhí)?5.6g/L。經(jīng)計算丁二酸產(chǎn)率95.5%，糖利用率71.0%，丁二酸與雜酸比例為6.14:1。實施例8按照實施例4的方法，將突變株CGMCC2653和出發(fā)菌株CGMCC159在5L攪拌發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵對照，以甘蔗糖蜜為碳源，初始總還原糖濃度為35g/L，當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)墙禐?5g/L時，用蠕動泵以一定速度流加總還原糖濃度為200g/L的甘蔗糖蜜溶液將發(fā)酵液中的糖濃度控制在1020g/L，用流加3mol/LNa2C03方法控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。每隔4h取樣進行發(fā)酵液分析。發(fā)酵48h，結(jié)果如表6，表7:表6.菌株CGMCC1593在5L罐中以甘蔗糖蜜為碳源補料分批發(fā)酵丁二酸<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5L攪拌罐補料分批發(fā)酵，48h總投入甘蔗糖蜜按最終體積計還原糖濃度為60.52g/L，發(fā)酵剩余還原糖濃度為6.54g/L，產(chǎn)丁二酸41.56g/L，對消耗糖產(chǎn)率77.0%，糖利用率89.2%，丁二酸與雜酸比為3.74:1。表7.突變株CGMCC2653在5L罐中以甘蔗糖蜜為碳源補料分批發(fā)酵丁二酸<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5L攪拌罐補料分批發(fā)酵，48h總投入甘蔗糖蜜按最終體積計還原糖濃度為64.38g/L，發(fā)酵剩余還原糖濃度為3.86g/L,產(chǎn)丁二酸53.96g/L，對消耗糖產(chǎn)率89.2%，糖利用率94.0%，丁二酸比雜酸為6.58:1。。實施例9~17按照實施例4的方法，用突變株CGMCC2653在5L攪拌發(fā)酵罐中分別以玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖漿、甘蔗糖蜜、玉米秸稈水解糖漿、菊芋糖漿和甜高梁桿糖漿為碳源，進行發(fā)酵，流加3mol/LNa2CCb控制發(fā)酵pH，維持pH6.26.5。發(fā)酵48h，結(jié)果如表8:表8.突變株CGMCC2653在5L罐中以不同碳源原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表8可以看出，突變株CGMCC2653在以玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖槳、甘蔗糖蜜、玉米秸稈水解糖漿、菊芋糖漿和甜高梁桿糖漿為碳源的培養(yǎng)基中，都能進行正常發(fā)酵。權(quán)利要求1.一株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes菌株CGMCC2653。2.獲得權(quán)利要求1所述的琥珀酸放線桿菌CGMCC2653的基因組改組方法，包括以下步驟a)菌種誘變以琥珀酸放線桿菌CGMCC1593作為出發(fā)菌，將其單細(xì)胞懸浮液分別進行X-射線誘變、紫外線誘變、EMS化學(xué)誘變及NTG誘變，篩選得到產(chǎn)酸和耐鈉離子性能有改良的三株菌株，X-8、UV-17、SE-6和氟乙酸抗性的高產(chǎn)菌株SF-9;b)基因組改組將以上獲得的三株耐鈉突變株和氟乙酸抗性菌株SF-9為親本菌株進行基因組改組，即多母本遞進式原生質(zhì)體融合，將篩選得到的發(fā)酵和耐鈉性能有改良的幾株改良融合子作為下一輪融合的出發(fā)菌株，依次進行多輪融合，最后得到一株耐高濃度鈉離子的高產(chǎn)菌株F3-10。3.權(quán)利要求2所述的基因組改組方法，其特征在于，原生質(zhì)體融合釆用雙親滅活，即紫外線滅活和熱滅活，作為原生質(zhì)體融合標(biāo)記。4.權(quán)利要求l所述的琥珀酸放線桿菌CGMCC2653應(yīng)用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)5.權(quán)利^求4所述應(yīng)用的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵，單獨使用Na2C03控制發(fā)酵過程pH。6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為糖濃度4075g/L，酵母膏或/和玉米漿1020g/L，接種量5%10%;接種后通100%CO235min;發(fā)酵溫度30~40°C;攪拌轉(zhuǎn)速60~200r/min。7.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征在于，分批發(fā)酵控制過程中，采用3mol/LNa2C03為pH的中和劑，控制pH5.56.5。8.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的糖為葡萄糖、麥芽糖、木糖、玉米淀粉水解糖漿、木薯淀粉水解糖漿、工業(yè)制糖廢糖蜜、農(nóng)作物秸稈木質(zhì)纖維素水解糖漿、菊芋糖漿或甜高梁秸桿糖漿的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一株具有較強鈉離子耐受性和產(chǎn)酸性能的琥珀酸放線桿菌ActinobacillussuccinogenesCGMCC2653(即F3-10)，該菌株的選育方法及用其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。以琥珀酸放線桿菌CGMCC1593作為出發(fā)菌株，分別對其進行X-射線、紫外線誘變和硫酸二乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變，篩選得到具有改良的發(fā)酵產(chǎn)酸性能，特別是鈉離子耐受性有改良三株菌株X-8、UV-17、SE-6，和具有氟乙酸抗性的高產(chǎn)菌株SF-9，將它們用基因組改組方法選育得到高產(chǎn)、耐鈉、抗氟乙酸的菌株F3-10。該菌株F3-10以甘蔗糖蜜為原料，采用Na₂CO₃控制發(fā)酵pH，在5L發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵，48h產(chǎn)丁二酸53.96g/L，對消耗糖產(chǎn)率89.2％，糖利用率94.0％，丁二酸比雜酸為6.58∶1，較出發(fā)菌CGMCC1593有顯著提高。文檔編號C12P7/40GK101531972SQ200810146688公開日2009年9月16日申請日期2008年9月5日優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日發(fā)明者曄倪,孫志浩,董晉軍,璞鄭申請人:江南大學(xué)